周麗娜 李東良 潘晨 林春 吳海聰 周曉玲

目前肝移植已被公認為治療終末期肝病最可靠的治療手段之一[1]，但肝移植后黃疸很常見,Hubscher SG等報道在非選擇性肝穿刺病理活檢中高達55%～90%的移植肝都可出現(xiàn)不同程度的肝內(nèi)膽汁淤積[2]，部分患者伴隨不可逆的肝臟損害，甚至可致受體死亡或移植肝無功能，需要再次肝移植[3-5]。且其病因復(fù)雜又可能同時并存，確切發(fā)生機制仍不明確。近期大量膽汁淤積的動物模型研究表明肝細胞毛細膽管膜上的轉(zhuǎn)運蛋白可能與肝內(nèi)膽汁淤積的發(fā)病機制有一定的關(guān)系，但缺乏在人體肝組織中的表達數(shù)據(jù)。本研究主要觀察肝移植術(shù)后黃疸患者肝組織外排轉(zhuǎn)運蛋白BSEP、MRP2和MDR3蛋白的表達變化，試圖探求肝移植術(shù)后黃疸的發(fā)生機制，為其靶向性精準治療提供理論依據(jù)。

資料與方法

一、研究對象

收集2006-2017年南京軍區(qū)福州總醫(yī)院肝移植術(shù)后新發(fā)黃疸并行肝穿刺活組織檢查的患者25例，同時選擇同期行肝血管瘤手術(shù)且肝功正常的患者18例并取其瘤旁正常肝組織。該研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員批準。

二、實驗試劑

蘇木素-伊紅染色液、10%過氧化氫等試劑均為實驗室內(nèi)自配試劑。免疫組化一抗BSEP鼠單克隆抗體BSEP(F-6)：sc-74500(美國Santa Cruz公司1∶200)、MRP2鼠單克隆抗體(英國Abcam 1∶200)、MDR3兔多克隆抗體(英國Abcam 1∶50)二抗EliVisionTM plus 試劑盒、山羊血清封閉液、AEC 顯色和封片劑、0.01 M 檸檬酸-檸檬酸鹽修復(fù)液(pH 6.0)、0.01 MPBS(pH 7.4)、多聚賴氨酸防脫片劑等均購自邁新生物技術(shù)有限公司。

三、實驗方法

所有病例組及對照組標本均使用16G肝穿針，活檢取肝組織標本，經(jīng)40 g/L中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，連續(xù)切片3 μm厚。肝臟標本全部做HE染色、BSEP、MRP2、MDR3免疫組化染色。免疫組化結(jié)果判定采用半定量分析方法：以染色強度結(jié)合陽性細胞數(shù)百分比綜合計分。

四、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、研究對象的基本資料

25例肝移植術(shù)后黃疸的患者中，男性23例(92.0%)，女性2例(8.0%)，平均年齡46.2±12.3歲，發(fā)生肝功異常的時間為96(22,360)天。對照組12例，其中男性11例(61.1%)，女性7例(38.9%)，平均年齡44.7±13.7歲。肝移植組與對照組性別、年齡相比無統(tǒng)計學(xué)差異(χ2=4.721，P=0.094，t=-0.395，P=0.695)?；仡櫺苑治?5例肝移植術(shù)后黃疸的患者的病史資料及肝穿病理結(jié)果，其病因分類主要為肝移植術(shù)后急慢性排斥反應(yīng)15例(39.47%)、缺血再灌注損傷4例(10.53%)、藥物毒物中毒6例(15.79%)、病毒性因素5例(13.16%)、膽管阻塞8例(21.05%)等。

二、肝移植術(shù)后黃疸組與正常對照組生化指標對比

肝移植術(shù)后膽汁淤積組和正常對照組的肝功能指標ALT、AST、ALP、γ-GT、TBil、DBil相比均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.001，表1)。

表1 肝移植膽汁淤積組與正常對照組生化指標Kruskal-Wallis H檢驗

三、肝移植組和對照組肝組織中BSEP、MRP2、MDR3的表達情況

(一)BSEP 正常對照組BSEP呈強陽性表達100%(18/18)，表達于細胞膜，呈棕褐色或棕黃色，著色規(guī)則均一(圖1A、1C)。肝移植術(shù)后黃疸組的表達率降低，強度減弱，在肝細胞膜上呈弱陽性表達，染色淺、著色較細、短且分布較為不均勻，部分稀疏或不表達(圖1B、1D)。

A. 正常對照組肝組織BSEP免疫組化染色(×100); B.肝移植術(shù)后膽汁淤積組BSEP免疫組化染色(×100); C. 正常對照組肝組織BSEP免疫組化染色(×400); D．肝移植術(shù)后膽汁淤積組BSEP免疫組化染色(×400)

顯著性水平P<0.05。正常參考值：ALT：7～40 IU/L；AST：13～35 IU/L；ALP：50～135 IU/L；γ-GT：7～45 IU/L；TBil：0～26 μmol/L；DBil：0～8 μmol/L。

(二)MRP2 正常對照組MRP2呈強陽性表達，表達率100%(18/18)，表達于肝細胞膜，呈棕褐色或棕黃色，分布規(guī)則(圖2E、2G)。肝移植術(shù)后黃疸組MRP2表達強度下降，也主要表達于肝細胞膜上，染色較淡、著色部分較細短、分布較為不均(圖2F、2H)。

A.正常對照組肝組織MRP2免疫組化染色(×100); B. 肝移植術(shù)后膽汁淤積組MRP2免疫組化染色(×100); C. 正常對照組肝組織MRP2免疫組化染色(×400); D. 肝移植術(shù)后膽汁淤積組肝組織MRP2免疫組化染色(×400)

(三)MDR3 正常對照組MDR3呈強陽性表達，表達率100%(18/18)，只表達于肝細胞膜上，呈棕褐色或棕黃色，著色均一(圖3I、3K)。而肝移植術(shù)后黃疸組MDR3表達異常，除了表達強度減弱外，在肝毛細膽管周圍及肝細胞膜附近的細胞質(zhì)也見到表達，甚至部分沿毛細膽管著色加重形成明顯的毛細膽管輪廓，染色強于細胞膜和附近的胞漿(圖3J、3L)。

A.正常對照組肝組織MDR3免疫組化染色(×100); B.正常對照組肝組織MDR3免疫組化染色(×400); C.肝移植術(shù)后膽汁淤積組肝組織MDR3免疫組化染色(×100); D.肝移植術(shù)后膽汁淤積組肝組織MDR3免疫組化染色(×400)

四、BSEP、MRP2、MDR3在不同肝組織中的表達差異

通過半定量分析方法判定免疫組化結(jié)果，然后對其排秩后采用秩和U檢驗比較三種抗體在肝移植組和對照組的表達差異，并對肝移植術(shù)后導(dǎo)致黃疸的各種病因進行分類，分別探討各病因下三種抗體的表達差異。

BSEP在肝移植組肝組織中的表達較正常肝組織的表達下降，差異均存在統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-3.831，P<0.001)，但不同病因所致肝移植術(shù)后黃疸的肝組織中BSEP的表達存在差異。其中，肝移植術(shù)后排斥反應(yīng)、病毒性因素及膽管阻塞等病因所致黃疸的肝組織中BSEP的表達較正常肝組織的表達明顯下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(分別為P<0.001、P=0.002、P=0.035)，而缺血再灌注損傷、藥物毒物所致移植后黃疸較正常組差異不顯著(分別為P=0.189、P=0.081)(表2)。

MRP2在肝移植組和對照組中的表達存在統(tǒng)計學(xué)差異(Z=-2.128，P=0.033)，但在不同病因所致肝移植術(shù)后黃疸的肝組織中的表達不同：除病毒性因素所致肝移植術(shù)后黃疸的肝組織中MRP2的表達較正常肝組織的表達下降外(P=0.012)，肝移植術(shù)后排斥反應(yīng)、缺血再灌注損傷、藥物毒物及膽管阻塞等因素所致肝移植后黃疸的肝組織中MRP2的表達較正常組的差異并無統(tǒng)計學(xué)意義(分別為P=0.059、P=0.145、P=0.480、P=0.074)(表2)。

MDR3在肝移植術(shù)后黃疸的肝組織中的表達較正常肝組織中的表達亦下降，差異存在統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-3.321，P=0.001)。其中，肝移植術(shù)后排斥反應(yīng)(P=0.001)、缺血再灌注損傷(P=0.011)、藥物毒物(P=0.047)及阻塞性因素(P=0.013)所致移植后黃疸的肝組織中MDR3的表達較正常對照組存在統(tǒng)計學(xué)差異，但病毒性因素所致者MDR3的表達較對照組差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.061)(表2)。

表2 BSEP、MRP2、MDR3在不同病因的肝移植術(shù)后黃疸的肝組織中的表達差異

討 論

移植術(shù)后黃疸是肝移植術(shù)后常見的并發(fā)癥之一，其病因復(fù)雜多樣且可能同時存在，目前發(fā)病機制仍不十分明確。近期較多動物研究實驗顯示，膽汁酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白的表達功能異?；虍愇豢赡軐?dǎo)致多種膽汁淤積性肝病的發(fā)生。因此我們通過人肝移植術(shù)后伴有黃疸患者的肝組織標本，觀察BSEP、MRP2和MDR3蛋白的總體表達變化及不同病因?qū)е碌母我浦残g(shù)后黃疸的患者中上述抗體的表達差異。

本研究發(fā)現(xiàn)，BSEP在肝移植術(shù)后黃疸患者的肝組織上表達減弱，半定量計分方法顯示BSEP表達量與正常對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。進一步病因分析發(fā)現(xiàn)，BSEP在肝移植術(shù)后排斥反應(yīng)、病毒性因素及阻塞性病因所致的黃疸患者的肝組織中較正常組均明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。這與大多數(shù)動物實驗中發(fā)現(xiàn)Bsep基因的轉(zhuǎn)錄及蛋白的表達水平明顯下降相一致[6-7]，推測可能是BSEP基因表達水平下降或不足導(dǎo)致膽汁酸在肝細胞內(nèi)蓄積，進而損害到肝細胞膜的生理功能[8]。但在缺血再灌注、藥物毒物中毒所致肝移植術(shù)后黃疸的肝組織上表達較正常對照組下降不明顯。張寶良[9]在大鼠供肝熱缺血損傷的實驗研究中亦發(fā)現(xiàn)在肝移植術(shù)后相同時點不同供肝熱缺血時間的移植組間的BSEP mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達水平無明顯差別。Luigi Accatino等[10]在大鼠肝臟熱缺血再灌注損傷中也未發(fā)現(xiàn)上述該轉(zhuǎn)運蛋白的降低，與本實驗結(jié)果一致。Andreas Geier等[11]發(fā)現(xiàn)四氯化碳致急性毒性肝損傷時，大鼠注射CCl4后24 h、72 h測定小管MRP2和BSEP的mRNA水平?jīng)]有變化。

肝移植術(shù)后黃疸組較正常對照組之間MRP2的表達亦存在統(tǒng)計學(xué)差異，但進一步病因分類后發(fā)現(xiàn)，其僅在病毒性因素所致肝移植術(shù)后黃疸的肝組織中表達下降，而在肝移植術(shù)后排斥反應(yīng)、缺血再灌注損傷、藥物毒物及膽管阻塞等因素所致肝移植后黃疸的肝組織中的表達跟正常組比較并無統(tǒng)計學(xué)意義。Diao[8]、陳凱[12]等研究顯示在受到LPS刺激或ANIT所致的大鼠急性肝損傷膽汁淤積模型中，大鼠肝臟上MRP2 mRNA及蛋白表達水平均逐步下降，但在48 h隨著肝損傷的修復(fù)又恢復(fù)正常，提示MRP2蛋白在膽汁中膽紅素的排泄及對肝臟的保護中具有重要作用。人肝組織中亦有類似發(fā)現(xiàn)：Gernot Zollner等[13]在炎癥誘導(dǎo)的膽汁淤積的人肝組織中MRP2 mRNA的保持不變，柴進等[14]亦發(fā)現(xiàn)人阻塞性膽汁淤積下肝臟MRP2 mRNA無明顯變化。故我們推測部分肝組織中MRP2表達無明顯下降可能是隨著膽汁淤積病程的延長機體為減少肝細胞的損傷而發(fā)生的一種適應(yīng)性反應(yīng)或自我保護機制。

另外，本研究顯示MDR3在肝移植術(shù)后黃疸患者肝組織中的表達較正常對照組相比亦明顯下降。其中，在肝移植術(shù)后排斥反應(yīng)、缺血再灌注損傷、藥物毒物及阻塞性因素所致黃疸患者的肝組織中MDR3的表達量較正常對照組表達明顯下降，而Bernhardt等[15]在Pringle手術(shù)后對低膽紅素血癥組及高膽紅素血癥組肝組織的肝膽轉(zhuǎn)運蛋白MDR3 mRNA表達的影響無統(tǒng)計學(xué)意義，僅略有下降，推測肝移植術(shù)后這些因素可能對肝移植術(shù)后膽汁酸鹽的影響較大，導(dǎo)致MDR3基因表達水平下降更為持久或較難恢復(fù)，從何阻礙磷脂的轉(zhuǎn)運，不能與過高的膽鹽結(jié)合，膽鹽游離，進而引起膽管細胞凋亡或壞死，最終導(dǎo)致肝移植術(shù)后黃疸的發(fā)生。但病毒性因素所致的肝移植術(shù)后黃疸者MDR3的表達較對照組差別無統(tǒng)計學(xué)意義。

綜上，肝移植術(shù)后黃疸患者肝組織中膽汁酸外排轉(zhuǎn)運蛋白BSEP、MRP2、MDR3蛋白的表達均下調(diào)，提示其可能在肝移植術(shù)后膽汁淤積的發(fā)病機制中起著重要的作用。但不同病因所致者黃疸者肝組織中轉(zhuǎn)運蛋白的表達水平存在著差別，某些轉(zhuǎn)運蛋白表達相對保留可能是機體為減輕膽汁鹽潴留造成的肝臟損而發(fā)生的一種適應(yīng)性反應(yīng)。