周霞 湯汝佳 賀希 高銀杰 姚紅 劉振文 王洪波 劉鴻凌

各種原因引起的重癥肝病、肝衰竭、肝癌在臨床上十分常見，一般內(nèi)科療法難以逆轉(zhuǎn)病情，大多數(shù)患者預(yù)后差，病死率高達(dá)50%以上[1]。肝移植是治療終末期肝病的有效手段[2-3]。而移植后存活質(zhì)量提高的關(guān)鍵是合理使用免疫抑制劑。以他克莫司(Tacrolimus, Tac)為代表的鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑免疫活性強(qiáng)，已作為基礎(chǔ)免疫抑制劑廣泛應(yīng)用于器官移植患者[1,3]。但由于其治療窗窄，個(gè)體差異較大，移植器官排異或藥物引起的相關(guān)毒性反應(yīng)也時(shí)常發(fā)生[4, 5]。隨著藥物基因組學(xué)的發(fā)展，對(duì)于編碼藥物代謝酶、藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體和藥物作用靶點(diǎn)的基因序列的多態(tài)性研究, 越來越受到重視[2-4]。本研究通過檢測(cè)肝移植術(shù)后患者的細(xì)胞色素P450(Cytochrome P450，CYP)酶的基因多態(tài)性，根據(jù)CYP特點(diǎn)針對(duì)性使用免疫抑制劑，觀察其臨床效果和移植術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生情況。

資料與方法

一、研究對(duì)象

選擇2016年4月至2019年3月在解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心接受異體原位肝移植術(shù)并存活超過1個(gè)月、年齡18～65歲、簽署知情同意書患者共146例。術(shù)后免疫抑制治療方案均采用Tac+嗎替麥考酚酯(Mycophenolate mofetil, MMF)+糖皮質(zhì)激素三聯(lián)治療，除外伴有嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病，包括未被控制的心、肺、腎、消化、神經(jīng)、精神疾病、免疫性疾病、代謝性疾病或惡性腫瘤等。

二、病例分組與樣本采集

將患者隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組73例，按照CYP特點(diǎn)及FK506濃度調(diào)整他克莫司劑量；對(duì)照組73例，按照FK506濃度調(diào)整他克莫司劑量。比較兩組患者術(shù)后1、3、6、12個(gè)月時(shí)的Tac的谷濃度(C0)、劑量(每天每人的用藥量Dose，D)、濃度/劑量(C0/D)、肌酐水平。

服藥前30 min空腹采集患者靜脈血3 mL，全血密閉保存于含乙二胺四乙酸(EDTA)的抗凝管中，用于血藥濃度測(cè)定。另取EDTA抗凝全血5 mL，于-80℃冰箱內(nèi)保存，用于測(cè)序檢查。

三、FK506谷濃度檢測(cè)

FK506谷濃度采用全自動(dòng)微粒酵素免疫定量分析法檢測(cè)，術(shù)后前3個(gè)月的有效濃度目標(biāo)范圍為7～9 μg/L。術(shù)后1周內(nèi)每天檢測(cè)，以后每周1次，后逐步延長時(shí)間。

四、血清CYP 3A4和CYP 3A5水平檢測(cè)

利用DNA提取試劑盒提取實(shí)驗(yàn)組患者標(biāo)本DNA，由北京索真公司負(fù)責(zé)目標(biāo)片段的PCR擴(kuò)增測(cè)序分析。引物設(shè)計(jì)如下：CYP3A4(rs2740574)：正鏈5′-GGCTCTGTCTGTCTGGGTTTGG-3′和反鏈5′-GCTCTTTGCTGGGCTATGTGC-3′。CYP3A5(rs776746)：正鏈5′-CCTCAGAATCCACAGCGC-TGAC-3′和反鏈5′-CCTAGTTGTACGACACAC-AGCAACC -3′。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、患者的一般情況

實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組患者均為73例，年齡分別為(51.4±9.0)歲和(52.2±9.4)歲，男/女比均為62/11。主要病因?yàn)镠BV感染(49/73比50/73)和肝硬化失代償(66/73比57/73)；平均移植時(shí)間為(28.24±5.92)比(29.15±7.9)個(gè)月。兩組間患者的年齡、疾病組成、移植時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)組內(nèi)A/G、G/G、A/A亞組分別有35、33、5例患者，年齡分別為(52.6±10)、( 51.2±9.5)歲和(55.2±4.3)歲，平均移植時(shí)間為(26.89±8.83)、(32.18±6.64)和(25±6.12)個(gè)月，組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、CYP3A4、CYP3A5基因型分布

實(shí)驗(yàn)組73例進(jìn)行CYP3A4*1B(rs2740574)位置的檢測(cè)，均為AA型野生株；CYP3A5*3 (rs776746)位檢測(cè)分型，其中G/G突變 33例，占43.4%，A/G野生株 35例，占46.1%，A/A 突變5例，占6.6%。

三、各基因型肝移植受者術(shù)后TacC0、D和C0/D的關(guān)系

實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在移植術(shù)后1、3、6和12個(gè)月他克莫司給藥量、濃度以及C0/D差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。含CYP3A5 rs776746位G/G突變的患者在術(shù)后1、3、6和12個(gè)月他克莫司給藥劑量明顯低于未突變患者，而C0/D明顯高于未突變患者，見表1。但FK506濃度沒有明顯的差異。其中移植患者術(shù)后3個(gè)月、12個(gè)月的C0/D與年齡有關(guān)(r=-0.173，P=0.036；r=-0.172，P=0.041)。

表1 不同時(shí)期各基因型他克莫司D、C0和C0/D比值變化(±s)

四、不同基因型患者中他克莫司對(duì)血肌酐的影響

移植術(shù)后1、3、6和12個(gè)月血肌酐水平在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組患者間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在G/G和A/G基因型患者間也無明顯差異，見表2。術(shù)后12個(gè)月的血清肌酐水平和年齡相關(guān)(r=0.172，P=0.04)，女性患者22例，血肌酐水平明顯低于男性患者[術(shù)后1月：(64.55±20.77)比(81.22±21.43)μmol/L，t=3.378，P=0.001]。

表2 肝移植患者他克莫司對(duì)血清肌酐水平的影響(μmol/L，±s)

五、兩組患者并發(fā)癥及預(yù)后分析

實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組患者的急性排斥反應(yīng)(ACR)、感染及死亡均沒有明顯差異，見表3。實(shí)驗(yàn)組中G/G變異患者感染的發(fā)病率明顯高于未變異患者(χ2=7.066,P=0.008)，也高于對(duì)照組(χ2=0.863,P=0.353)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 肝移植患者并發(fā)癥及預(yù)后分析(例)

討 論

目前肝移植術(shù)后患者使用最多的免疫抑制劑為他克莫司，由于其藥代動(dòng)力學(xué)及藥效動(dòng)力學(xué)參數(shù)個(gè)體差異大，有效劑量和中毒劑量相近，移植器官排異或藥物引起毒性作用也經(jīng)常發(fā)生。他克莫司代謝和清除主要通過CYP3A酶，特別是CYP3A4和CYP3A5[6-7]。CYP3A4*1B(rs2740574)位點(diǎn)備受關(guān)注，CYP3A4啟動(dòng)子區(qū)-392位A/G的轉(zhuǎn)換，可改變CYP3A4轉(zhuǎn)錄活性和體內(nèi)氧化活性，對(duì)他克莫司的藥代動(dòng)力學(xué)可能存在獨(dú)立影響[8-11]。但在中國人群中，該突變率小于0.2%[12]，在本研究中并未檢出，故國外藥物劑量研究在中國人群中需要進(jìn)一步分析和細(xì)化，該位點(diǎn)在中國人群中的差異較小，影響有限。

CYP3A5有9個(gè)等位基因，目前研究最多的是CYP3A5*3和CYP3A5*1，CYP3A5*3(rs776746)A/G突變，可導(dǎo)致mRNA可變剪接和蛋白質(zhì)截短，從而降低CYP3A5酶的活性，影響他克莫司代謝，被推薦用于調(diào)整其初始給藥劑量及在移植患者中的個(gè)體化用藥[10, 11]。本研究中野生型占46.1%，與文獻(xiàn)報(bào)道比例相近[12]。在FK506濃度無明顯差異情況下，G/G突變患者他克莫司給藥劑量較低，但C0/D明顯高于未突變者，感染發(fā)病率亦明顯高于未突變組。因此，建議存在CYP3A5*3(rs2242480)突變者在接受他克莫司治療時(shí)，目標(biāo)濃度設(shè)定應(yīng)低于未變突變?nèi)巳海蓽p少感染風(fēng)險(xiǎn)，用低于常規(guī)劑量他克莫司去達(dá)到免疫抑制目標(biāo)。日本學(xué)者等研究也提示未變異組使用的他克莫司劑量高于變異組[13-14]。

在本研究中，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組間患者的FK506濃度、臨床并發(fā)癥及預(yù)后無顯著差異，證明FK506濃度仍是一個(gè)可靠的調(diào)藥依據(jù)。同時(shí)也說明，雖然參考CYP多態(tài)性降低了突變患者他克莫司給藥劑量，但仍把FK506谷濃度作為最終衡量用藥手段，所以CYP突變患者的藥物濃度和未突變者無明顯區(qū)別，導(dǎo)致突變患者過高的感染率，后期研究應(yīng)進(jìn)一步降低其目標(biāo)濃度。在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，CYP突變和野生型患者間排斥反應(yīng)和腎損傷沒有明顯差異，但年齡和性別對(duì)血清肌酐水平有一定影響。本研究涉及CYP3A5和CYP3A4位點(diǎn)較少，其他位點(diǎn)多態(tài)性也可造成影響[15]。有研究顯示，CYP3A5非表達(dá)子可能在腎移植后早期，通過升高血清IL-6濃度而暫時(shí)降低他克莫司清除率[14]。馬多玲等[15]發(fā)現(xiàn)ABCBl C1236T基因多態(tài)性影響穩(wěn)定期CYP3A5*3/*3腎移植受者的他克莫司濃度，ABCBl G(A)2677T和C3435T基因多態(tài)性影響受體的腎功能。

綜上所述，如果根據(jù)CYP3A特點(diǎn)和臨床經(jīng)驗(yàn)，優(yōu)化他克莫司初次給藥劑量，可能減少受體的相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生，從而提高肝移植患者的長期生存質(zhì)量。