張明躍 曹明 王凱翔 陳浩
乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。在2017年,Lok[1]發(fā)表在《Journal of Hepatology》中的一篇review中指出,在接受核苷(酸)類藥物(NA)治療的患者中,當(dāng) HBV DNA 檢測(cè)不到時(shí),可以檢測(cè)血清中的 HBV-pgRNA 用來(lái)推斷 cccDNA 是否進(jìn)行轉(zhuǎn)錄,推測(cè)血清HBV-pgRNA可作為 cccDNA 轉(zhuǎn)錄活性的有效替代標(biāo)志物。本文通過(guò)使用北京熱景生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)的HBV-pgRNA測(cè)定試劑盒對(duì)來(lái)源于保定傳染病醫(yī)院的臨床血清樣本中的RNA進(jìn)行測(cè)試,從而分析該指標(biāo)與其他血清學(xué)指標(biāo)之間的相關(guān)性。
(一)樣本來(lái)源 樣本來(lái)源于保定傳染病醫(yī)院,共計(jì)332例,已知HBV DNA背景陽(yáng)性167例,陰性165例;HBV-LP背景陽(yáng)性191例,陰性141例;HBsAg背景陽(yáng)性289例,陰性43例;HBsAb背景陽(yáng)性67例,陰性265例;HBeAg背景陽(yáng)性95例,陰性237例;HBeAb背景陽(yáng)性189例,陰性143例;HBcAb背景陽(yáng)性325例,陰性7例。在如上慢性乙型肝炎臨床樣本中男性202例,女性130例;年齡2~91歲,平均年齡44.5歲。
(二)試劑以及耗材 ①HBV-pgRNA測(cè)定試劑盒:北京熱景生物技術(shù)股份有限公司;②磁力架:蘇州海貍生物技術(shù)有限公司。
(三)主要設(shè)備 ①ABI 7500T ImePCR:Applied Biosystems;②振蕩混勻器:大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器(北京)股份公司;③微型離心機(jī):杭州米歐儀器有限公司。
(一)檢測(cè)方法 HBV-pgRNA采用PCR-熒光探針法,測(cè)定試劑盒以HBV-pgRNA拷貝數(shù) ≥300 copies/mL作為HBV-pgRNA陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn),且所有的操作嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書的要求對(duì)標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè) 。
(二) 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用GraphPad軟件對(duì)HBV-DNA、HBV-pgRNA、HBV-LP三者之間的相關(guān)性進(jìn)行分析;在HBeAg陽(yáng)性和陰性患者中,對(duì)HBV-DNA、HBV-pgRNA以及HBV-LP的平均水平進(jìn)行分析,以及對(duì)HBV-pgRNA與HBsAg和HBcAb的相關(guān)性進(jìn)行分析。
通過(guò)GraphPad相關(guān)性統(tǒng)計(jì)學(xué)分析證實(shí),在332例乙型肝炎病毒感染患者樣本的測(cè)試中,血清HBV-pgRNA與HBV-DNA均具有較強(qiáng)的相關(guān)性,且呈正相關(guān);而血清HBV-DNA與HBV-LP以及血清HBV-pgRNA與HBV-LP具有相對(duì)較弱的相關(guān)性。
對(duì)332例乙型肝炎病毒感染患者樣本的檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,按照HBeAg狀態(tài)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),當(dāng)乙型肝炎病毒感染患者的HBeAg呈陽(yáng)性時(shí),其血清HBV-DNA以及HBV-pgRNA的平均含量均處于較高水平,而血清HBV-LP的含量相對(duì)較低,三者的檢出率接近;當(dāng)乙型肝炎病毒感染患者的HBeAg呈陰性時(shí),HBV-pgRNA的平均含量與HBV-DNA的平均含量接近,但其檢出率遠(yuǎn)高于HBV-DNA的檢出率。
圖1 HBV-DNA與HBV-pgRNA的相關(guān)性
圖2 HBV-DNA與HBV-LP的相關(guān)性
圖3 HBV-pgRNA與HBV-LP的相關(guān)性
對(duì)101例乙型肝炎病毒感染患者樣本的檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,按照HBeAg狀態(tài)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),血清HBV-pgRNA在HBeAg陽(yáng)性的HBV感染者中與HBsAg具有相關(guān)性,但在HBeAg陰性HBV感染者中與HBsAg的相關(guān)性較弱。
通過(guò)GraphPad相關(guān)性分析證實(shí),血清HBcAb與HBV-pgRNA在157例乙型肝炎病毒感染患者的測(cè)試中相關(guān)性較弱。
圖4 HBV-pgRNA與HBcAb的相關(guān)性
對(duì)于血清中檢測(cè)出HBV-pgRNA的情況,Kock 1996年發(fā)表在《Hepatology》上的文獻(xiàn)中就指出,在慢性HBV感染的血液中檢測(cè)到了RNA[2]。2016年,Jansen[3]認(rèn)為在接受抗病毒治療的慢性乙型肝炎患者血清中發(fā)現(xiàn)HBV-pgRNA水平與患者病毒學(xué)應(yīng)答和預(yù)后有關(guān)。2018年11月,美國(guó)食品藥品管理局(FDA)上公布的《Chronic Hepatitis B Virus Infection Developing Drugs for Treatment》中指出,HBV-pgRNA可以作為早期臨床試驗(yàn)中研究一些探索性的療效終點(diǎn)的指標(biāo)之一[4]。乙型肝炎臨床診斷及檢測(cè)新型試劑課題組在研究中證實(shí),血清中的HBV-pgRNA為前基因組RNA(pregenomic RNA,pgRNA),其來(lái)源為核衣殼包裹的pgRNA 在未啟動(dòng)逆轉(zhuǎn)錄步驟的情況下,直接獲得包膜并從感染的肝細(xì)胞中釋放出來(lái)。因該病毒顆粒所含的核酸為pgRNA,故稱之為“HBV-pgRNA 病毒樣顆?!盵5]。與HBsAg不同的是,由于HBV基因組全長(zhǎng)為3.2 kb,3.5 kb長(zhǎng)的HBV pgRNA只能由cccDNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生,而不可能來(lái)自整合的HBV基因片段,所以理論上血清中HBV-pgRNA病毒樣顆粒的檢測(cè)更能反映肝細(xì)胞內(nèi)cccDNA的狀態(tài)[6](包括cccDNA存在與否及其轉(zhuǎn)錄活性)。同時(shí),血清 HBV-pgRNA 僅來(lái)源于 cccDNA 且不直接被核苷(酸)類藥物影響,被認(rèn)為是一個(gè)理想的反映肝組織 cccDNA 的活性血清替代指標(biāo),這在魯鳳民[7]教授團(tuán)隊(duì)的最新研究成果中得到了證實(shí)。另外,魯教授在研究成果中也認(rèn)為檢測(cè)血清中 pgRNA 病毒顆粒可以反映出患者肝細(xì)胞內(nèi) cccDNA的轉(zhuǎn)錄活性,并且在用NA治療的病例中,血清 HBV-pgRNA 持續(xù)低于檢測(cè)下限可用作預(yù)測(cè)標(biāo)記物,以指導(dǎo)NA治療的安全停藥[8]。
在本研究的332例樣本中,HBV-DNA與HBV-pgRNA具有較強(qiáng)的相關(guān)性,且呈正相關(guān),血清HBcAb與HBV-pgRNA、HBV-DNA與HBV-LP以及HBV-pgRNA與HBV-LP具有相對(duì)較弱的相關(guān)性,在HBeAg陽(yáng)性的乙肝患者中,HBV-DNA與HBV-pgRNA在患者體內(nèi)均處于較高的水平,而在HBeAg陰性的乙肝患者中,HBV-pgRNA的含量要高于HBV-DNA的含量。
因此,定量檢測(cè)血清HBV-pgRNA的水平可作為其他血清學(xué)檢測(cè)項(xiàng)目的輔助檢測(cè)手段,指導(dǎo)治療乙型肝炎病毒感染的安全停藥點(diǎn)。