吳宏楷 鄧浩輝 龔明星 高洪波 王戰(zhàn)會 于樂成

核苷(酸)類似物(nucleoside/nucleotide analogues，NUCs)是目前慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者的主要抗病毒治療藥物[1]，但HBeAg陽性CHB患者在NUCs連續(xù)治療2～3年后，大約只有20%～30%的患者得以實現(xiàn)HBeAg血清學轉(zhuǎn)換[2-3]。對CHB患者的研究發(fā)現(xiàn)，恩替卡韋(ETV)和替比夫定(LdT)等NUCs治療可以有效抑制病毒復制，改善肝臟炎癥[1]；對外周血單個核細胞(PBMC)的研究表明，NUCs治療可部分恢復T細胞的免疫功能[4-6]。

T細胞通過其表面抗原識別受體(T cell receptor，TCR)識別抗原表位，實現(xiàn)T細胞激活和克隆增殖。TCR互補決定區(qū)3(complementarity determining region，CDR3)由V、D、J三個基因片段共同編碼而成，可以特異性結(jié)合抗原肽，具有高度多樣性，形成了龐大的TCR文庫[7]。我們前期通過對CHB患者NUCs治療前后外周血中TCR文庫的動態(tài)研究，發(fā)現(xiàn)T細胞克隆變化與HBeAg血清學轉(zhuǎn)換相關(guān)[5, 8]，提示T細胞對于CHB患者NUCs治療應答有著重要作用。但是，外周血中T淋巴細胞僅為全身T細胞總數(shù)的2%～2.5%[9]，不能完全代表肝臟內(nèi)T細胞的組成和變化[10-11]。同時，在肝癌患者的研究中發(fā)現(xiàn)，肝內(nèi)T細胞可以更加精準地反映局部T細胞免疫應答[12]， 并且在多種腫瘤中已經(jīng)證實，受局部微環(huán)境影響的腫瘤浸潤T細胞可以更好地輔助腫瘤評估[13]。但是目前缺少對于CHB患者肝內(nèi)TCR文庫的研究，也無NUCs治療前后肝內(nèi)TCR文庫動態(tài)變化的分析，為此我們對這一問題進行了研究。既往對CHB患者LdT和ETV治療前后外周血中TCR文庫的動態(tài)研究顯示，不同NUCs治療前后外周血中TCR文庫均有類似變化趨勢[5, 8]。本研究擬進一步對NUCs治療前后肝組織中TCR文庫的動態(tài)變化進行觀察。因暫缺ETV、替諾福韋酯(TDF)和丙酚替諾福韋(TAF)治療前后的肝穿刺組織，故以經(jīng)LdT治療的CHB患者的肝活檢組織進行研究。

資料與方法

一、一般資料

本研究共納入10例CHB患者，均符合《慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)》[14]診斷標準，滿足HBsAg持續(xù)陽性至少6個月； HBV DNA>100 000拷貝/mL；12個月內(nèi)未接受過干擾素或NUCs抗病毒治療，排除合并感染丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒或人免疫缺陷病毒。所有患者均完成104周基于LdT的抗病毒治療方案，其中部分患者在36周加用阿德福韋酯(ADV)。

根據(jù)治療104周HBeAg狀態(tài)以及HBV DNA定量，將患者分為2組，每組各5例。HBeAg轉(zhuǎn)換組(seroconversion，SR組)是指治療104周發(fā)生HBeAg血清學轉(zhuǎn)換且HBV DNA<300 拷貝/mL；HBeAg非轉(zhuǎn)換組(non seroconversion，NSR組)是指治療104周時HBV DNA下降但HBeAg持續(xù)陽性。

二、肝組織RNA提取與TCR文庫構(gòu)建

每例患者于治療基線及治療104周分別行肝穿刺活檢并收集標本，用TRIzol法提取組織中總RNA，通過cDNA 5′末端快速擴增技術(shù)(5′RACE)逆轉(zhuǎn)錄TCRβ鏈基因全長序列，并進行巢式PCR擴增(Advantage 2 Polymerase Mix)，產(chǎn)物經(jīng)QIAquick試劑盒純化后用Illumina HiSeq3000平臺進行高通量測序。

三、質(zhì)控與數(shù)據(jù)對比分析

高通量測序數(shù)據(jù)經(jīng)過濾，結(jié)合miXCR軟件及IMGT/HighV-QUEST數(shù)據(jù)庫進行綜合分析。

四、統(tǒng)計學方法

所有統(tǒng)計學分析均采用SPSS 20.0軟件進行。符合正態(tài)分布的參數(shù)使用平均數(shù)±標準差表示，不符合正態(tài)分布的參數(shù)使用中位數(shù)和四分位數(shù)或患者的數(shù)量(%)表示。SR和NSR兩樣本比較采用兩獨立樣本 Wilcoxon秩和檢驗，配對樣本用Wlicoxon符號秩檢驗，雙變量相關(guān)分析采用Spearman秩相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、患者一般資料

兩組患者基線時年齡(24 比 25)、HBV DNA(7.56 比 8.22 log10拷貝/mL)、HBsAg(3.32 比 4.80 log10IU/mL )、HBeAg(3.05 比 3.48 log10 S/CO)、ALT(151.0 比 208.0 IU/mL)、AST(108.0 比 78.0 IU/mL)、肌酸激酶(102.0 比 125.0 U/L)、肝臟硬度掃描、肝穿刺刺病理G-S評分差異均無統(tǒng)計學意義。

二、TCR克隆數(shù)鑒定與計數(shù)

10例患者基線及104周肝穿刺組織所測TCRβ序列經(jīng)過濾，共獲得5 000 547條序列，平均每例標本250 027條，此測序深度，保證了轉(zhuǎn)錄水平很低的T細胞也可檢測到。經(jīng)數(shù)據(jù)庫比對，基線和104周分別獲得了1 502 079和2 289 752條有效的TCRβ序列，總共鑒定到52種TRBV基因、13種TRBJ基因、790種不同的VJ組合、3 440種不重復CDR3的核苷酸序列以及3 111種不重復CDR3氨基酸類型。

進一步分析兩時間點V基因、J基因的使用頻率變化，TRBV6-5、TRBV5-6、TRBV12-4、TRBV10-2變化具有統(tǒng)計學意義，均為基線頻率高于104周。對應TRBJ基因，僅有TRBJ2-6基線頻率高于104周。

三、TCR文庫多樣性分析

從TCR文庫的不重復VJ組合、CDR3克隆型、以及標準化香農(nóng)熵(normalized Shannon diversity entropy，NSDE)三個方面，分析不同時間點患者肝內(nèi)TCR文庫多樣性情況。其中，NSDE取值范圍為0-1；取值接近于1，提示文庫多樣性越高，反之則越低。

患者基線時的不重復VJ組合數(shù)量高于104周(125.5 比 73.0，P=0.032，圖1A)，將患者根據(jù)治療結(jié)局分組后可發(fā)現(xiàn)，SR組基線時不重復克隆型數(shù)量高于104周(151.0 比 71.0，P=0.043，圖1B)。與不重復VJ組合結(jié)果類似，患者基線時CDR3克隆型數(shù)量高于104周(195.0 比 122.5，P=0.059，圖1D)，其中SR組兩時間點數(shù)量差異具有統(tǒng)計學意義(223.0 比 109.0，P=0.043，圖1E)。10例患者基線平均NSDE高于104周(0.55 比 0.29，P=0.047，圖1G)，分組后可見SR組所有患者NSDE均呈現(xiàn)下降趨勢(0.58 比 0.17，P=0.043，圖1H)。提示經(jīng)過治療，大部分患者肝內(nèi)TCR文庫多樣性下降，SR組下降趨勢尤為顯著。

圖1 兩時間點(基線和治療104周時)肝組織TCR文庫的多樣性變化

四、TCR克隆動態(tài)變化

對比兩個時間點CDR3克隆型的動態(tài)變化，將基線未檢測到但104周可檢測到的克隆稱為新增克隆型，將基線可以檢測到但104周未檢測到的克隆稱之為消失克隆型。兩種變化克隆型數(shù)量較少，只予以分析基因頻率(某類克隆型數(shù)量在兩時間點不重復克隆型總數(shù)量的占比)。在SR組中，消失克隆型百分比多于新增克隆型(27.29% 比 67.89%，P=0.007，圖2A)，而NSR組中兩種類型克隆數(shù)量差異無統(tǒng)計學意義。

圖2 兩組患者肝內(nèi)TCR不同克隆型(新增克隆型和消失克隆型)基因頻率的比較

五、臨床血清學指標與TCR多樣性分析

根據(jù)基線和治療104周兩時間點TCR克隆類型變化，識別消失克隆與新增克隆，兩種類型克隆數(shù)較少，不納入分析，但是對比這兩種克隆類型在每個患者總克隆類型的百分比，可以發(fā)現(xiàn)，SR組從基線到104周HBsAg的變化程度與消失克隆型變化呈正相關(guān)(r=0.9，P=0.037，圖3)，NSR組未發(fā)現(xiàn)兩者具有相關(guān)性。結(jié)果提示，SR組患者基線到104周消失克隆型的比例越高，HBsAg水平下降幅度越大。

圖3 血清HBsAg水平與肝內(nèi)TCR消失克隆型頻率的線性相關(guān)圖

討 論

我們使用無偏倚的5′RACE技術(shù)對CHB患者NUCs(LdT)治療過程中肝內(nèi)TCR文庫的動態(tài)變化進行了分析，發(fā)現(xiàn)肝內(nèi)TCR文庫高頻使用的V基因與我們前期調(diào)查的CHB患者外周血中V基因結(jié)果并不完全一致[5, 8]，可能的原因是患者個體間V、J使用偏好的影響[7]，以及外周血與肝內(nèi)T細胞組成存在差異[11, 15]。

經(jīng)NUCs治療，肝內(nèi)TCR文庫在不重復VJ組合、CDR3克隆型和NSDE三個層面都表現(xiàn)出多樣性下降，尤其在SR組，治療后TCR文庫多樣性顯著降低，這與CHB患者NUCs治療過程中外周血中TCR動態(tài)變化研究結(jié)果類似；外周血中CD4+和CD8+T細胞亞群整體呈現(xiàn)多樣性下降，并且在抗病毒治療應答患者中下降更顯著[5, 8]。但是，外周循環(huán)中的T細胞受機體多種器官和因素的影響，變化幅度更小，而肝內(nèi)T細胞變化可更加準確地反映其在肝組織局部的動態(tài)變化。T細胞的免疫重建體現(xiàn)在從“耗竭”表型轉(zhuǎn)變?yōu)椤凹せ睢北硇蚚5, 16]，T細胞功能部分恢復[17]，進而發(fā)生克隆增殖[5, 18-19]。本研究SR組患者經(jīng)NUCs治療，肝內(nèi)T細胞文庫多樣性下降明顯，推測可能由于治療后肝內(nèi)HBV特異性或相關(guān)性T細胞發(fā)生克隆增生，而與HBV無關(guān)的T細胞克隆相對減少，因此SR組消失克隆型百分比更多，這些肝內(nèi)增生的克隆是否為HBV特異性T細胞值得進一步研究。

針對CHB和肝硬化患者外周血的研究表明，經(jīng)過NUCs治療后，部分與HBV無關(guān)的CD8+T淋巴細胞群體會加重肝臟炎癥，與不良預后相關(guān)[20]。對比本研究，發(fā)現(xiàn)SR組肝內(nèi)消失克隆型比例增高，TCR文庫多樣性相對下降，與基線到治療104周HBsAg水平下降幅度有正相關(guān)關(guān)系，而NSR組不具有該現(xiàn)象。這一結(jié)果再次提示，SR組患者肝內(nèi)發(fā)生的T細胞克隆增殖與HBV有關(guān)，間接證明實現(xiàn)HBeAg血清學轉(zhuǎn)換患者肝內(nèi)增生的T細胞群體更可能是HBV特異性T細胞。

綜上，本研究首次對NUCs治療前后肝內(nèi)TCR文庫的動態(tài)變化進行了研究，發(fā)現(xiàn)NUCs治療后肝內(nèi)TCR文庫變化主要表現(xiàn)在消失克隆型增加、整體多樣性下降，提示肝內(nèi)T細胞在NUCs治療后的免疫重建中有重要意義。未來對于CHB患者的治療中，使用NUCs抗病毒藥物的同時，結(jié)合適當?shù)拿庖哒{(diào)節(jié)策略，可能更有利于病毒控制和患者預后。