黎敏航 蔡碧蓮 蔣云霞 羅偉生

肝硬化是臨床各種慢性肝病發(fā)展的結(jié)果，調(diào)查結(jié)果顯示，中國(guó)有約700萬(wàn)人罹患肝硬化，每年有46萬(wàn)肝癌新發(fā)病例[1]。肝纖維化是肝硬化的前兆，肝臟受到損傷后，肝星狀細(xì)胞(liver stellate cells，HSC)被激活并增殖，轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，分泌細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分，HSC激活是肝纖維化過(guò)程中的關(guān)鍵事件[2-4]。探索HSC的激活機(jī)制對(duì)肝纖維化的臨床與基礎(chǔ)研究有積極意義。

材料與方法

一、儀器與試劑

大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所細(xì)胞庫(kù)、雄性SD大鼠購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司、MTT試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司、BCA蛋白濃度測(cè)定盒購(gòu)自北京碧云天生物技術(shù)公司、高效液相色譜儀UltiMate 3000 UHPLC、串聯(lián)質(zhì)譜儀Q-Exactive HF由賽默飛世爾科技有限公司提供。

二、血清制備

雄性清潔級(jí)SD大鼠30只，體質(zhì)量為(200±10)g，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和正常組，其中正常組10只，實(shí)驗(yàn)組20只。實(shí)驗(yàn)組每周2次四氯化碳皮下注射誘導(dǎo)肝纖維化，共10周，病理檢查確認(rèn)大鼠肝纖維化模型造型成功后，在無(wú)菌狀態(tài)下采集血清。正常組在相同條件下飼養(yǎng)相同天數(shù)，在無(wú)菌狀態(tài)下采集血清。

三、細(xì)胞培養(yǎng)以及血清干預(yù)

HSC-T6放置在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2條件下培養(yǎng)，待貼壁率為95%時(shí)，胰酶消化傳代，每3～4天進(jìn)行一次。取對(duì)數(shù)成長(zhǎng)期的第4代，MTT法測(cè)定2組血清對(duì)相應(yīng)組別的HSC的最大無(wú)毒濃度(TC0)，作為細(xì)胞干預(yù)的誘導(dǎo)劑量。以實(shí)驗(yàn)組血清TC0濃度干預(yù)實(shí)驗(yàn)組HSC，先使用實(shí)驗(yàn)組血清預(yù)誘導(dǎo)液(20%實(shí)驗(yàn)組血清TC0的DMEM),24 h后棄去,加入完全的實(shí)驗(yàn)組誘導(dǎo)液(100%實(shí)驗(yàn)組血清TC0的DMEM)。正常組HSC使用正常組血清干預(yù)，操作過(guò)程同實(shí)驗(yàn)組。將以上各組放入培養(yǎng)箱24 h后，棄去培養(yǎng)液，用DMEM培養(yǎng)基洗滌2次，按照上述培養(yǎng)條件繼續(xù)培養(yǎng)，每3天交換1次。誘導(dǎo)分化14 d后，分別取出各組HSC，提取全部蛋白質(zhì)。

四、樣品制備及檢測(cè)

使用PBS洗凈多余培養(yǎng)后，加入適量Cocktail，放置在冰上5 min，加10 mmol/L DTT，用超聲波進(jìn)行細(xì)胞碎裂后，以25 000×g離心15 min，取上清; 再加同濃度的DTT，56 ℃水浴1 h; 加濃度為55 mmol/L的IAM，暗室放置45 min，在25 000×g離心15 min后取上清即為蛋白質(zhì)，BCA法測(cè)蛋白濃度。用酶分解蛋白質(zhì)后，將所有樣品各取10 g混合，混合液用高pH反相柱分離成10個(gè)組分。將收集到的溶液干燥后，再次溶解在0.1%甲酸中 ，進(jìn)行液相色譜分離，分離后的肽段通過(guò)nanoESI源離子化后進(jìn)入到串聯(lián)質(zhì)譜儀Q-Exactive HF進(jìn)行DDA(data-dependent acquisition)模式檢測(cè)，獲得下機(jī)的DDA數(shù)據(jù)后，使用MaxQuant整合Andromeda引擎完成鑒定，接著使用Spectronaut對(duì)該結(jié)果進(jìn)行譜圖庫(kù)構(gòu)建。隨后再進(jìn)行DIA(data-independent acquisition)模式下的檢測(cè)。

五、數(shù)據(jù)分析

采用Spectronaut和MSstats軟件完成對(duì)肽段與蛋白質(zhì)的定量工作，提取離子對(duì)峰面積后，對(duì)樣品進(jìn)行系統(tǒng)內(nèi)誤差校正，根據(jù)設(shè)定的正常組與線性混合效應(yīng)模型來(lái)計(jì)算蛋白質(zhì)之間是否有顯著差異。采用Fold change >= 2 和<0.05 兩個(gè)條件作為蛋白質(zhì)顯著性差異的篩選標(biāo)準(zhǔn)。在Uniprot(https://www.uniprot.org/uploadlists/)網(wǎng)站中使用基因本體(gene ontology，GO)數(shù)據(jù)庫(kù)、京都基因和基因組百科全書(shū)(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異蛋白進(jìn)行分析，將分析所得的差異蛋白信息輸入到string數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org)查詢(xún)蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)。

結(jié) 果

一、CCl4誘導(dǎo)大鼠肝纖維化

實(shí)驗(yàn)組大鼠肝組織Masson染色結(jié)果顯示，匯管區(qū)周?chē)梢?jiàn)明顯纖維化，纖維間隔形成，包繞小葉，表明CCl4誘導(dǎo)大鼠肝纖維化造模成功(圖1)。

圖1 實(shí)驗(yàn)組大鼠肝臟組織光學(xué)顯微鏡下表現(xiàn)(Masson染色×40)

二、MTT法測(cè)定兩組大鼠血清TC0結(jié)果

不同濃度大鼠血清的實(shí)驗(yàn)組分別干預(yù)24 h后，MTT測(cè)定各組細(xì)胞的增殖情況，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組大鼠血清的TC0濃度為0.19%，正常組大鼠血清的TC0濃度為3.12%。后續(xù)實(shí)驗(yàn)以各組最大無(wú)毒液濃度為誘導(dǎo)劑量，見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)組、正常組血清對(duì)HSC-T6細(xì)胞增殖的影響

三、樣品蛋白質(zhì)信息

一共鑒定出5984種蛋白質(zhì)，顯著表達(dá)差異蛋白質(zhì)有221種，其中顯著上調(diào)表達(dá)的蛋白質(zhì)162種，顯著下調(diào)表達(dá)的蛋白質(zhì)59種。將所有蛋白質(zhì)變化倍數(shù)以2為底，取對(duì)數(shù)并繪制火山圖，見(jiàn)圖2。顯著上調(diào)與顯著下調(diào)蛋白中差異最明顯的10種蛋白質(zhì)(除外未明確蛋白質(zhì))見(jiàn)表2。

表2 差異表達(dá)最明顯的10種蛋白質(zhì)(上調(diào)表達(dá)+下調(diào)表達(dá))

圖2 差異蛋白火山圖

四、GO注釋以及GO富集分析

通過(guò)對(duì)差異蛋白進(jìn)行GO分析，發(fā)現(xiàn)它們主要執(zhí)行整合、催化活性和細(xì)胞功能調(diào)節(jié)等分子功能，細(xì)胞組件主要存在于細(xì)胞器與膜上，主要參與細(xì)胞過(guò)程、代謝過(guò)程、生物調(diào)節(jié)等26種生物過(guò)程。見(jiàn)圖3。

五、差異蛋白通路富集分析

將得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行KEGG分析，發(fā)現(xiàn)差異蛋白涉及的通路共有44個(gè)，對(duì)這些通路進(jìn)一步的富集分析，發(fā)現(xiàn)其中有22個(gè)通路存在顯著富集的情況，部分通路包括蛋白質(zhì)的情況為：類(lèi)固醇生物合成6種，細(xì)胞粘附分子5種，細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用5種，膽固醇代謝4種，Notch信號(hào)通路4種。見(jiàn)圖4。

圖4 KEGG富集分析結(jié)果氣泡圖

六、蛋白質(zhì)相互作用分析

將分析所得的差異蛋白信息輸入到string數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行PPI查詢(xún)，在得到的結(jié)果中隱藏?zé)o連接的節(jié)點(diǎn)，并進(jìn)行聚類(lèi)分析得到圖5。

圖5 蛋白互作分析圖

從圖中可發(fā)現(xiàn)，相互作用連線密集的區(qū)域可大致分為三部分，分別對(duì)這些區(qū)域的蛋白質(zhì)的信息進(jìn)行查詢(xún)及分析，可以發(fā)現(xiàn)上方區(qū)域的蛋白質(zhì)主要與ECM相關(guān)，下方區(qū)域主要與溶酶體的功能相關(guān)，左側(cè)區(qū)域主要與膽固醇的代謝相關(guān)。纖維連接蛋白(Fn1)、鈣粘蛋白-2(cdh2)、7- 脫氫膽固醇還原酶(Dhcr7)、組織蛋白酶D(Cstd)、組織蛋白酶A(Csta)為與周?chē)鞍踪|(zhì)有廣泛連接的關(guān)鍵蛋白。

討 論

數(shù)據(jù)非依賴(lài)采集技術(shù)(DIA)是一種新興技術(shù)，蛋白質(zhì)組學(xué)研究中應(yīng)用該技術(shù)能高效測(cè)定樣品中豐度極低的蛋白分子，極大地提高了結(jié)果的可信度。GO富集分析的結(jié)果中有7條與膽固醇的合成及代謝相關(guān)；KEGG信號(hào)通路分析中：類(lèi)固醇合成通路與膽固醇代謝通路屬于顯著富集的通路；PPI分析發(fā)現(xiàn)左側(cè)相互間關(guān)系密切的蛋白質(zhì)都與膽固醇的代謝合成相關(guān)，其中DHCR 7屬于類(lèi)固醇合成通路，是合成膽固醇的最后一個(gè)酶，這些都說(shuō)明HSC的激活與膽固醇的代謝是高度相關(guān)的。研究表明，膽固醇能直接損傷肝細(xì)胞，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，激活庫(kù)普弗細(xì)胞以及HSC，游離膽固醇會(huì)在HSC中堆積，加重肝纖維化[5-6]。

鈣粘蛋白-2是顯著上調(diào)的蛋白質(zhì)，通過(guò)PPI分析發(fā)現(xiàn)其處于重要地位。HSC被激活時(shí)就會(huì)上調(diào)該蛋白質(zhì)的表達(dá)，表明抑制該蛋白質(zhì)的功能可以顯著促進(jìn)已激活的HSC凋亡，說(shuō)明鈣粘蛋白-2是HSC激活過(guò)程中是重要的靶點(diǎn)蛋白[7-10]。

本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)N、CD44、Ⅰ型膠原蛋白都是顯著上調(diào)蛋白，它們同屬于細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用信號(hào)通路，CD44是FN與Ⅰ型膠原蛋白的下游產(chǎn)物。其中CD44可幫助HSC在修復(fù)慢性肝臟損傷時(shí)進(jìn)行細(xì)胞遷移，最終導(dǎo)致肝纖維化[11]；FN是ECM的重要組成部分，在修復(fù)慢性肝臟損傷時(shí)，F(xiàn)N會(huì)持續(xù)增加，這個(gè)過(guò)程激活了HSC，同時(shí)TGF-β能夠上調(diào)HSC的FN受體，增強(qiáng)激活作用[12]。

Notch信號(hào)通路在HSC激活的過(guò)程中起到了重要作用，Bansal等[13]與Chen等[14]的研究證明在肝纖維化過(guò)程中，該信號(hào)通路被顯著激活，使用兩種不同的Notch信號(hào)通路抑制劑都可以減輕肝纖維化程度。本研究中，被富集到該信號(hào)通路的差異蛋白質(zhì)大部分處于上調(diào)狀態(tài)，處于核心的Notch 1蛋白、Notch 2蛋白分別上調(diào)6倍與3倍，可認(rèn)為Notch信號(hào)通路是HSC活化過(guò)程中的重要信號(hào)通路。

本研究從蛋白質(zhì)組學(xué)的角度展示了HSC激活的機(jī)制可能與膽固醇代謝、細(xì)胞外基質(zhì)相互作用、Notch信號(hào)通路等有關(guān)，其中鈣粘蛋白-2、FN、Notch蛋白等可能是靶點(diǎn)蛋白，后續(xù)關(guān)于其激活機(jī)制的研究可以從這些方面繼續(xù)深入，而對(duì)于防治肝纖維化的藥物靶點(diǎn)也可以從這些方面篩選相關(guān)靶點(diǎn)。