王杠杠， 王似錦， 馬仕洪

(中國食品藥品檢定研究院，北京 100050)

洋蔥伯克霍爾德菌群(Burkholderiacepaciacomplex，Bcc)是包括洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderiacepacia)在內的一系列表型類似且16S rRNA高度同源的革蘭陰性菌的總稱[1-3]，臨床上是引起囊性纖維化(cystic fibrosis)患者、慢性肉芽腫(chronic granulomatous)患者及免疫力低下患者嚴重感染的條件致病菌[4]。因其復雜且可變的基因組，Bcc可適應低氧環(huán)境，實現呼吸道上皮黏附，且對臨床多種抗生素存在耐藥性[5]。一旦感染，患者生命安全會受到巨大威脅。Bcc廣泛存在于制藥環(huán)境尤其是水系統(tǒng)中，近年來，屢有發(fā)生藥品及衛(wèi)生用品因污染該菌而召回的案例[6]。目前，Bcc已經被美國食品藥品監(jiān)督管理局(U.S.Food and Drug Administration,FDA)明確為不可接受微生物(objectionable microorganism)，FDA提醒生產企業(yè)應注意非無菌水基藥品Bcc污染的風險[7]。目前針對Bcc的控制手段和研究方向主要集中在檢出、鑒定及耐藥性方面，傾向于對原輔料、中間產品和成品的控制及感染后的治療，而對于處方控制的關注較少[8-11]。長期以來，水分含量是反映藥品質量安全和穩(wěn)定的重要參數，然而對于控制藥品微生物污染，水分活度(water activity，Aw)比水分含量更有意義。Aw是相同溫度下產品水蒸氣壓與純水蒸氣壓的比值。1957年，澳大利亞科學家Scott[12]提出，微生物存在最低生長Aw，低于該限值微生物將不能生長。降低Aw會導致微生物生長延滯期延長，代謝活性降低，生長速率減慢[13]。因此，Aw測量和控制可作為微生物風險控制的關鍵環(huán)節(jié)[14]。美國藥典<1112>章節(jié)中指出，測量非無菌藥品Aw有助于優(yōu)化處方以提高防腐體系的抑菌效果，降低處方(尤其是液體、膏、乳液和霜)受微生物污染的風險[8]。本實驗室曾在樣品中分離了一株洋蔥伯克霍爾德菌，其能夠在該樣品的防腐體系中存活和生長[15]，這意味著Bcc對于含有抑菌劑的非無菌藥品依然存在風險。研究Aw與Bcc生長間的關系可能為此類產品優(yōu)化處方、提高抑菌效果、降低污染風險提供重要依據。本研究選取2個Bcc的典型種作為研究對象，其中洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderiacepacia)2株，新洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderiacenocepacia)1株，分別在氯化鈉、甘油、蔗糖調節(jié)的不同Aw條件下培養(yǎng)，通過全自動生長曲線分析儀繪制生長曲線，探究不同調節(jié)劑作用下Bcc最低生長Aw及Aw對其生長曲線的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderiacepacia)2株：CICC10857(=ATCC25416)、201708

01-1(環(huán)境分離菌株)；新洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderiacenocepacia)1株：20180108-11(環(huán)境分離菌株)。

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基 氯化鈉(sigma，美國)；甘油(國藥，上海)；蔗糖(北京糖業(yè)，北京)；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基TSB(BD，美國)。

1.1.3 儀器與設備 全自動生長曲線分析儀(Bioscreen，芬蘭)；Aqualab 4TE Duo水分活度測定儀(Decagon Devices，美國)；BJ-2202S電子天平(Sartorius，德國)；生物安全柜(Nuaire，美國)；復合型低溫恒溫培養(yǎng)箱(Yamato，日本)。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基制備 以氯化鈉、甘油、蔗糖為調節(jié)劑，配制Aw不同的TSB，滅菌后測量25 ℃時Aw。實驗用3組TSB滅菌后Aw實測值見表1。

表1 實驗用TSB滅菌后水分活度

1.2.2 菌懸液制備與接種 將凍干菌種接種至10 mL TSB中，32.5 ℃培養(yǎng)18 h，稀釋成105cfu/mL的菌懸液。將不同Aw梯度的TSB與菌懸液加入全自動生長曲線分析儀配套蜂窩板中，每孔加入培養(yǎng)基300 μL、菌懸液10 μL(接入菌量約為103cfu/孔)，每種培養(yǎng)基2個平行孔。

1.2.3 全自動生長曲線分析 將蜂窩板放入全自動生長曲線分析儀，設置儀器培養(yǎng)溫度為32.5 ℃，每隔30 min測量1次吸光度(OD600)，連續(xù)測量72 h。測量結束后導出數據，以OD600對時間作圖，繪制生長曲線。

2 結果與分析

2.1 Bcc最低生長水分活度

圖1為3株Bcc分別在氯化鈉、甘油、蔗糖調節(jié)的不同Aw條件下的生長曲線。初始OD600在0.06～0.10，OD600在72 h內始終小于0.11則認為該條件下菌株不生長。當Aw≥0.990時，3組Bcc生長曲線無顯著差異，生長曲線呈S型，培養(yǎng)10 h左右OD600開始明顯增加，至30 h左右達到峰值。氯化鈉組Aw<0.978時3株Bcc均不生長；甘油組Aw<0.944時，3株Bcc均不生長，Aw=0.944時僅20170801-1生長，其余2株不生長；蔗糖組，Aw<0.971時3株Bcc均不生長，Aw=0.971時僅20180108-11生長，其余2株不生長。

圖1 不同水分活度(Aw)條件下Bcc生長曲線Fig.1 Growth curve of Bcc under different Aw

由此得到不同調節(jié)劑作用下3株Bcc最低生長Aw(表2)。氯化鈉組最低生長Aw為0.978，甘油組、蔗糖組3株菌結果略有差異，甘油組最低生長Aw為0.944～0.955，蔗糖組最低生長Aw為0.971～0.978。與氯化鈉和蔗糖相比，在甘油作為調節(jié)劑時，Bcc可在更低Aw條件下生長。

表2 不同調節(jié)劑作用下Bcc最低生長水分活度(Aw)

2.2 水分活度對Bcc生長曲線的影響

在高于最低生長Aw條件下，Bcc生長曲線基本呈S形，OD600隨培養(yǎng)時間延長不同程度增加。以可測量時間(time to detection, TTD)、曲線峰值、曲線斜率作為指標評價Aw對Bcc生長曲線的影響。

所有生長曲線中，甘油組20170801-1在Aw=0.944時終點OD值最低，約為0.14。取0.11～0.14的中間值0.125作為設定值，OD600達到該設定值的時間即為該條件下TTD，TTD與延滯期及生長速率相關[16]。Aw對TTD的影響見圖2。氯化鈉組TTD在9～48 h，甘油組TTD在9～56 h，蔗糖組TTD在9～57 h。隨Aw降低TTD延長，且在接近最低生長Aw時，TTD延長程度增加，3株Bcc之間TTD差異更明顯。不同調節(jié)劑作用下無明顯差異。

圖2 水分活度(Aw)對 Bcc生長曲線TTD的影響Fig.2 Effect of Aw on growth curve TTD of Bcc

曲線峰值一定程度上反映了平臺期菌液濃度。Aw對曲線峰值的影響見圖3。氯化鈉組峰值在0.36～2.04，甘油組峰值在0.17～2.36，蔗糖組峰值在0.19～1.98。3株Bcc曲線峰值差異明顯，20170801-1峰值明顯小于其余2株，但Aw對其峰值影響規(guī)律基本一致：在Aw≥0.988時，曲線峰值隨Aw降低變化不明顯，部分曲線峰值小幅度上升；在Aw接近最低生長Aw時，曲線峰值隨Aw降低明顯下降。不同調節(jié)劑作用下無明顯差異，且均在Aw≈0.990時峰值達到最大值。

圖3 水分活度(Aw)對Bcc生長曲線峰值的影響Fig.3 Effect of Aw on growth curve peak value of Bcc

取生長曲線S形中段(接近直線上升部分)進行線性擬合，所得斜率即為生長曲線斜率，該斜率反映了該階段比生長速率。Aw對曲線斜率的影響見圖4。氯化鈉組斜率為0.011 4～0.125 3，甘油組斜率0.002 4～0.124 8，蔗糖組斜率0.003 5～0.138 3。 3株Bcc曲線斜率差異明顯，20170801-1斜率明顯小于其余2株，但Aw對其斜率影響規(guī)律基本一致：在Aw≥0.988時，曲線斜率隨Aw降低變化不明顯，部分曲線峰值小幅度上升；但隨Aw繼續(xù)降低，曲線峰值隨之明顯下降。不同調節(jié)劑作用下無明顯差異，且均在Aw≈0.990時峰值達到最大值。

圖4 水分活度(Aw)對Bcc生長曲線斜率的影響Fig.4 Effect of Aw on growth curve slope of Bcc

3 討 論

本研究表明，培養(yǎng)溫度為32.5 ℃時，Bcc在不同調節(jié)劑作用下最低生長Aw為0.978(氯化鈉)、0.944～0.955(甘油)、0.971～0.978(蔗糖)，菌株之間有微小差異。本實驗室在之前的研究中，通過定性實驗表明菌株20170801-1在30～35 ℃最低生長Aw為0.974～0.978(氯化鈉)、0.944(甘油)、0.962～0.965(蔗糖)[17]，與本研究結果基本一致，且與假單胞菌屬的最低生長Aw接近[8]。

對3種調節(jié)劑所得結果進行對比發(fā)現，氯化鈉和蔗糖作用下Bcc最低生長Aw接近，與之相比甘油作用下則更低。這與文獻報道相一致：在討論Aw作用時，氯化鈉與蔗糖對大多數細菌的影響是相似的，但甘油對于革蘭陽性球菌抑制作用更強，而對于革蘭陽性桿菌及革蘭陰性桿菌抑制作用更弱[18]。

由于OD600生長曲線與傳統(tǒng)平板計數所得生長曲線有所區(qū)別，在細胞濃度較低時，OD600無法及時反映細胞數量變化[16]。因此本研究無法直接探討Aw對Bcc生長延滯期、生長速率等經典參數的影響，而是選擇TTD、曲線峰值、曲線斜率作為間接指標。隨Aw降低，Bcc生長曲線TTD延長，曲線峰值及斜率整體呈下降趨勢。研究結果可以一定程度上估計Aw對Bcc生長曲線在延滯期、生長速率的影響，但仍有局限性，后續(xù)可通過建立Bcc生長模型進一步研究。明確Aw對Bcc生長的影響，有助于非無菌藥品生產企業(yè)在藥品處方設計、生產等階段正確評估Bcc污染的風險，為建立有效控制措施提供依據。