董羽嘉，何艷慧，武占省

(西安工程大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院 西安市紡織化工助劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710048)

植物根際促生菌(PGPR)劑是一類能促進(jìn)植物生長的細(xì)菌，可以在植物根部定植之后通過促進(jìn)植物營養(yǎng)的吸收、誘導(dǎo)根表面激素的產(chǎn)生或者分泌抗菌物質(zhì)等來抑制危害性病原體的侵害，達(dá)到直接或者間接影響植物生長和發(fā)展的目的[1]。然而PGPR的接種劑一般以液體型菌劑或固體型菌劑施入土壤，菌劑會(huì)直接裸露于土壤環(huán)境中[2-3]，當(dāng)菌劑面臨土壤營養(yǎng)環(huán)境的變化或土傳微生物的競爭與原生動(dòng)物捕食時(shí)，時(shí)常處于不穩(wěn)定的狀態(tài)，因此，PGPR菌劑的穩(wěn)定性差、存活期短、有效活菌數(shù)量低、持效性差，這些制約了菌劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用[4]。近年研究發(fā)現(xiàn)將菌體細(xì)胞固定在生物載體中或通過微膠囊技術(shù)包埋在膠囊中能夠有效提高菌體的存活率和緩釋性[5]。微膠囊技術(shù)是一種應(yīng)用成膜材料包覆固體或液體芯材，使之形成微小粒子的技術(shù)，制得的微膠囊具有改善和提高芯材物質(zhì)外觀及其性質(zhì)的能力，能夠保護(hù)囊心物質(zhì)不受外界的影響[5]。其中，用于固定生物的微膠囊又稱為生物微膠囊[6-7]。

1998年墨西哥西北生物學(xué)研究中心的Bashan等充分肯定了植物促生菌的微膠囊劑型相比游離菌體劑型的顯著優(yōu)勢，是將來研究應(yīng)用的新趨勢[8]。近年來，眾多國內(nèi)外學(xué)者對植物根際促生菌的微膠囊化進(jìn)行了研究。Lin等[9]用海藻酸鈉和脫脂牛奶固定化KlebsiellavariicolaGN02，所得的GN02微膠囊與游離菌體相比，不僅更加穩(wěn)定、存活率更高，而且對玉米的生長有更強(qiáng)的促進(jìn)作用。由于微膠囊化菌劑不僅能夠緩解土壤中的不利環(huán)境對促生菌的影響，增加菌株存活率，而且通過控制釋放速率能有效地延長菌株的存活期，有利于確保菌體的穩(wěn)定性，所以微膠囊菌劑已經(jīng)成為農(nóng)業(yè)微生物制劑研究及應(yīng)用的重要方向，受到國外學(xué)者廣泛關(guān)注。本文總結(jié)了根際促生菌劑微膠囊的制備方法和不同的壁材對微膠囊菌劑性能的影響(圖1)，同時(shí)介紹了微膠囊的釋放特性以及應(yīng)用情況，并對微膠囊菌劑在生物農(nóng)業(yè)上的未來發(fā)展前景進(jìn)行了展望，以期對微膠囊菌劑的工業(yè)化生產(chǎn)和拓寬其應(yīng)用范圍提供參考。

圖1 植物根際促生菌的微膠囊化制備法及其釋放示意Fig.1 Schematic diagram of microencapsulation and release of plant growth promoting rhizobacteria

1 根際促生菌微膠囊的制備方法

根際促生微膠囊菌劑所包埋的是具有生物活性的細(xì)胞或代謝產(chǎn)物，所以要求制備的條件必須溫和，避免使生物質(zhì)失去活性，現(xiàn)常用的制備方法主要有擠壓法、乳化法和噴霧干燥法。

1.1 擠壓法

擠壓法是制備微膠囊最簡單、最常用的方法，具體是將活性物質(zhì)與壁材溶液混合均勻后，通過噴嘴以液滴的形式滴入固化液中，與壁材溶液發(fā)生交聯(lián)作用，形成微小顆粒[10]。Schoebitz等[11]研究發(fā)現(xiàn)，混合海藻酸鹽和淀粉制備的微膠囊粒徑大約為2.3 mm，且在干燥后AzospirillumbrasilenseSp245幾乎沒有損失，包埋率較高。Wu等[12]將含RaoultellaplanticolaRs-2的壁材混合溶液從0.9 mm針孔徑的無菌注射器中擠入20 g/LCaCl2固化液中，制得粒徑為0.98～1.35 mm的海藻酸鹽-淀粉包封的Rs-2微膠囊，得率可達(dá)90.4%。Wu等[7]采用擠壓法以不同濃度的海藻酸鹽制備KlebsiellaoxytocaRs-5微膠囊時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨海藻酸鹽濃度的增加，膠囊粒徑隨之增大，當(dāng)海藻酸鹽為20 g/L時(shí)，膠囊顆粒更加均勻，粒徑主要集中在1.0 mm左右。Pacheco-Aguirre等[13]采用擠壓法，以黃原膠為壁材，對Bacillussubtiliscbrf24進(jìn)行微膠囊化制備，最終的膠囊粒徑在1.34 mm左右。

總的來說，擠壓法制得的微膠囊的粒徑大小取決于噴嘴孔徑的大小、液滴下落的距離、固化液的選擇以及壁材-細(xì)胞混合液的黏度等，一般制得的膠囊粒徑較大，約為0.5～3.0 mm。由于擠壓法操作簡單、成本低廉，所以在制備微膠囊過程中應(yīng)用較廣。

1.2 乳化法

乳化法能夠靈活地控制和調(diào)整微膠囊的大小，具體操作方法是先將芯材與壁材混合均勻后加入植物油中高速攪拌進(jìn)行乳化，待形成均勻且穩(wěn)定的油包水(W/O)乳化液滴后，加入交聯(lián)劑使壁材溶液與之反應(yīng)固化成型，將芯材包埋在壁材與固化劑形成的膜的微膠囊中。影響微膠囊粒徑大小的主要參數(shù)有乳化過程中乳化劑的類型、分散相與連續(xù)相的黏度比以及攪拌速度等，用乳化法制得的微膠囊粒徑通常較小，約為20 μm～2 mm。Ma等[14]采用乳化法，以脫脂乳為壁材與4%L.plantarumLIP-1菌混合后，滴加乳化劑(玉米油)，在500 r/min條件下攪拌5 min后獲得了粒徑為60～70 μm的微膠囊；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，膠囊的粒徑隨水/油的比例和攪拌速度的增大而減少，隨乳化時(shí)間延長和脫脂乳濃度的增大而增大。

乳化法根據(jù)交聯(lián)劑來源的不同，目前已經(jīng)開發(fā)了外源乳化法和內(nèi)源乳化法。1983年，Nilsson等[15]發(fā)明了外源乳化法(emulsification/external gelation)制備海藻酸鹽微膠囊，具體過程：將海藻酸鈉溶液和菌液共混，將此混合物分散到油相中形成W/O型乳化液，在乳化液中緩慢加入CaCl2溶液，促使Ca2+與乳液液滴中的海藻酸鈉作用生成海藻酸鈣膜后形成海藻酸鈣微囊，靜置后收集海藻酸鈣凝膠珠。因固化劑的Ca2+從海藻酸鈉液滴外側(cè)擴(kuò)散進(jìn)入液滴而逐漸形成凝膠，故稱為外源乳化法。Li等[16]采用外源乳化法，將一定量的海藻酸鈉-膨潤土的混合液及一定量的菌液混合后滴入含有1 mL Span 80的液體石蠟中，在不同轉(zhuǎn)速下攪拌25 min，制備含PseudomonasputidaRs-198的微膠囊，其粒徑為25～100 μm，并且微膠囊的粒徑隨乳化轉(zhuǎn)速增大逐漸減小，粒徑分布更加均一。Zou等[17]采用外源乳化法將20 g/L海藻酸鈉與細(xì)胞懸液混合后加入含10 g/L Span 80的大豆油中，在300 r/min條件下攪拌15 min，制備含BifidobacteriumbifidumF-35微膠囊，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在有果膠和淀粉聚合物包覆時(shí)，膠囊的平均粒徑約為120 μm。

與外源乳化法不同，內(nèi)源乳化法的Ca2+來自海藻酸鈉液滴內(nèi)部的不溶性鈣鹽，它們與海藻酸鈉在液滴內(nèi)部原位形成凝膠。與外源乳化法相比，內(nèi)源乳化法采用難溶性鈣鹽作為鈣源，克服了外源乳化法中由于CaCl2溶液加入引起的微膠囊成簇的凝聚現(xiàn)象，使得微膠囊粒徑易于控制，可形成粒徑更小的微膠囊，且顆粒粒徑更加均一[18]。Tu等[19]在海藻酸鈉、明膠為主要壁材的溶液中加入難溶性鈣鹽顆粒，以棉籽油作為乳化劑，采用內(nèi)源乳化法包封BacillussubtilisSL-13時(shí)發(fā)現(xiàn)：海藻酸鈉為20 g/L、菌膠質(zhì)量比為1∶3、CaCO3為25 g/L時(shí)，隨明膠濃度的增加，微膠囊的粒徑分布均一、含水量增加、包埋率顯著增加，生物降解率降低，可以通過改變海藻酸鈉和明膠的含量來改變微膠囊的生物降解性以及細(xì)胞釋放速率；所制得的海藻酸鈉-明膠微膠囊表面規(guī)則，包埋率為90%～94%，粒徑為250～400 μm。Augustot等[20]以15 g/L的海藻酸鈉為壁材，以菜籽油為乳化劑，在900 r/min攪拌15 min條件下，制備了粒徑約為54.82 μm的含BifidobacteriumBB-12的Ca2+緩釋微球。

1.3 噴霧干燥法

噴霧干燥法是將細(xì)菌的細(xì)胞分散到載體或壁材中，形成乳狀液或分散液，然后將混合物霧化噴入熱室的一種方法[21]，制得的微膠囊形狀均勻、呈球性好、粒徑較小(一般小于100 μm)。Campos等[22]以不同比例和不同濃度的海藻酸鈉和麥芽糊精混合物為壁材，用噴霧干燥法制備了含Enterobactersp.14的微膠囊，其粒徑為5～50 μm。Schoebitz等[23]以麥芽糊精為壁材包封Serratiasp.時(shí)發(fā)現(xiàn)，在噴霧干燥的入口溫度145 ℃和出口溫度90 ℃的條件下，包封后的微膠囊細(xì)胞生物活性較低，由初始的2.8×109CFU/g減至2.8×106CFU/g。這可能是在噴霧干燥過程中，較高的溫度和瞬間脫水導(dǎo)致PGPR的活菌數(shù)大幅減少或?qū)Σ涣辑h(huán)境的抗性明顯下降。盡管如此，耐高溫的芽孢桿菌屬的微膠囊仍多采用噴霧干燥法來制備。有研究[24-25]表明，可以通過調(diào)整噴霧干燥進(jìn)出口的溫度來改善這一方法對膠囊中活菌數(shù)量的影響。Ma等[26]考察入口溫度分別為105、125、145、165和185 ℃條件下BacillussubtilisB99-2的存活率時(shí)發(fā)現(xiàn)，在145 ℃時(shí)活菌數(shù)可達(dá)5.35×108CFU/g，存活率約為92.48%。Chi等[27]采用噴霧干燥法以進(jìn)料流量1 000 mL/h制備BacillusmegateriumNCT-2微膠囊時(shí)發(fā)現(xiàn)，與130、170和190 ℃相比，進(jìn)口溫度為150 ℃時(shí)NCT-2的存活率最好。

與以擠壓法和乳化法制得的微膠囊相比，噴霧干燥法制得的微膠囊大多是水溶性的。因此，在進(jìn)入土壤的過程中可能會(huì)過早地釋放其中的活性物質(zhì)，減弱對其形成有效的保護(hù)，所以這種微膠囊的制備方法盡管會(huì)影響菌體的存活、釋放特性，但是這類微膠囊在提高促生菌的穩(wěn)定性和應(yīng)用效果方面有重要作用。

目前大部分的微膠囊根際促生菌劑的制備和應(yīng)用為實(shí)驗(yàn)室規(guī)模，因此，開展適用于大規(guī)模PGPR微膠囊菌劑的生產(chǎn)和制備工藝技術(shù)研究，將是推動(dòng)微膠囊菌劑實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用的重要研究方向。

2 根際促生菌的微膠囊壁材的選擇

以微膠囊封裝根際細(xì)菌主要是保護(hù)微生物避免受到環(huán)境的破壞，并且使其能夠緩慢地釋放進(jìn)入植物的根際[28]，所以壁材的性能與微膠囊化菌體的釋放性能以及促生菌的生物活性有直接關(guān)系。天然的聚合物被廣泛用于根際細(xì)菌的微膠囊化制備，主要有從海藻水凝膠中提取的海藻酸鈉、卡拉膠和瓊脂糖等；人工合成的聚丙烯酰胺、聚苯乙烯和聚氨酯等聚合物也被用于活細(xì)胞的包埋[29]；淀粉、麥芽糊精、淀粉糖漿干粉和阿拉伯樹膠等碳水化合物也被廣泛用于噴霧干燥封裝技術(shù)[30]。這些材料的低黏度和良好的生物相容性能使其成為工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用的封裝材料。

2.1 海藻酸鹽

海藻酸是存在于褐藻中的一類天然多糖，是β-D-甘露糖醛酸(mannuronic acid，簡稱M)和α-L-古洛糖醛酸(guluronic acid，簡稱G)通過β-(1→4)糖苷鍵連接形成的一類線形無分枝的鏈狀陰離子聚合物[31]。當(dāng)海藻酸鹽遇到二價(jià)陽離子或聚陽離子時(shí)，會(huì)發(fā)生離子轉(zhuǎn)移，形成既具有高強(qiáng)度又具有彈性的凝膠，由此制得海藻酸鹽微膠囊[31]。由于海藻酸無生物毒性，與微生物菌體生物相容性好、傳質(zhì)性能良好，可在自然條件下發(fā)生分解和生物降解，制備過程無須有機(jī)溶劑，室溫下可實(shí)現(xiàn)包埋過程，形成的膠囊有較高的表面孔隙率，有利于膠囊的擴(kuò)散，并且可通過簡單控制海藻酸鹽濃度來控制微膠囊的孔徑等優(yōu)良特性，被廣泛用于菌劑微膠囊的制備[32-33]。Wu等[7]用15～20 g/L的海藻酸鈉溶液采用擠壓法制備KlebsiellaoxytocaRs-5微膠囊時(shí)發(fā)現(xiàn)，在海藻酸鈉溶液和Rs-5的體積比為3∶ 1時(shí)所制得的微膠囊在細(xì)胞釋放7 d后仍有較高的活性。Amine等[34]以海藻酸鈉為壁材,采用擠壓法制備了粒徑為2 mm左右的B.longumATCC 15708微膠囊，在30 g/L海藻酸鹽條件下微膠囊的包封產(chǎn)率約為67%。Homayouni等[35]采用乳化法制備海藻酸鹽包封的Lactobacilluscasei微膠囊，平均粒徑約為17.8 μm，且包埋率隨CaCl2溶液體積的增大而增加。

由于海藻酸鹽的成本較高，并且以單獨(dú)海藻酸鹽為壁材制成的微膠囊力學(xué)強(qiáng)度不夠高，所以在制備和使用過程中加入如黏土礦物、淀粉或殼聚糖等添加劑來降低成本，更可提升微膠囊的穩(wěn)定性[36]。

2.2 黏土礦物

向海藻酸鹽中添加填充材料，如黏土、膨潤土、高嶺土和蒙脫土等作為重要壁材，可提高固形物的含量，顯著增加微膠囊的力學(xué)強(qiáng)度，并能使膠囊中的細(xì)胞具有更好的控釋性能[11]。He等[37]在制備含RaoultellaplanticolaRs-2的海藻酸鹽-膨潤土微膠囊時(shí)發(fā)現(xiàn)，膨潤土的添加提高了含R.planticolaRs-2微膠囊的力學(xué)性能，減緩了細(xì)胞的釋放速率，微膠囊的穩(wěn)定性也得以提升，與不含膨潤土的微膠囊相比，膨潤土-海藻酸鹽微膠囊在室溫保存180 d后細(xì)胞存活率仍可達(dá)88.9%。Kadmiri等[38]在海藻酸鹽中分別添加高嶺土或蒙脫土為壁材制備PseudomonasfluorescensMs-01(Pf)和AzosprillumbrasilenseDSM1690(Ab)的微膠囊時(shí)發(fā)現(xiàn)，在添加高嶺土的微膠囊中儲(chǔ)存3個(gè)月后，細(xì)菌存活達(dá)到14.8 (以細(xì)菌數(shù)目的對數(shù)值表示)，表明高嶺土的存在更有利于微膠囊中的菌體存活。Li等[16]用海藻酸鹽-膨潤土制備PseudomonasputidaRs-198微膠囊時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨膨潤土含量的增加，微膠囊粒徑、包埋率和產(chǎn)率都顯著增加，但含水量下降。

2.3 淀粉

淀粉及其水解產(chǎn)物(麥芽糊精或糊精)是一種廣泛分布于自然界的可再生的生物聚合物，基于其低成本、生物相容性及其保水性、低黏度等[39]等優(yōu)點(diǎn)，它們經(jīng)常被用作包裹材料，具有廣泛的工業(yè)應(yīng)用前景。

Wang等[40]采用氧化后分子量更低的氧化海藻酸鈉與淀粉形成的復(fù)合材料為壁材，包封PseudomonasprotegensSN15-2時(shí)發(fā)現(xiàn)，通過改變復(fù)合材料中淀粉的比例，能夠有效調(diào)節(jié)微膠囊的粒徑、制得率、包封率、釋放速率及降解率。Schoebitz等[11]向海藻酸鹽中分別添加膨潤土和淀粉對包封的A.brasilense菌株在干燥后的存活率時(shí)發(fā)現(xiàn)，添加淀粉的海藻酸鹽制備的微球在貯藏400 d后A.brasilense存活細(xì)胞最多，菌密度在109CFU/g左右。在根際促生菌劑微膠囊化的應(yīng)用中，由于淀粉是碳降解過程中的重要資源，可被微膠囊內(nèi)的細(xì)胞所利用；如果提高壁材中的淀粉含量，就會(huì)弱化淀粉與海藻酸鹽分子間的作用力，從而增強(qiáng)微膠囊的尺寸穩(wěn)定性，可顯著提高微生物細(xì)胞的存活率[12]，因此，淀粉將是工業(yè)化生產(chǎn)微膠囊菌劑的重要原料。

2.4 殼聚糖

殼聚糖結(jié)構(gòu)與纖維類似，是帶有正電荷的一種直鏈多糖，具有無毒、較好的生物相容性與降解性等優(yōu)點(diǎn)[41]，是良好的生物微膠囊壁材。殼聚糖所具有的親脂性可以用于去除油性物質(zhì)，特別是與含油降解細(xì)菌有關(guān)的物質(zhì)[42]。

Chanratana等[43]分別以濕殼聚糖、干殼聚糖、濕海藻酸鈉和干海藻酸鈉為壁材，制備MethylobacteriumoryzaeCBMB20菌株的微膠囊菌劑時(shí)發(fā)現(xiàn)：殼聚糖微膠囊對菌株CBMB20的包埋率更高；在4 ℃儲(chǔ)藏90 d后，濕殼聚糖的微膠囊中CBMB20的存活率最高(達(dá)到80%)。Chen等[44]和Hsieh等[45]用三聚磷酸鹽作為混凝劑將惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)包裹在殼聚糖微膠囊時(shí)發(fā)現(xiàn)，殼聚糖包封的細(xì)胞可以耐受更高濃度的三氯乙烯。Costa等[46]采用殼聚糖包封降解十六烷的OchrobactrumanthropicUFPEDA831和BacilluspumilusUFPEDA840菌株時(shí)發(fā)現(xiàn)，殼聚糖提高了菌株的活性和產(chǎn)殼聚糖酶的能力，且固定化細(xì)胞比游離菌對十六烷的去除率更高，在144 h內(nèi)將1% (體積分?jǐn)?shù))溶液中的十六烷除去了90.8%。現(xiàn)將PGPR微膠囊壁材及制備方法總結(jié)于表1。

表1 PGPR微膠囊化壁材及制備方法

雖然微膠囊化菌體壁材的優(yōu)化與選擇已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了由單一的海藻酸鹽到生物可降解的復(fù)合材料的轉(zhuǎn)變，然而，開發(fā)控釋細(xì)菌微膠囊的關(guān)鍵是尋找一種廉價(jià)的、來源豐富的、生物可降解的材料作為壁材原料。材料的生物可降解性與壁材的天然性質(zhì)、結(jié)構(gòu)有很大的關(guān)系，而菌劑中菌體細(xì)胞的釋放率在某種程度上也依賴于壁材的生物可降解性能和力學(xué)強(qiáng)度。因此，開展低成本、非傳統(tǒng)的生物降解性合成材料作為壁材的創(chuàng)制研究，并研究相關(guān)材料與微膠囊的釋放特性、力學(xué)性能和生物降解性的相關(guān)性，是目前研究的重要趨勢之一。

3 微膠囊釋放特性

與藥物微膠囊釋放不同，將目標(biāo)活細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物從膠囊中以預(yù)定的速率控制釋放到作物根際是微膠囊化PGPR成功的關(guān)鍵。Chanratana等[43]分別利用殼聚糖和海藻酸鈉作為壁材，制備包埋MethylobacteriumoryzaeCBMB20的微膠囊時(shí)發(fā)現(xiàn)：在30 ℃的鹽水中殼聚糖和海藻酸鈉膠囊化菌在72 h內(nèi)幾乎沒有釋放；72 h后才開始釋放，且殼聚糖配方的微生物釋放慢于海藻酸鹽配方的。

膠囊中菌體的釋放特性受各種因素的影響。一方面，菌體的釋放與膠囊自身組分有關(guān)，如膠囊的壁材組成、粒徑和包埋方式等。Liu等[48]以C.cellulansGS6細(xì)胞作為膠囊化的核心物質(zhì)，研究壁材海藻酸鹽與幾丁質(zhì)、纖維素、橄欖油對釋放量和釋放動(dòng)力學(xué)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，可以通過設(shè)計(jì)膠囊不同的壁材種類和添加量來控制細(xì)胞的釋放量和釋放速率。Wu等[49]研究發(fā)現(xiàn)，增加壁材中淀粉的添加量，可增加微膠囊的生物可降解性，從而提高細(xì)胞釋放速率和釋放量。微膠囊的粒徑大小容易受到制備條件的影響，對于核殼微膠囊，膜的厚度和滲透性也對活細(xì)胞在微膠囊中釋放有重要影響。Wu等[4]在研究不同壁材的成分對微膠囊中細(xì)胞釋放量的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，增加淀粉和海藻酸鹽的濃度都導(dǎo)致Rs-2釋放量的增加，而膨潤土是例外，因?yàn)樵黾优驖櫷恋挠昧繒?huì)導(dǎo)致微膠囊的力學(xué)強(qiáng)度增強(qiáng)，反而使細(xì)胞的釋放量降低。由此可見，通過改變壁材的組成來調(diào)節(jié)和控制細(xì)胞釋放速率和釋放量，可以滿足植物生長的需要。

另一方面，外界的環(huán)境(如pH、溫度和離子濃度等)也會(huì)影響微膠囊的釋放。Wu等[50]研究以海藻酸鈉和膨潤土包埋的菌株Rs-198微膠囊的擴(kuò)散滲透系數(shù)(DPC)及其與生長、代謝產(chǎn)物釋放和細(xì)菌存活率的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)：較高的環(huán)境溫度增加了分子運(yùn)動(dòng)的速率和溶質(zhì)分子進(jìn)出膠囊的速度，因此微膠囊的DPC值隨溫度的升高而快速增大；另外由于微膠囊在酸性條件下收縮，中性甚至堿性條件下膨脹，所以DPC值在pH為5.0時(shí)最低，pH為9.0時(shí)最高；較高濃度的鹽溶液會(huì)導(dǎo)致微膠囊外滲透壓增大，阻礙了溶質(zhì)分子和菌株細(xì)胞從微膠囊中釋放，所以微膠囊的DPC值隨鹽濃度的增加反而降低。Young等[51]研究發(fā)現(xiàn)，貯存5個(gè)月后微膠囊化的BacillussubtilisCCpg104仍具有高的存活性，可達(dá)(5.3±1.3)×108CFU/g，在24～144 h期間，pH 8時(shí)的細(xì)胞釋放速率顯著高于pH 7和pH 6時(shí)的。

國外學(xué)者對藥物在微膠囊中的釋放研究較多，但對于微膠囊菌體緩釋性能的研究報(bào)道較少，而且缺乏微膠囊中菌體在不同環(huán)境下控制釋放特性及機(jī)制研究結(jié)果，所以研究活菌的運(yùn)動(dòng)性能以及與微膠囊中控制釋放的關(guān)系，對于后期微膠囊化菌劑在作物根際的應(yīng)用以及開發(fā)適應(yīng)于農(nóng)作物要求的控釋膠囊菌劑至關(guān)重要。

4 根際促生菌微膠囊的應(yīng)用

微膠囊化菌劑能夠避免不利環(huán)境因素對促生菌的影響，有效提高菌體的存活率，可以持續(xù)地將菌劑釋放到作物根際，延長菌劑持效性，充分發(fā)揮促生菌的效能。因此，促生菌微膠囊化劑型的開發(fā)和應(yīng)用研究是生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展的研究趨勢。

Vassilev等[8]采用微膠囊共包埋的菌絲真菌Glomusdeserticola和溶磷菌Yarowialipolytica接種在營養(yǎng)貧乏土壤中，可以有效地促進(jìn)番茄的生長。Young等[51]研究發(fā)現(xiàn),富含腐殖酸的海藻酸鹽微膠囊化植物促生菌劑具有顯著的體外溶解磷酸鈣能力，并且微膠囊化菌株顯著促進(jìn)萵苣的生長。Rekha等[52]在無菌條件下研究游離的和膠囊化的惡臭假單胞菌(PseudomonasputidaCC-FR2-4)和枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisCC-pg104)對萵苣生長的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)：膠囊化的接種劑型能夠隔離土壤中不利環(huán)境，延長枯草芽孢桿菌在土壤中存活期、存活率；游離細(xì)胞接種在開始14 d內(nèi)效果顯著，但隨后(21 d后)膠囊化的CC-pg104更有優(yōu)勢，能顯著地增加萵苣根的生長，這主要是由于細(xì)胞從膠囊中的緩慢或控制釋放，有助于微生物菌體在土壤中長期存活并定殖。Wu等[50]研究發(fā)現(xiàn)，接種微膠囊Rs-198菌劑不僅能顯著提高5 g/L鹽脅迫下的棉花植物的生物量，還可提高棉花的可溶性蛋白含量(19.47%)，由此可見，微膠囊化Rs-198的菌株可有效緩解鹽脅迫對棉花的危害。Pongsilp等[53]研究瓊脂固定化EnsiferfrediiLP2/20對甘藍(lán)生長以及對植物養(yǎng)分和土壤元素的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，接種固定化的E.frediiLP2/20后，增加了植物的干質(zhì)量，土壤有機(jī)質(zhì)以及全氮、磷、鉀、鈣、鎂、鐵和鋅等元素含量，降低了細(xì)菌總豐富度和多樣性。Chanratana等[54]研究發(fā)現(xiàn)，以殼聚糖固定化的MethylobacteriumoryzaeCBMB20能夠提高植物的干質(zhì)量、養(yǎng)分吸收(N、P、K和Mg2+)、光合效率和減少過量的Na+流入植物細(xì)胞，進(jìn)而降低Na+/K+的比值，改善了在鹽脅迫條件下生長的番茄植株根際環(huán)境。Wu等[55]研究了KlebsiellaoxytocaRs-5的微膠囊，相比于接種游離的Rs-5，接種微膠囊化菌劑的棉花籽在鹽脅迫條件下的發(fā)芽率提高了8.34%，有效緩解了鹽脅迫對作物的影響，同時(shí)棉花的葉綠素a、可溶性糖、丙二醛和脯氨酸含量均高于游離菌株處理的棉花植株。Wu等[4]以海藻酸鈉-淀粉-膨潤土為壁材制備的RaoultellaplanticolaRs-2微膠囊菌劑處理過的棉花植株，其干質(zhì)量和鮮質(zhì)量相比較于未處理的棉花分別提高了30.9%和13.0%，并且氮、磷含量分別增加了37.9%和61.9%，增加了棉花植株對氮和磷的吸收，從而促進(jìn)了作物的生長。

由于膠囊化菌劑制備過程的局限性，其應(yīng)用研究主要集中在盆栽和小范圍區(qū)域中，膠囊化菌劑的大批量生產(chǎn)和應(yīng)用研究是目前亟須解決的瓶頸問題。

5 結(jié)論與展望

相比于其他菌劑類型，微膠囊化可以提高被包封根際促生菌的存活率并達(dá)到控釋的目的，隨著微生物菌劑研究的深入，微膠囊化根際促生菌已經(jīng)展現(xiàn)了巨大的應(yīng)用前景和廣闊的市場價(jià)值。針對不同特性的根際促生菌選擇合適的膠囊化材料及方法進(jìn)行包封，能有效提高微膠囊得率和菌株的存活能力。在本文所綜述的幾種制備方法中，擠壓法操作簡單、成本較低，但所制得的膠囊粒徑較大；乳化法能夠靈活調(diào)控膠囊的大小，可用于制備粒徑較小的膠囊；噴霧干燥法所制得的微膠囊形狀均勻、呈球性好、水溶性好，但干燥過程中的高溫環(huán)境會(huì)影響不耐高溫的普通根際促生菌的存活，但適合芽孢桿菌屬菌株的微膠囊化。因此為提高微膠囊的制備效率，在實(shí)際操作中要根據(jù)根際促生菌種類選擇適合的制備方法。

為推動(dòng)促生菌劑的微膠囊菌劑的大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用，亟須開發(fā)適合微膠囊根際促生菌劑的制備工藝。海藻酸鹽是最常使用的壁材，加入黏土礦物能夠增加微膠囊的力學(xué)強(qiáng)度以減緩釋放速率，加入具有生物可降解性的殼聚糖、淀粉等壁材可調(diào)控釋放速率。因此，綜合各類壁材對釋放速率的影響，在生產(chǎn)微膠囊菌劑時(shí)考慮到各種材料的特性，進(jìn)行復(fù)合壁材微膠囊菌劑的開發(fā)并探索復(fù)合型壁材對釋放特性的調(diào)控機(jī)制，以達(dá)到理想的可控釋放效果是目前應(yīng)該被重點(diǎn)關(guān)注的。

微膠囊化菌劑在根際應(yīng)用的優(yōu)勢是毋庸置疑的，但是目前對于在不同氣候條件、土壤環(huán)境、作物生長下微膠囊化劑型的施入方式、施入時(shí)間及施入量對菌體在植物根際的定殖、存活、數(shù)量消長等規(guī)律以及對作物的產(chǎn)生效果等方面，國內(nèi)外均未見深入報(bào)道。對微生物菌體微膠囊的應(yīng)用技術(shù)以及控釋性能與微生物菌體在土壤和植物根際的定殖、存活和數(shù)量消長的相關(guān)性研究是今后重要研究方向。同時(shí)，根際促生菌劑微膠囊工業(yè)化生產(chǎn)也是未來的發(fā)展趨勢，對拓寬其在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用范圍和促進(jìn)其在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用效果具有重要的現(xiàn)實(shí)意義、生態(tài)效應(yīng)及社會(huì)效應(yīng)。