孔衛(wèi)青，凌 君，楊金宏

(安康學院 陜西省蠶桑重點實驗室, 陜西安康 725000)

?；ㄈ~卷葉病相關病毒(Mulberry Mosaic Leaf Roll-associated Virus，MMLRaV)寄生桑樹引起的桑花葉卷葉病，又稱?；ㄈ~型萎縮病，是桑樹的重大病害之一?；疾∩淙~脈有瘤狀突起，嚴重枝條停止伸長，葉片皺縮變小，葉緣卷曲，硬化早[1]。該病可以通過線蟲、嫁接等多種方式傳播[2]，在中國蠶桑產區(qū)發(fā)生普遍，浙江、江蘇、陜西、四川、重慶等國內主要蠶桑產區(qū)發(fā)病率從4.6%到76.9%，造成桑樹嚴重減產，每年春、秋二季損失桑葉約30000t，折合損失蠶繭約2300t。

MMLRaV屬于線蟲傳多面體病毒屬(Nepovirus)，該屬病毒平均直徑為27.84nm[3]，也有報道為28～30nm[4]，在植物體內以雙聯(lián)體病毒粒子存在，部分病毒伴生有衛(wèi)星RNA[5-7]。MMLRaV基因組由2條單鏈正義RNA組成，RNA1鏈有6309個編碼堿基，編碼2102個氨基酸，攜帶病毒復制及RNA穩(wěn)定的關鍵基因。RNA2鏈有3279個編碼堿基，編碼1092個氨基酸，N末端和C末端分別為運動蛋白基因(movement protein，MP)和外殼蛋白(coat protein，CP)基因[4]。其中MP基因控制病毒克服細胞壁的屏障，并從最初感染的細胞向其它部位擴散，即實現(xiàn)細胞間移動(短距離運輸)和通過維管束系統(tǒng)的長距離移動[8]。

CP基因編碼的病毒外殼蛋白是病毒唯一的結構蛋白，作為一種非細胞生命體，病毒的遺傳物質僅僅簡單的被CP蛋白包裹，因此，CP基因影響著病毒粒體的形成和穩(wěn)定性，其蛋白質外殼上的化學基團——抗原決定簇也決定了抗原特異性，影響其線蟲傳播特性和血清學特性，在病毒的侵染過程中扮演多種角色[8-9]。盧全有等[10]曾利用MMLRaV RNA2鏈C端CP基因的序列片段進行融合蛋白表達，并制備了多抗血清，但其沒有進行進一步應用。目前國內也沒有針對該病毒的純化試劑盒。為此本試驗對安康學院基地桑樹苗圃中的MMLRaV的RNA2鏈CP基因核心結構區(qū)的序列多樣性進行分析，并制備了優(yōu)勢基因型的多克隆抗體，偶聯(lián)Tosylactivated磁珠，建立了磁珠免疫qPCR方法，可用于MMLRaV的純化和檢測。

1 材料與方法

1.1 病毒來源

MMLRaV分離自陜西省蠶桑重點實驗室恒口基地桑樹苗圃，經(jīng)檢測病株中同時存在有356 nt的環(huán)狀小RNA病原桑花葉萎縮類病毒(Mulberry Mosaic Dwarf viroid，MMDVd)。

1.2 主要試劑

1.3 方 法

1.3.1 病毒CP基因的克隆 從感染MMLRaV?；ㄈ~卷葉病植株中隨機選5株，取葉片進行液氮速凍和研磨，后按試劑盒說明書使用北京天根植物RNA提取試劑盒提取總RNA，使用反轉錄試劑盒的隨機引物對總RNA進行反轉錄，并以此為模板，引物對A-CPF和A-CPR進行PCR擴增和TA克隆。每個樣本隨機選取10個陽性克隆進行測序。

1.3.2 序列多樣性分析及表達載體的構建 MEGA X軟件分析序列的多樣性[13]，根據(jù)優(yōu)勢序列設計引物SA-CPF和SA-CPR，利用同源重組方法將序列克隆至表達載體pET-28a-SUMO，重組質粒進行測序鑒定并轉化至菌株E.coliRosetta。

1.3.3 融合蛋白的誘導表達及可溶性分析 挑取陽性單克隆菌株至含50 μg/mL硫酸卡那霉素的LB培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.5～ 0.6，加入0.8 mmol IPTG，繼續(xù)誘導培養(yǎng)4 h。誘導后的培養(yǎng)液在 12 000 r/min離心5 min，所得沉淀加入50 mmol的PBS緩沖液重懸，并進行冰浴超聲裂解破碎。裂解破碎后的菌體于4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，上清與沉淀分別進行SDS-PAGE電泳，分析檢測誘導表達融合蛋白的可溶性。

1.3.4 包涵體的親和層析純化 配制含20 mmoL Tris(pH 8.0)，300 mmoL NaCl，8 M Urea，20 mmoL Imidazole的溶解緩沖液溶解包涵體，同時平衡鎳離子柱(Ni-IDA樹脂)，使用親和層析純化純白，最后用不同濃度咪唑的平衡緩沖液洗脫目標蛋白，收集各洗脫組分進行SDS-PAGE分析檢測，使用Bradford蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。

1.3.5 抗體制備與檢測 檢測合格的蛋白質進行抗體制備與純化。分別于1、12、26、40、54 d注射日本大耳白兔，初次0.3 mg免疫劑量，利用完全弗氏佐劑，后續(xù)每次0.15 mg蛋白質，利用不完全弗氏佐劑，66 d采血，利用抗原親和法純化抗體。將抗體稀釋1 000倍，與10、5、1、0.5 ng原核表達的蛋白質抗原進行Western blot反應，分析抗體對不同濃度抗原的檢測能力。將誘導表達的CP蛋白抗原(500 ng/mL)包被酶聯(lián)板，ID-ELISA法測定所得抗體效價。

1.3.7 定量分析 利用Random6引物對病毒提取液和純化的病毒2個樣本進行反轉錄，后以MMLRaV的RNA2為內參基因，定量PCR(Quantitative PCR，qPCR)方法檢測病毒提取液和純化病毒中背景桑樹基因組及伴生MMDVd含量的變化。利用2-ΔΔCt方法通過RNA2的預擴增Ct值調整樣本cDNA濃度[14]，使2個樣本間的Ct值差小于1，以此為模板，檢測2樣本中桑樹Actin基因、TUB2基因和MMDVd的含量。

2 結果與分析

2.1 CP基因序列克隆及多樣性分析

利用bepipred 2.0軟件[11]基于序列的random forest模型預測MMLRaV CP蛋白表位抗原，結果顯示位于127-328區(qū)段的氨基酸，分值大于0.5的位點較多，抗原性較好，可以用于誘導抗體(圖1)。對該區(qū)段進行PCR擴增和克隆測序，去除引物位點后獲得692個核苷酸位點。MEGA X分析序列多樣性，結果50條序列有19個克隆株，其中CP16含序列數(shù)最多10條，是優(yōu)勢序列(圖2)。進一步分析序列有75個多態(tài)性位點，其中7個位點的突變造成了6個氨基酸的變化，可翻譯為5條相似的氨基酸序列，分析顯示各氨基酸的變化對CP蛋白抗原性的影響不顯著，因此以優(yōu)勢序列CP16為模板制備抗體。

2.2 重組表達載體的構建與融合蛋白的誘導表達

同源重組方法將CP基因克隆至原核表達載體pET-28a-SUMO，其中含有6×His標簽，用于表達的融合蛋白的純化。經(jīng)測序鑒定正確的重組質粒pET-28a-SUMO-H16轉化大腸桿菌E.coliRosetta進行CP蛋白誘導表達。分別對未誘導表達、誘導表達、裂解上清和沉淀進行SDS-PAGE電泳檢測，結果顯示全菌和沉淀組分均在38kda附近出現(xiàn)特異性目標蛋白，目標蛋白主要以包涵體形式存在(圖3)。

2.3 蛋白純化與抗體的制備

使用親和層析(Ni-IDA 樹脂)鎳離子柱對表達的包涵體蛋白進行純化，SDS-PAGE檢測洗脫組分中蛋白的純度和含量(圖3)，測定洗脫組分的蛋白質量濃度為4 mg/mL，純度和濃度達到免疫要求，注射免疫日本大耳左兔制備抗體，所得抗體質量濃度為2.77 mg/mL。Western雜交顯示抗體稀釋1 000倍可以檢測到500 pg抗原(圖4)，所得抗體質量濃度為2.77 mg/mL。ID-ELISA測定抗體效價，結果血清稀釋512 000倍，其P/N值(OD405抗血清/OD405陰性血清)仍大于2.0(稀釋1∶64 000后的OD405陰性血清均按0.060)，表明抗體效價在1/512 000以上(圖5)。

2.4 抗體對桑花葉卷葉病相關病毒純化效果 檢測

利用偶聯(lián)Tosylactivated磁珠的抗體與病毒提取液進行孵育，通過抗體抗原之間的非共價的特異性結合純化樣本中的病毒。以MMLRaV RNA2為內參進行qPCR分析(通過認為調整至相同濃度)，結果顯示MMDVd在病毒提取液和純化后的病毒樣本中的含量較為接近，而桑樹基因TUB2和actin在純化前后的病毒提取液中的差異較大，分別達631和127倍(圖6)，說明該純化方法極大的減少宿主的RNA，病毒純化效果較好。

3 討 論

與DNA的復制相比，RNA病毒的復制沒有錯配修復程序，因此其基因組的多樣性較高。針對此類基因組突變高的微生物，Tettelin等[15]2005年提出了微生物泛基因組(pan-genome)概念，即某一物種全部基因的總稱。本研究分析的MMLRaV的CP基因的692 bp的序列中，5個隨機樣本的50條克隆序列中有19個克隆株，75個多態(tài)性位點，6個氨基酸的變化，多樣性遠高于植物DNA病毒[16]。本研究選擇了CP16優(yōu)勢序列為模板制備抗體，能夠最大程度的降低抗體的 脫靶。

木本植物病毒的含量較低，難以純化，植物檢疫特異性差，錯誤率較高。蛋白質的磁珠分離是以磁珠為介質的蛋白質分離技術，通過在磁珠表面修飾離子交換基團或親和配基等，與目標蛋白質產生特異性吸附作用分離蛋白質[17]。B細胞分為線性和構象性2種，包涵體可以誘導線性B細胞抗體[18]。本研究利用原核表達技術可以大量獲得MMLRaV外殼蛋白的包涵體的表達，避免了直接純化病毒制備抗血清寄主蛋白、以及病毒量低、穩(wěn)定性差等問題的影響。制備的抗體可用于MMLRaV的血清學檢測[10]，抗體交聯(lián)免疫磁珠用于MMLRaV病毒的純化可以顯著減少宿主RNA，獲得純度較高的病毒樣本。

類病毒和衛(wèi)星RNA都是大小為246～401 bp的環(huán)狀單鏈RNA分子，二者的有相似的結構和復制機制，區(qū)別在于類病毒有致病作用，不依賴植物體內宿主病毒的存在，而衛(wèi)星RNA是線蟲傳多面體病毒屬的伴生RNA[5-7]。MMDVd是在桑樹中發(fā)現(xiàn)的環(huán)狀單鏈RNA病原，對于其準確的生物學地位迄今尚未定論[19-20]。MMLRaV屬于線蟲傳多面體病毒屬(Nepovirus)，本試驗利用MMLRaV RNA2作內參，發(fā)現(xiàn)兩個宿主的看家基因純化前后的變化較大，而MMDVd的變化較小，說明其與MMLRaV可能存在某種伴生關系。