安紅衛(wèi)， 宋勤飛， 牛素貞

(貴州大學(xué) 茶學(xué)院， 貴州 貴陽(yáng) 550025)

茶是世界上三大飲料中有益人體健康的飲品[1-2]，具有很高的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值。茶的豐富風(fēng)味由近700種生物活性化合物組成，如兒茶素、茶氨酸、咖啡因和揮發(fā)物[3-4]。茶樹(shù)[Camelliasinensis(L.)O. Kuntze]，原產(chǎn)中國(guó)西南地區(qū)，而貴州位于茶樹(shù)原產(chǎn)地的中心地帶[5-6]，該地區(qū)獨(dú)特的地貌特征、多樣的氣候、豐富的降水及茶樹(shù)的異花授粉特性，保存了豐富的野生茶樹(shù)、古老地方品種和具有不同形態(tài)特征的現(xiàn)代地方品種[7]，因此對(duì)貴州境內(nèi)茶樹(shù)種質(zhì)資源的分布狀況及遺傳多樣性的研究具有重要意義。本研究采用EST-SSR分子標(biāo)記，對(duì)貴州省境內(nèi)的144份茶樹(shù)種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性、群體結(jié)構(gòu)及遺傳分化分析，探索貴州茶樹(shù)種質(zhì)資源的分布規(guī)律及保護(hù)與利用方向。

1 材料與方法

1.1 材料

以144份貴州茶樹(shù)種質(zhì)資源為材料(表1)。參考陳亮[8]提出的茶樹(shù)分類(lèi)系統(tǒng)，144份茶樹(shù)種質(zhì)資源包含有14個(gè)禿房茶(C.gymnogyna)，80個(gè)茶[C.sinensis(L.) O. Kuntze]，39個(gè)大廠茶[C.tachangensis(F.C.Zhang)]，11個(gè)疑似大理茶[C.taliensis(W.W.Smith)]；海拔500～1 000 m有23個(gè)，海拔1 000～1 300 m有59個(gè)，海拔1 300～1 500 m有34個(gè)，海拔1 500 m以上有28個(gè)；根據(jù)地區(qū)分類(lèi)則黔中地區(qū)11個(gè)，黔北地區(qū)36個(gè)，黔南地區(qū)27個(gè)，黔東南地區(qū)18個(gè)，黔西南地區(qū)52個(gè)。

表1 一百四十四份貴州茶樹(shù)種質(zhì)資源信息

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1茶樹(shù)基因組DNA提取及EST-SSR引物的選擇

采用改進(jìn)的CTAB法[9]提取144個(gè)茶樹(shù)種質(zhì)資源基因組DNA。所用引物(表2)參考喬婷婷等[10-11]研究中的引物，從中共篩選出68條多態(tài)性好、條帶清晰的引物開(kāi)展研究。

表2 SSR引物信息

1.2.2 EST-SSR擴(kuò)增技術(shù)體系及產(chǎn)物檢測(cè)

參考劉本英[12]的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在DYY-6C電泳儀和垂直電泳槽DYCZ-30上進(jìn)行凝膠電泳，120 V電壓下電泳120 min，電泳后銀染顯色。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理及分析

將清晰條帶記為“1”，無(wú)帶或不易分辨的弱帶記為“0”，建立0、1數(shù)據(jù)庫(kù)。使用Popgene(version 1.31)計(jì)算有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s遺傳多樣性(H)、Shannon信息指數(shù)(I)、遺傳分化程度(Ht)、群體內(nèi)基因多樣性(Hs)、群體間遺傳分化系數(shù)(Gst)、基因流(Nm)等信息；使用Structure分析種群結(jié)構(gòu)，根據(jù)daltaK和LNP(K)確定群體K的數(shù)量，連續(xù)運(yùn)行K=1～9估計(jì)重復(fù)之間的方差，確定最優(yōu)種群數(shù)量。每次運(yùn)行的Burn-in period設(shè)置為30 000，重復(fù)100 000次，每個(gè)K值重復(fù)計(jì)算3次；使用DARWIN制作主成分分析圖和聚類(lèi)分析圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳多樣性分析

通過(guò)對(duì)144份茶樹(shù)種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析，結(jié)果顯示(表3)，4個(gè)種中茶的多態(tài)性位點(diǎn)百分率和Shannon’s 指數(shù)最高，禿房茶的有效等位基因數(shù)和Nei’s遺傳多樣性最高，疑似大理茶多態(tài)性位點(diǎn)百分率、有效等位基因數(shù)、Shannon’s 指數(shù)以及Nei’s遺傳多樣性最低；5個(gè)地區(qū)中黔北的有效等位基因數(shù)、Nei’s遺傳多樣性、Shannon’s 指數(shù)最高，其次是黔西南的Nei’s遺傳多樣性和Shannon’s較高，黔中的有效等位基因數(shù)、Nei’s遺傳多樣性、Shannon’s 指數(shù)最低；4個(gè)海拔范圍中1 000～1 300 m的有效等位基因數(shù)、Shannon’s 指數(shù)最高，海拔范圍1 300～1 500 m的Nei’s遺傳多樣性最高，海拔1 500 m以上的有效等位基因數(shù)、Nei’s遺傳多樣性、Shannon’s 指數(shù)最低。

表3 茶樹(shù)種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析

2.2 群體結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)對(duì)144份貴州茶樹(shù)種質(zhì)資源的群體結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果顯示(圖1-A)，隨著K值的增加，MeanlnP(K)值也持續(xù)增加，且當(dāng)K=2時(shí)，ΔK值最大，出現(xiàn)明顯的峰值，表明144份茶樹(shù)種質(zhì)資源有兩個(gè)祖先(圖1-B)。遺傳組分(Q值)≥0.8[13]表示該材料的遺傳背景相對(duì)比較單一，遺傳組分(Q值)<0.8屬于混合祖先，因此，本研究的群體被分為2個(gè)祖先組和1個(gè)混合祖先組，分別被命名為Gro1、Gro2、Gro3。

圖1 一百四十四份茶樹(shù)種質(zhì)資源遺傳結(jié)構(gòu)分析

Gro1共28份材料(圖2-A)，根據(jù)種包含19份大廠茶(67.86%)、5份禿房茶(17.86%)、4份疑似大理茶(14.29%)；根據(jù)海拔范圍包括海拔1 500 m以上有17份(60.71%)、海拔范圍500～1 000 m有2份(7.14%)、海拔范圍1 000～1 300 m有5份(17.86%)、海拔范圍1 300～1 500 m有4份(14.29%)；根據(jù)地區(qū)包含黔西南材料17份(60.71%)、黔北材料7份(25.00%)、黔南材料4份(14.29%)。Gro2共76份材料(圖2-B)，根據(jù)種包含70份茶(92.11%)、3份禿房茶(3.95%)，2份疑似大理茶(2.63%)；根據(jù)海拔范圍包括海拔1 000～1 300 m有41份(53.95%)、海拔范圍500～1 000 m有18份(23.68%)、海拔范圍1 300～1 500 m有16份(21.05%)、海拔范圍1 500 m以上有1份(1.32%)；根據(jù)地區(qū)包含黔北材料19份(25.00%)、黔南材料16份(21.05%)、黔東南材料16份(21.05%)、黔西南材料16份(25.00%)、黔中材料9份(11.84%)。Gro3共40份材料(圖2-C)，根據(jù)種包含19份大廠茶(47.50%)、10份茶(25.00%)、6份禿房茶(15.00%)、5份疑似大理茶(12.50%)；根據(jù)海拔范圍包括海拔范圍500～1 000 m有3份(7.50%)、海拔范圍1 000～1 300 m有13份(32.50%)、海拔范圍1 300～1 500 m有14份(35.00%)、海拔范圍1 500 m以上有10份(25.00%)；根據(jù)地區(qū)包含黔西南材料19份(47.50%)、黔北材料10份(25.00%)、黔南材料7份(17.50%)、黔東南材料2份(5.00%)、黔中材料2份(5.00%)。主成分分析結(jié)果顯示(圖3)，Gro1分布在縱坐標(biāo)的右邊，Gro2分布在縱坐標(biāo)的左邊，Gro3分散在縱坐標(biāo)中間，進(jìn)一步驗(yàn)證了Structure群體結(jié)構(gòu)分析的準(zhǔn)確性。NJ聚類(lèi)分析結(jié)果顯示，盡管部分種質(zhì)資源被分到其他組，大部分的材料聚類(lèi)結(jié)果(圖4)與Structure群體結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果基本一致。

A、B、C分別為Gro1、Gro2、Gro3。

圖3 一百四十四份茶樹(shù)種質(zhì)資源主成分分析圖

A. 綠色，Gro1；藍(lán)色，Gro2；紅色，Gro3。B. 紅色，禿房茶；紫色，茶；綠色，大廠茶；藍(lán)色，疑似大理茶。C. 藍(lán)色，500～1 000 m；紅色，1 000～1 300 m；紫色，1 300～1 500 m；綠色，1 500 m以上。

2.3 遺傳距離分析

通過(guò)對(duì)144份貴州茶樹(shù)種質(zhì)資源的遺傳距離分析，結(jié)果顯示(表4)，4個(gè)種間的遺傳距離變化范圍為0.017 8～0.038 9，其中禿房茶群體與疑似大理茶群體的遺傳距離最大，其次禿房茶群體與茶群體間的遺傳距離較大，茶群體與大廠茶群體的遺傳距離最??；地區(qū)間的遺傳距離分析結(jié)果顯示(表5)，5個(gè)分布地區(qū)的遺傳距離范圍為0.007 8～0.032 4，其中黔西南與黔中的遺傳距離最大，其次為黔南和黔中，黔南和黔北的遺傳距離最?。徊煌０伍g遺傳距離分析結(jié)果顯示(表6)，4個(gè)海拔范圍的遺傳距離范圍為0.006 6～0.025 6，海拔范圍在1 500 m以上和500～1 000 m的遺傳距離最大，其次為1 500 m和1 000～1 300 m，海拔范圍1 000～1 300 m和1 300～1 500 m的遺傳距離最小。

表4 不同茶樹(shù)種質(zhì)資源的遺傳距離

表5 不同地區(qū)茶樹(shù)種質(zhì)資源的遺傳距離

表6 不同海拔范圍茶樹(shù)種質(zhì)資源的遺傳距離

2.4 遺傳分化分析

通過(guò)對(duì)144份貴州茶樹(shù)種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳分化分析，結(jié)果表明(表7)，遺傳分化程度Ht值在種間最高為0.199 6，在地區(qū)間最低為0.193 6；群體內(nèi)基因多樣性Hs值在海拔間最高為0.184 8，在地區(qū)間最低為0.180 5；遺傳分化系數(shù)Gst值在種間最高為0.079 7，在海拔間最低為0.047 0，說(shuō)明遺傳變異主要來(lái)自于群體內(nèi)的個(gè)體間；基因流Nm值在海拔間最高為10.134 8，其次是地區(qū)間為6.885 2，種間基因流Nm值最低為5.774 1。說(shuō)明貴州不同海拔的茶樹(shù)種質(zhì)資源間基因交流最為頻繁，其次是不同地區(qū)間，種間相對(duì)較小。

表7 茶樹(shù)種質(zhì)資源的遺傳分化分析

3 討論

3.1 遺傳多樣性分析

本研究用EST-SSR引物研究了貴州境內(nèi)的茶樹(shù)種質(zhì)資源，引物的平均多態(tài)信息為0.338 4，屬于中等水平[14]，10對(duì)引物的多態(tài)性較高(PIC>0.5)，55對(duì)引物的多態(tài)性適中(0.2

3.2 群體結(jié)構(gòu)分析

張明澤等[18-20]的研究結(jié)果顯示，茶樹(shù)不是按地理來(lái)源進(jìn)行聚類(lèi)。本研究將144份茶樹(shù)種質(zhì)資源按海拔范圍及種都可以分為3類(lèi)，Gro1主要是分布海拔1 500 m以上的大廠茶群體，Gro2主要是分布在海拔范圍1 000～1 300 m的茶群體。對(duì)材料的來(lái)源地分析結(jié)果顯示，與材料來(lái)源地沒(méi)有明顯的相關(guān)性，這與前人的研究結(jié)果一致。大廠茶和禿房茶被聚為一類(lèi)(圖3-B)，可能大廠茶和禿房茶都是屬于野生型茶樹(shù)有關(guān)系，而栽培型茶被分為另外一個(gè)群體。本研究中對(duì)4個(gè)種的海拔分布分析結(jié)果顯示，大廠茶主要分布在海拔1 300 m以上，茶分布在海拔1 500 m以下，禿房茶主要分布在海拔1 300 m以下。本研究的群體結(jié)構(gòu)分析結(jié)果對(duì)貴州茶樹(shù)品種的選育及栽培具有一定的指導(dǎo)意義。

3.3 遺傳距離分析

陳亮[21]研究認(rèn)為，原始茶組植物演化線路分兩條線路，一條是大廠茶向禿房茶方向演化，另一條為疑似大理茶向茶方向演化。本研究對(duì)144份貴州茶樹(shù)種質(zhì)資源按種進(jìn)行遺傳距離分析結(jié)果顯示，大廠茶與禿房茶遺傳距離最小，親緣關(guān)系最近，禿房茶與疑似大理茶及茶的遺傳距離較大，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，印證了第一條演化路線。但本研究發(fā)現(xiàn)茶和大廠茶的遺傳距離最小，親緣關(guān)系最近，茶和疑似大理茶的遺傳距離較小，親緣關(guān)系較近，與該研究的第二條演化路線結(jié)果不符，這可能與本研究中疑似大理茶的數(shù)量相對(duì)較少有關(guān)系。

貴州姑菁野生茶樹(shù)形態(tài)多樣性及相關(guān)性研究顯示[22]，茶樹(shù)葉、果器官與海拔范圍呈極顯著相關(guān)并表現(xiàn)出差異性，楊亞軍等[23-24]認(rèn)為，云貴高原可能為茶樹(shù)的生態(tài)演化區(qū)， 其分布、演化受氣候條件影響，貴州野生茶樹(shù)資源地理分布和形態(tài)特征與氣候要素的關(guān)系[25]中認(rèn)為氣候影響了貴州茶樹(shù)資源的分布、演化及部分形態(tài)特征。本研究發(fā)現(xiàn)，茶樹(shù)種質(zhì)資源的海拔范圍差距越大，遺傳距離越大，親緣關(guān)系越遠(yuǎn)，即遺傳距離與海拔范圍呈正相關(guān)關(guān)系，本研究進(jìn)一步說(shuō)明貴州野生茶樹(shù)種質(zhì)資源的分布可能與海拔有關(guān)，為更進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)貴州野生茶樹(shù)種質(zhì)資源的演化和分布規(guī)律奠定基礎(chǔ)。

3.4 遺傳分化分析

估算群體間的遺傳分化系數(shù)可區(qū)分群體間和群體內(nèi)相對(duì)遺傳變異大小，是解釋群體遺傳變異程度的主要依據(jù)[26]。群體多樣性水平或分化程度差異的可能原因在于選擇、基因流、隔離或隨機(jī)漂變等。Curnow等[27]認(rèn)為Nm大于1，則表明基因流是影響群體遺傳分化的主要原因，基因流動(dòng)可以消除因地理或生殖隔離導(dǎo)致的不同地方群體甚至是物種間的遺傳差異，減小種間或種內(nèi)群體間的分化程度，進(jìn)一步提高群體或物種的多樣性和適應(yīng)力。有研究結(jié)果表明，西雙版納[28]不同地理區(qū)域的古茶樹(shù)基因流Nm為1.624，城步峒茶[29]不同地理群體間的基因流Nm為7.01，南江大葉茶樹(shù)[30]不同分布區(qū)域群體間基因流Nm為3.554 9，前人的研究表明，茶樹(shù)群體之間存在較強(qiáng)的基因流。本試驗(yàn)研究結(jié)果顯示，貴州野生茶樹(shù)遺傳變異主要來(lái)自于群體內(nèi)的個(gè)體間，群體間遺傳分化系數(shù)與基因流之間呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，在不同海拔群體間的基因流值Nm為10.134 8、不同地區(qū)群體間的基因流Nm為6.885 2、種間的基因流Nm為5.774 1，說(shuō)明貴州茶樹(shù)群體之間存在較強(qiáng)的基因流，基因流影響了茶樹(shù)群體的遺傳結(jié)構(gòu)，即較高的遺傳多樣性主要存在于茶樹(shù)群體內(nèi)，茶樹(shù)群體間的遺傳分化較低。這種遺傳變異可能與茶的傳播方式有關(guān)。茶樹(shù)異花授粉，花期從6月初持續(xù)到12月末，花粉小，以蟲(chóng)媒為主，可以進(jìn)行長(zhǎng)距離傳播。貴州地勢(shì)由西向東傾斜，夏秋季節(jié)盛行西南季風(fēng)及西風(fēng)，也有利于茶樹(shù)花粉的長(zhǎng)距離傳播，這是茶樹(shù)長(zhǎng)期進(jìn)化適應(yīng)生態(tài)環(huán)境的結(jié)果。同時(shí)貴州山多地少，這里的人民順應(yīng)山勢(shì)地形建造房屋，開(kāi)展日常生活以及進(jìn)行茶的貿(mào)易活動(dòng)，都有助于茶樹(shù)種子的長(zhǎng)距離傳播。茶長(zhǎng)期適應(yīng)生態(tài)環(huán)境及人類(lèi)活動(dòng)的共同結(jié)果導(dǎo)致茶樹(shù)群體間存在較大基因流，減弱了群體間的分化。