張 濤，張 瑞，張雅倫，許苗苗，王 慧，陳 晨，周 巍,2,*，史國華,*

（1.河北省食品檢驗(yàn)研究院，河北省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050200；2.河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北 石家莊 050000）

含乳特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品是指以生鮮牛（羊）乳及其制品為原料，經(jīng)工業(yè)加工制備，滿足進(jìn)食受限、消化吸收障礙、代謝紊亂或特定疾病狀態(tài)人群對營養(yǎng)素或膳食特殊需要的乳制品，為特殊人群強(qiáng)化骨骼[1]、改善神經(jīng)發(fā)育和認(rèn)知功能[2]、增強(qiáng)免疫力[3]等提供營養(yǎng)物質(zhì)。然而，含乳特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品易被微生物污染，引起食物中毒，對人體健康造成嚴(yán)重危害，對社會造成不良影響[4]。在引起含乳特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中毒的食源性致病菌中沙門氏菌占比較大。沙門氏菌可引起傷寒、副傷寒、胃腸炎、敗血癥和局部感染等疾病[5-6]?，F(xiàn)已發(fā)生多起含乳特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品感染沙門氏菌引起的腹瀉中毒事件。2019年2月，法國公共衛(wèi)生部門宣布在嬰幼兒米粉中檢測到沙門氏菌，造成26 名嬰幼兒中毒[7]?？梢?，沙門氏菌致病性強(qiáng)，是引起含乳特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中毒的重要致病菌[8-9]。

由于監(jiān)督不嚴(yán)、檢驗(yàn)體系不科學(xué)，造成食品安全問題不斷出現(xiàn)。目前，含乳特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中沙門氏菌的檢測方法主要有傳統(tǒng)血清分型檢驗(yàn)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)[10-12]、免疫學(xué)檢測法[13]、近紅外技術(shù)及納米技術(shù)[14]。以上方法具有檢測周期長、操作繁瑣、結(jié)果判定誤差大等諸多弊端。因此，建立快速、有效的含乳特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中沙門氏菌檢驗(yàn)方法具有重要意義。

基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（matrixassisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）是近年發(fā)展起來的用于病原微生物快速鑒定的一種方法[15-16]，可以實(shí)現(xiàn)對未知微生物的快速鑒定、分型、溯源等[17-19]。目前，MALDITOF-MS技術(shù)可以鑒定金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、宋內(nèi)志賀菌、單增李斯特菌、大腸桿菌及厭氧菌，并取得較好的分析結(jié)果[20-24]。國內(nèi)對基于MALDI-TOF-MS技術(shù)檢驗(yàn)沙門氏菌陽性物質(zhì)的研究較少，為更加便捷、快速檢測出含乳特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中沙門氏菌，本研究自制即用型沙門氏菌質(zhì)控樣品，驗(yàn)證該質(zhì)控樣品在含乳特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中沙門氏菌檢驗(yàn)中的應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（CMCC 50959） 中國食品藥品檢定研究院。

無水乙醇、甲酸、乙腈（均為質(zhì)譜純） 天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；質(zhì)譜樣品處理基質(zhì) 德國布魯克科技有限公司；TSA培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MALDI-TOF/TOF 7090質(zhì)譜儀 日本島津公司；MIR-254低溫恒溫培養(yǎng)箱 日本Sanyo公司；ME204電子天平 瑞士Mettler-Toledo公司；3K15臺式離心機(jī)德國Sigma公司；VITEK 2 Compact全自動細(xì)菌鑒定儀法國生物梅里埃公司。

1.3 方法

1.3.1 即用型沙門氏菌質(zhì)控樣品制備及檢測

1.3.1.1 制備過程

在超純水中加入蔗糖、葡聚糖、牛血清白蛋白，質(zhì)量濃度分別為15、8、5 g/100 mL，制得保護(hù)劑。將沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株劃線接種于PCA培養(yǎng)基，36 ℃培養(yǎng)24 h；用無菌棉簽從平板上刮取菌苔放入生理鹽水中，混懸于凍干保護(hù)劑中，測得菌懸液麥?zhǔn)蠞岫葹?.5 MCF；向每個含有干燥劑的西林瓶中加滿液氮并滴加100 μL菌懸液，放入真空冷凍干燥機(jī)。待樣品充分干燥后取出，密封壓蓋冷藏。

1.3.1.2 計(jì)數(shù)方法

取出未開啟的凍干菌球瓶，放置至室溫，用酒精棉球擦拭鋁塑蓋和膠塞并開啟。將凍干菌球放入10 mL無菌水中，稀釋，傾注適量TSA培養(yǎng)基，放置于36 ℃培養(yǎng)箱24 h，計(jì)數(shù)。

1.3.1.3 MALDI-TOF-MS檢驗(yàn)

取出未開啟的凍干菌球瓶，放置至室溫，用酒精棉球擦拭鋁塑蓋和膠塞并開啟；將菌球取出，放置于2 mL離心管，加入100 μL無菌水，振蕩1 min，12 500 r/min離心5 min，棄去上清液，沉淀中加入100 μL無菌水，重復(fù)離心3 次；離心所得沉淀中加入50 μL體積分?jǐn)?shù)70%甲酸，振蕩2 min，再加入50 μL乙腈，振蕩2 min，吸取1 μL上清液滴到靶板上，室溫晾干后覆蓋1 μL基質(zhì)，晾干，放入質(zhì)譜儀。

在質(zhì)荷比（m/z）2 000～20 000 Da進(jìn)行檢測。根據(jù)MALDI-TOF-MS分析得出的特征性質(zhì)譜圖分析沙門氏菌裂解后特異性蛋白質(zhì)或多肽離子峰，實(shí)現(xiàn)區(qū)分和鑒定的目的。

1.3.2 質(zhì)控樣品均勻性研究

隨機(jī)抽取沙門氏菌凍干標(biāo)準(zhǔn)樣品20 瓶，向每瓶標(biāo)準(zhǔn)樣品中加入1 mL生理鹽水，將凍干樣品充分溶解，使用全自動微生物螺旋加樣系統(tǒng)在E50模式下涂布于PCA平板，每個樣品做2 個平行。置于（36±1） ℃培養(yǎng)24 h，對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，評價樣品的均勻性。

1.3.3 質(zhì)控樣品穩(wěn)定性研究

運(yùn)輸條件模擬實(shí)驗(yàn)：將沙門氏菌質(zhì)控樣品分成2 份，其中一份放置于37 ℃培養(yǎng)箱，另一份放置于25 ℃培養(yǎng)箱，分別在貯藏0、1、3、5、7、14 d取出質(zhì)控樣品，按照1.3.1.2節(jié)步驟計(jì)數(shù)，并作3 次平行實(shí)驗(yàn)。

貯存條件模擬實(shí)驗(yàn)：將沙門氏菌質(zhì)控樣品分成2 份，其中一份放置于4 ℃冰箱，另一份放置于－20 ℃冰箱，分別在貯藏0、1、3、5、7、14、28 d取出質(zhì)控樣品，按照1.3.1.2節(jié)步驟計(jì)數(shù)，并作3 次平行實(shí)驗(yàn)。復(fù)蘇率按下式計(jì)算。

1.3.4 沙門氏菌質(zhì)控樣品鑒定

將菌球放入25 g無菌乳粉中，按照GB 4789.4—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)》進(jìn)行后續(xù)培養(yǎng)，用VITEK2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)鑒定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SSPS軟件，采用單因素方差分析對20 瓶沙門氏菌質(zhì)控樣品均勻性檢測結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 即用型沙門氏菌質(zhì)控樣品

本研究制得沙門氏菌質(zhì)控樣品為白色圓球狀，西林瓶密封性良好，干燥劑未變色，水分去除完全，符合所需要求，可做為后續(xù)實(shí)驗(yàn)樣品。

2.2 沙門氏菌質(zhì)控樣品均勻性檢測結(jié)果

對20 瓶沙門氏菌質(zhì)控樣品進(jìn)行檢測。由表1可知，各樣品菌落數(shù)相差極小，平行性良好，各樣品間菌落數(shù)沒有明顯差異。

表1 20 瓶沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稀釋10 倍計(jì)數(shù)結(jié)果Table 1 Counting results of 20 bottles of Salmonella standard

均勻性FINV（0.05，19，20）臨界值=2.137，由表2可知，根據(jù)SPSS軟件計(jì)算所得結(jié)果，F(xiàn)=0.804＜FINV（0.05，19，20）臨界值，表明在0.05顯著水平，該樣品符合均勻性的要求。

表2 沙門氏菌質(zhì)控樣品均勻性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Uniformity of Salmonella quality control samples

2.3 沙門氏菌質(zhì)控樣品穩(wěn)定性檢測結(jié)果

=3）Table 3 Stability of 10-fold diluted Salmonella quality control samples under simulated transport conditions (n = 3)表3 沙門氏菌質(zhì)控樣品稀釋10 倍模擬運(yùn)輸條件實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n

由表3可知，在37 ℃和25 ℃環(huán)境中，每個沙門氏菌質(zhì)控樣品菌數(shù)相差較小，14 d內(nèi)能保持良好穩(wěn)定性。所以高溫環(huán)境可采用泡沫箱加冰袋運(yùn)輸，常溫環(huán)境可直接運(yùn)輸。

=3）Table 4 Stability of 10-fold diluted Salmonella quality control samples under simulated storage conditions (n = 3)表4 沙門氏菌質(zhì)控樣品稀釋10 倍模擬貯存條件實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n

對沙門氏菌質(zhì)控樣品進(jìn)行－20 ℃和4 ℃貯藏穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)為期28 d。由表4可知，－20 ℃環(huán)境下貯藏28 d復(fù)蘇率為92.17%，沙門氏菌質(zhì)控樣品穩(wěn)定性良好，根據(jù)以往對沙門氏菌質(zhì)控樣品的制備經(jīng)驗(yàn)，在－20 ℃條件下可以保存長達(dá)18 個月；4 ℃環(huán)境下，貯藏28 d復(fù)蘇率為90.43%，可以作為短期貯藏條件。

2.4 沙門氏菌質(zhì)控樣品MALDI-TOF-MS檢測結(jié)果

驗(yàn)證質(zhì)控樣品低溫、長時間保藏后的作用效果。測得于－20 ℃貯藏0、14、28 d質(zhì)控樣品的質(zhì)譜圖，由圖1～3可知，比較3 次所得質(zhì)譜圖可知，離子峰出現(xiàn)位置基本相同，信號穩(wěn)定。沙門氏菌質(zhì)控樣品變化極小，符合MALDI-TOF-MS質(zhì)控樣品要求。

圖1 貯藏0 d沙門氏菌質(zhì)控樣品質(zhì)譜圖Fig. 1 Mass spectrum of Salmonella quality control samples on day 0

圖2 貯藏14 d沙門氏菌質(zhì)控樣品質(zhì)譜圖Fig. 2 Mass spectrum of Salmonella quality control samples on day 14

圖3 貯藏28 d沙門氏菌質(zhì)控樣品質(zhì)譜圖Fig. 3 Mass spectrum of Salmonella quality control samples on day 28

2.5 沙門氏菌質(zhì)控樣品生化鑒定結(jié)果

由表5可知，VITEK2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)測定結(jié)果為沙門氏菌，可信度為99%，表明沙門氏菌質(zhì)控樣品未受污染，菌體未被破壞。

表5 沙門氏菌質(zhì)控樣品生化反應(yīng)鑒定結(jié)果Table 5 Biochemical identification results of Salmonella quality control samples

3 結(jié) 論

MALDI-TOF-MS鑒定是近幾年檢測微生物的新方法，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)方法和基因型鑒定方法的不足，逐漸被各檢測機(jī)構(gòu)認(rèn)可和應(yīng)用[25]。通過比較標(biāo)準(zhǔn)菌株圖譜得出結(jié)論，此方法操作便捷、結(jié)果直觀[26-27]。

本研究制得沙門氏菌質(zhì)控樣品具有良好的均勻性，在模擬運(yùn)輸穩(wěn)定性及貯存穩(wěn)定性中菌數(shù)變化較小，滿足日常運(yùn)輸條件并具有較長有效期。對－20 ℃貯藏0、14、28 d的沙門氏菌質(zhì)控樣品進(jìn)行質(zhì)譜檢測，結(jié)果顯示，質(zhì)控樣品鑒定質(zhì)譜圖相近，可作為日常實(shí)驗(yàn)對照。綜上所述，MALDI-TOF-MS即用型質(zhì)控樣品可為檢測含乳特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中沙門氏菌提供持續(xù)、有效的檢驗(yàn)依據(jù)。