王海東 林飛 林偉青

摘要 目的：觀察鼠曲草提取液對N-甲基亞硝基脲（MNU）誘發(fā)膀胱腫瘤的抑制作用，并初步探討其機制。方法：將120只SD大鼠按照隨機數(shù)字表法分為對照組、高、中、低劑量組4組，每組30只。經(jīng)膀胱內(nèi)灌注MNU（1 mg/次，1次/2周，共4次）誘發(fā)膀胱腫瘤，對照組正常飲水，高、中、低劑量組分別以高、中、低劑量鼠曲草提取液代水喂食，于第12周處死全部大鼠，取其膀胱組織標本，觀察其成瘤率。TUNEL法檢測腫瘤細胞調(diào)亡情況，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法檢測大鼠膀胱癌組織存活蛋白（Survivin）表達。結(jié)果：高、中、低劑量組大鼠膀胱癌成瘤率分別為60%（18/30）、75.86%（22/29）、86.21%（25/29），而對照組大鼠膀胱癌成瘤率為100%（28/28）。TUNEL法原位檢測發(fā)現(xiàn)鼠曲草提取液可顯著促進膀胱癌細胞的調(diào)亡，且與劑量相關(guān);大鼠膀胱癌組織Survivin表達顯示鼠曲草提取液可顯著降低大鼠膀胱癌組織中Survivin表達。結(jié)論：鼠曲草提取液對大鼠膀胱癌形成有明顯抑制作用。

關(guān)鍵詞 鼠曲草;膀胱癌;甲基亞硝基脲;存活蛋白;反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng);凋亡;成瘤率;黃酮類化合物

Abstract Objective：To observe the inhibitory effect of the gnaphalium affine extracts on the formation of N-methylnitrosourea（MNU）-induced bladder tumor in rats，and to initially explore its mechanism.Methods：A total of 120 SD rats were divided randomly into 4 groups，high，medium and low concentration group，with 30 cases in each group.Bladder tumor was induced by intravesical instillation of MNU（1 mg/ times，once every 2 weeks，4 times），inducing bladder tumors.The control group was given normal drinking water.High，medium and low doses groups were fed with high，medium and low concentration of the extract of gnaphalium affine extracts.All rats were killed at the 12th week，and their bladder tissue samples were taken to observe the difference in tumor formation rate.We took a specimen of its bladder tissue and observed its tumor formation rate.TUNEL method was used to detect the apoptosis of tumor cells.The expression of Survivin in rat bladder cancer tissues was detected by RT-PCR.Results：The tumor formation rate of bladder cancer in high，medium and low concentration groups was 60.11%（18/30），75.86%（22/29） and 86.21%（25/29） respectively，while the rate of bladder cancer in the control group was 100%（28/28）.In situ detection by TUNEL method，it was found that the gnaphalium affine extract can significantly promote the apoptosis of bladder cancer cells，which was related to the concentration; the expression of Survivin in rat bladder cancer tissues showed that the gnaphalium affine extract can significantly reduce the expression of survivin in rat bladder cancer tissues.Conclusion：The Gnaphalium affine extracts has a significant inhibitory effect on bladder cancer formation in rats.

Keywords Gnaphalium affine; Bladder cancer; N-methy-N-nitrosourea; Survivin; Reverse transcription polymerase chain reaction; Apoptosis; Tumor formation rate; Flavonoids

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.11.012

膀胱癌在我國是泌尿系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤，膀胱癌發(fā)病機制尚不明確，目前臨床治療膀胱癌大多采取切除膀胱以及膀胱灌注卡介苗，但膀胱癌復發(fā)率仍較高，目前尚無高效安全的預防治療措施[1]。因此發(fā)揮中醫(yī)藥的優(yōu)勢，尋求高效低毒的方法，近年來國內(nèi)外學者正積極研究探索有關(guān)防治方法，有關(guān)中藥抗腫瘤的研究近年來報道逐漸增多[2-3]。

鼠曲草（Gnaphalium affine D.Don）又名白艾、佛耳草、清明菜，是藥食兩用野生植物，在中國民間已有幾千年的使用歷史，廣泛用于各種疾病治療和保健。進一步研究開發(fā)其藥用價值有著十分重要的意義。本實驗嘗試通過動物實驗研究觀察比較鼠曲草提取液對大鼠膀胱癌形成是否存在抑制作用，初步探索鼠曲草對膀胱癌的預防機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選取10～12周齡無特定病原體（SPF）級雌性SD大鼠120只，體質(zhì)量200～220 g，購自南昌大學醫(yī)學院實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號：SYXK2010-0002。飼養(yǎng)于南昌大學醫(yī)學院實驗動物中心，溫度（20±2）℃，濕度40%～60%，12 h周期性光照環(huán)境，普通飼料喂養(yǎng)，自由飲食。該項目通過倫理審批委員會審批[倫理審批號：scxk（湘）2010-0002]。

1.1.2 試劑 N-甲基亞硝基脲（MNU）（Sigma公司，美國，批號：20130906），鼠曲草（江西醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院藥劑科中藥房，貨號：201609080016）。鼠曲草提取液水提取物的制備按水煎煮工藝由江西省人民醫(yī)院制劑室自制，濃度分別為2 mg/mL，4 mg/mL，8 mg/mL。TUNEL試劑盒（上海羅氏制藥有限公司，批號：20131217），安爾碘皮膚消毒劑（江西匯康實業(yè)有限公司，批號：20150908），水合氯醛（批號：20130506）、甲醛（批號：20140308）購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.1.3 儀器 顯微鏡（上海豫光儀器有限公司，型號：WMF-3580），多功能酶標儀（Tecan，瑞士，型號：Infinite 200 PRO），熒光定量PCR擴增儀（Roche，瑞士，型號：Light Cycler 480）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 所有SD大鼠使用前在實驗室喂養(yǎng)1周以適應(yīng)環(huán)境，按照隨機數(shù)字表法分為對照組、高、中、低劑量組4組，每組30只。以水合氯醛（濃度為10%，100 mg/kg）進行腹腔內(nèi)注射，麻醉起效后將大鼠固定于仰臥位，用安爾碘皮膚消毒劑消毒大鼠尿道外口，以長約5 cm的無菌硬膜外導管代替導尿管，涂抹無菌甘油后，行膀胱灌注MNU（劑量1 mg/mL），1 mL/次。1次/2周，共4次。

1.2.2 給藥方法 對照組正常飲水，高、中、低劑量組分別以高、中、低濃度鼠曲草提取液代水喂食。

1.2.3 檢測指標與方法 于第12周處死全部大鼠，取其膀胱組織標本，低溫生理鹽水洗凈，10%甲醛固定24 h，脫水，石蠟包埋，切片4～5 μm，行蘇木精-伊紅（HE）染色，置顯微鏡下觀察其病理變化。1）原位末端轉(zhuǎn)移酶標記TUNEL法檢測癌細胞凋亡：具體步驟按說明書進行，顯微鏡下凋亡細胞的細胞核呈現(xiàn)藍黑色為陽性，每張切片中隨機選擇5個高倍（200倍）鏡視野，在每個視野中分別計數(shù)100個細胞，每組中隨機選擇3張共1 500個細胞，同時統(tǒng)計其中所含的陽性細胞數(shù)。凋亡指數(shù)（%）=陽性細胞數(shù)/1 500×100%。2）Survivin檢測：通過Light Cycler 480熒光定量PCR擴增儀采用巢式RT-PCR相對定量法檢測膀胱癌大鼠腫瘤組織中Survivin（280 bp）特異性mRNA條帶并以β-actin（309 bp）為參照[4]。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，其中計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示;計量資料的統(tǒng)計采用方差分析，計數(shù)資料以百分率表示，采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組SD大鼠的膀胱癌成瘤率 實驗過程中，由于麻醉過量、感染和惡病質(zhì)，中、低劑量組大鼠各死亡1只，對照組死亡2只，對照組在第12周膀胱癌成瘤率為100%（28/28），高、中、低劑量組大鼠膀胱癌成瘤率分別為60%（18/30）、75.86%（22/29）、86.21%（25/29），比較各組膀胱癌成瘤率差異有統(tǒng)計學意義（P=0.027）。

2.2 鼠曲草提取液對細胞凋亡指數(shù)的影響 高、中、低劑量組大鼠膀胱癌細胞凋亡指數(shù)（此凋亡指數(shù)無單位，對照組數(shù)據(jù)后有%，高中低劑量組也有）分別為（12.424 2±0.282 6）%、（10.292 3±0.137 2）%、（8.577 8±0.143 5）%，對照組膀胱癌細胞凋亡指數(shù)為（4.083 3±0.105 7）%，組間方差分析顯示差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），另經(jīng)相關(guān)性分析顯示大鼠膀胱癌細胞凋亡指數(shù)與鼠曲草劑量正相關(guān)。

2.3 鼠曲草提取液對大鼠膀胱癌組織中Survivin表達的影響 高、中、低劑量組大鼠膀胱癌組織中Survivin表達陽性率分別為83.3%（15/18）;90.9%（20/22）;92%（23/25）;對照組膀胱癌組織中Survivin表達陽性率為100%（28/28），差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。而高、中、低劑量組大鼠膀胱癌組織中Survivin表達分別為0.352 7±0.029 9、0.557 5±0.026 5、0.820 9±0.048 9;對照組膀胱癌組織中Survivin表達強度為1.223 9±0.071 1，組間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），另經(jīng)相關(guān)性分析顯示大鼠膀胱癌組織中Survivin表達強度與鼠曲草劑量正相關(guān)。見圖1。

3 討論

膀胱癌已成為中國男性常見的惡性腫瘤，據(jù)調(diào)查，城市人口膀胱癌發(fā)病率（6.47/10萬）明顯高于農(nóng)村（4.30/10萬），這可能與城市人口和農(nóng)村人口的飲食差別有關(guān)[5]，值得我們深入研究探索。

鼠曲草在我國各地均盛產(chǎn)，以野生為主，也分布于日本、朝鮮、菲律賓、印度尼西亞、中南半島、澳大利亞等地。每年清明節(jié)前后，各地民間尤其是農(nóng)民，食用方法不一，但基本都是全草食用，可新鮮食用也可曬干貯存，或水煮或拌入米面或玉米面后可食用，故有“清明菜、清明果”之稱，是清明時節(jié)最早可食的野菜，營養(yǎng)豐富;同時具有食療的作用，可治療高血壓、支氣管炎、哮喘、風濕性腰痛等多種疾病，是民間十分喜愛的傳統(tǒng)營養(yǎng)健康的野生蔬菜，有“仙草”之稱。鼠曲草具體成分十分復雜，含氨基酸、黃酮類化合物、揮發(fā)油、豆甾醇、生物堿等，據(jù)相關(guān)研究報道，鼠曲草全草中所含的黃酮苷約為5%。黃酮類化合物經(jīng)國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤、抗氧化、抗突變、抗過敏、抗菌、抗病毒、抗炎、保護心腦血管系統(tǒng)和肝細胞的作用，還有殺蟲等非常廣泛的藥理作用，而且對人體毒性較低[6-7]。

Aritomi和Kawasaki[8]報道從鼠曲草花的甲醇提取物中分離鑒定出一種新發(fā)現(xiàn)的查耳酮：2′，4，4′-三羥基-6-甲氧基查耳酮（2′，4，4′-trihydroxy-6′methoxychalcone）和2種較常見黃酮類物質(zhì)：木犀草素（Luteolin）和木犀草素-4′-D-葡萄糖苷（Luteolin-4′-D-glucoside）。Morimoto等[9]研究發(fā)現(xiàn)從鼠曲草中分離提取得到黃酮類化合物有5-hydroxy-3，6，7，8-tetramethoxyflavone、5-hydroxy-3，6，7，8，4′-pentamethoxyflavone、4，4′，6′-trihydroxy-2′-methoxychalcone、5，6-dihydroxy-3，7-dimethoxy flavone等。Aquino等[10]報道從單花鼠曲草乙醇提取液中通過色譜分離和光譜方法，鑒定了一些肉桂酸衍生物和6種黃酮類化合物，它們分別是槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（Quercetin-3-O-β-D Glucopy Ranoside）、槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷（Quercetin-3-O-β-D-galactopy Ranoside-4′-O-β-D-glucopyranoside）、槲皮素（Quercetin）、蘆?。≧utin）、山柰酚（Kaempferol）、異鼠李黃素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷（Isorhamnetin-3-O-β+D-galactopy Ranoside），通過3種不同的體外試驗評估提取物的抗氧化活性：1）穩(wěn)定的1，1-二苯基-2-苦基肼基的漂白作用;2）由水溶性自由基引發(fā)劑2，2′-偶氮二（2-脒基丙烷）鹽酸鹽誘導的混合二棕櫚酰磷脂酰膽堿/亞油酸單層囊泡的過氧化反應(yīng);3）紫外線輻射誘導的磷脂酰膽堿多層囊泡中的過氧化反應(yīng)。在所有使用的體外試驗中，ECR提取物顯示出顯著的抗氧化作用。此外，當局部使用時，證明含有該提取物的凝膠制劑在健康人志愿者中提供針對中波紫外線誘導的皮膚紅斑的顯著體內(nèi)保護。Rockenbach等[11]研究發(fā)現(xiàn)槲皮素對腫瘤細胞的抗增殖作用可能至少部分地通過改變核苷酸的細胞外分解代謝而發(fā)生，可能是通過AMP積累，或者可能是阻斷了腺苷受體，支持槲皮素治療膀胱癌的潛在應(yīng)用。

本課題組經(jīng)前期實驗發(fā)現(xiàn)鼠曲草中異澤蘭黃素（Eupatilin）和5-羥基-6，7，3′，4′-四甲氧基黃酮為首次從鼠曲草屬植物中分離得到，芹菜素（Apigenin）為首次從該植物中分離得到[12]。據(jù)國外研究報道鼠曲草成分中多種成分如Apigenin[13-14]和Eupatilin[15]等有較強的抗腫瘤作用。Suh等[13]研究發(fā)現(xiàn)Apigenin對SKOV3和SKOV3/TR細胞的抗增殖作用。RT-PCR和Western Blotting結(jié)果顯示，Apigenin在mRNA和蛋白水平顯著降低Axl和Tyro3受體酪氨酸激酶（RTKs）的表達，這是其細胞毒活性的原因。進一步發(fā)現(xiàn)Apigenin降低AKT磷酸化和B細胞淋巴瘤的水平-特別大（Bcl-xl或BCL2樣1同種型1），一種凋亡抑制劑。與這些結(jié)果相反，Apigenin對IL-6產(chǎn)生，STAT3和磷酸化STAT3蛋白水平?jīng)]有影響，表明Apigenin通過下調(diào)Axl和Tyro3表達，AKT磷酸化和Bcl-xl表達而發(fā)揮其抗增殖活性，但不是調(diào)節(jié)IL-6/STAT3軸。Tong等[14]報道：植物黃酮類芹菜素可預防和抑制中波紫外線誘導的皮膚癌發(fā)生，具有很強的抗增殖和抗血管生成作用，確定了芹菜素控制這些致癌事件的機制。研究顯示芹菜素至少部分地通過內(nèi)源性血管生成抑制劑血小板反應(yīng)蛋白-1（TSP1）起作用。中波紫外線有效抑制表皮角質(zhì)形成細胞的TSP1表達。它抑制皮膚血管生成和中波紫外線誘導的癌發(fā)生。我們顯示芹菜素恢復經(jīng)受中波紫外線的表皮角質(zhì)形成細胞中的TSP1并使中波紫外線暴露的皮膚中的增殖和血管生成正?；Ｖ匾氖?，用中波紫外線照射的皮膚重建TSP1抗血管生成功能，其中短的生物活性肽模擬物僅代表其抗血管生成結(jié)構(gòu)域，再現(xiàn)了芹菜素的抗增殖和抗血管生成作用。Cox-2和HIF-1α是血管生成的重要介質(zhì)。芹菜素和TSP1肽模擬物都通過中波紫外線減弱它們的誘導。最后，研究發(fā)現(xiàn)了其分子機制，其中芹菜素不影響TSP1 mRNA，但從頭蛋白質(zhì)合成增加。敲減研究涉及RNA結(jié)合蛋白HuR，其控制mRNA穩(wěn)定性和翻譯。芹菜素增加HuR細胞質(zhì)定位和與TSP1 mRNA的物理結(jié)合，從而導致從頭TSP1合成。反過來，HuR細胞質(zhì)定位依賴于CHK2激酶。總之，研究發(fā)現(xiàn)了一種新機制，芹菜素通過該機制控制中波紫外線誘導的致癌作用。Park等[15]在人胃癌細胞系MKN-1中研究了Eupatilin的抗轉(zhuǎn)移作用。Eupatilin以劑量和時間依賴性方式抑制MKN-1生長，并誘導細胞凋亡，伴隨著Caspase-3活性的增加。ELISA證實了Eupatilin顯著降低炎癥介質(zhì)（IL-1β，TNF-α，IL-6和IL-8）的釋放。并且p-AKT和p-ERK（p44/42）減少。β-catenin和整合素的表達水平降低，p-GSKβ升高。在轉(zhuǎn)錄報告系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)內(nèi)因子核因子κB的活性被Eupatilin降低，當用Eupatilin處理MKN-1細胞時p65的表達下調(diào)。此外，酶譜研究表明，這種侵襲能力的降低是由于Ⅳ型膠原溶解（明膠水解）活性的降低所致。用Eupatilin處理的MKN-1細胞中金屬蛋白酶（MMP-2和MMP-9）的表達也降低。在體外侵襲測定中，Eupatilin抑制MKN-1穿透重建的基底膜屏障。這些結(jié)果表明，Eupatilin通過激活caspase-3和胃癌細胞的轉(zhuǎn)移潛能，通過下調(diào)核因子κB活性，然后減少炎癥介質(zhì)介導的MMPs表達來抑制MKN-1胃癌細胞增殖。

本實驗采用MNU膀胱灌注誘導大鼠膀胱癌，在對照組成瘤率為100%，是國內(nèi)外最常采用的方法，該方法操作簡單，實驗周期短，成瘤率高。劑量為1 mg/mL，1 mL/次，讓膀胱適度充盈，膀胱黏膜充分接觸藥液，操作也更為簡便。本實驗采用鼠曲草水煮提取液代飲用水喂食，與民間加工、食用方法相似，通過實驗證實鼠曲草還有抗膀胱癌的功效。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，鼠曲草水提取液具有良好的抗腫瘤作用，且與其劑量相關(guān);其作用機制可能主要與其抗氧化作用和自由基清除作用等保健作用，另外其促進腫瘤細胞調(diào)亡也是其抗腫瘤作用形成的關(guān)鍵機制，這與國內(nèi)外相關(guān)報道一致。進一步從鼠曲草水提取液中找出其抗腫瘤的有效成分及其作用機制是擺在我們面前的一項難題，還需要做相當煩瑣艱巨的實驗研究工作。

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（2019-05-25收稿 責任編輯：王明）