王佳 褚雨霆 王沖 侯麗 郎海燕 陳科 陳信義 張雅月

摘要 目的：觀察“從脾論治方”對(duì)原發(fā)免疫性血小板減少癥（ITP）小鼠血管活性因子的影響，探討“從脾論治方”的止血效應(yīng)機(jī)制。方法：以被動(dòng)型免疫造模法建立ITP小鼠模型，以潑尼松、歸脾湯、健脾益氣方、健脾益氣攝血方為干預(yù)藥物，以ELISA檢測(cè)模型小鼠血清血管內(nèi)皮素-1（ET-1）、血栓素A2（TXA2）、血管性血友病因子（vWF）、血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）、前列腺素（PG）、前列環(huán)素（PGI2）、一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶3（NOS3）、血栓調(diào)節(jié)蛋白（TM）水平。結(jié)果：1）升血小板療效：注射APS后第15天（給藥第8天），模型對(duì)照組小鼠外周血血小板計(jì)數(shù)（PLT）仍顯著低于正常對(duì)照組，而各給藥組小鼠外周血PLT與正常對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），并且明顯高于模型對(duì)照組。2）止血療效：注射APS后各組小鼠均有不同程度出血傾向，藥物干預(yù)第6天及第8天，各觀察組出血等級(jí)明顯低于模型對(duì)照組。3）血管促凝活性因子：實(shí)驗(yàn)各組VCAM-1水平顯著低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;健脾益氣組和歸脾湯組VCAM-1水平均顯著高于模型對(duì)照組和潑尼松組，健脾益氣攝血組VCAM-1水平明顯高于潑尼松組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。4）血管抗凝活性因子：實(shí)驗(yàn)各組TM水平明顯低于正常對(duì)照組，健脾益氣攝血組TM水平顯著低于模型對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：“從脾論治”方可以升高ITP模型小鼠外周血PLT，降低出血分級(jí)，并且可以通過上調(diào)VCAM-1、下調(diào)TM檢測(cè)值調(diào)節(jié)促凝與抗凝活性因子的動(dòng)態(tài)平衡。

關(guān)鍵詞 從脾論治;原發(fā)免疫性血小板減少癥;血管活性因子;血管促凝活性因子;血管抗凝活性因子

Abstract Objective：To observe the effect of “Congpi Lunzhi Formula” on vasoactive factors in ITP mice，and to explore the hemostatic effect mechanism of “Congpi Lunzhi Formula”.Methods：The ITP mice immune model was established by means of passive immunization.Prednisone，Guipi Decoction，Jianpi Yiqi Decoction，Jianpi Yiqi Shexue Formula were used as intervention drugs，and serum ET-1，NO，NOS3，TXA2，PGI2，vWF，VCAM-1 of model mice were detected by ELISA and TM levels were detected by ELISA.Results：1）Increasing efficacy of platelet：On the 15th day after APS injection（the 8th day of administration），the PLT count in the peripheral blood of the model control group was still significantly lower than that of the normal control group，while the peripheral blood PLT of the mice in the model control group was lower than the normal control group.However，the peripheral blood PLT of mice in each administration group had no statistical difference compared with the normal control group，and was significantly higher than the model control group.2）Hemostatic effect：After injection of APS，mice in each group have different degrees of bleeding tendency.On the 6th and 8th day of drug intervention，the bleeding level of each experimental group was significantly lower than that of the model control group.3）Vascular procoagulant activity factors：the levels of VCAM-1 in each experimental group were significantly lower than those in the normal control group; the levels of VCAM-1 in the Jianpi Yiqi group and the Guipi Decoction group were significantly higher than those in the model control group and the prednisone group.The level of VCAM-1 in the Jianpi Yiqi Shexue group was significantly higher than that in the prednisone group.4）Vascular anticoagulant activity factors：the TM levels of each experimental group were significantly lower than those of the normal control group，and the TM levels of Jianpi Yiqi Shexue group were significantly lower than the model control group.Conclusion：Treatment from spleen could improve PLT count of ITP model mice，degrade the bleeding scale.Moreover，it can upregulate VCAM-1，downregulate TM，keep the dynamic balance of coagulant and anticoagulant factors.

Keywords Treatment from spleen; Immune thrombocytopenic purpura; Vasoactive factors; Vascular coagulant active element; Vascular anticoagulant active element

中圖分類號(hào)：R242文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.11.011

原發(fā)免疫性血小板減少癥（Immune Thrombocytopenic Purpura，ITP）以外周血小板破壞增多，以及骨髓生成血小板減少為主要病理表現(xiàn)，是臨床常見的血液系統(tǒng)出血性疾病。目前對(duì)于ITP發(fā)病機(jī)制尚不完全清晰，公認(rèn)的發(fā)病機(jī)制系多重因素導(dǎo)致的自身免疫功能紊亂[1-2]。根據(jù)中醫(yī)學(xué)理論，結(jié)合慢性ITP的臨床特征，其發(fā)病系脾氣虛弱，不能正常發(fā)揮統(tǒng)攝血液的功能所致[3]。因此，“從脾論治”是ITP的基本治療原則[4-5]。課題組在前期臨床與實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)上，采用被動(dòng)免疫造模法成功復(fù)制了ITP動(dòng)物模型[6-8]。本研究利用ITP模型小鼠，選擇歸脾湯、健脾益氣攝血方、健脾益氣方和潑尼松為干預(yù)藥物，以外周血血小板計(jì)數(shù)（PLT）、出血程度分級(jí)、血管相關(guān)促凝及抗凝活性因子為檢測(cè)指標(biāo)，試圖從血管活性因子動(dòng)態(tài)平衡的角度探索“從脾論治”緩解ITP出血的效應(yīng)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物

豚鼠100只（雌雄各半），體質(zhì)量250 g，許可證號(hào)：SCXK（陜）2012-001（陜西省興平市天瑞實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖廠），普通環(huán)境飼養(yǎng);BALB/c小鼠160只（雌雄各半），體質(zhì)量18～22 g，許可證號(hào)：SCXK（陜）2014-002（原解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），無特定病原體（SPF）級(jí)實(shí)驗(yàn)室IVC鼠籠飼養(yǎng)。其中，40只用于抗小鼠血小板血清制備，120只用于造模并進(jìn)行療效機(jī)制研究。該研究通過倫理委員會(huì)審批（倫理審批號(hào)：XYLS2019069）。

1.1.2 藥物

實(shí)驗(yàn)用中藥浸膏由西安星華藥物研究所按照中藥新藥藥學(xué)標(biāo)準(zhǔn)制備并提供（批號(hào)：20140322）：健脾益氣攝血浸膏（黃芪、黨參、茯苓、白術(shù)、阿膠、茜草、炙甘草）。健脾益氣浸膏（黃芪、黨參、茯苓、白術(shù)、炙甘草）。歸脾湯浸膏（人參、白術(shù)、當(dāng)歸、茯苓、黃芪、龍眼肉、遠(yuǎn)志、炒酸棗仁、木香、炙甘草）。潑尼松（上海晶純生化科技股份有限公司，批號(hào)：28778）。

1.1.3 試劑與儀器

對(duì)硝基苯磷酸二鈉（上海晶純生化科技股份有限公司，批號(hào)：H1419017）;弗氏完全佐劑（Sigma-Aldrich，美國(guó)，批號(hào)：SLBF2619V），弗氏不完全佐劑（Sigma-Aldrich，美國(guó)，批號(hào)：SLBH7317V）;凍干酶聯(lián)A蛋白（博士德生物，批號(hào)：BST07A19B80）;疊氮化鈉（鄭州派尼化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20140515）;二乙醇胺（天津市科密歐化學(xué)試劑有限責(zé)任公司，批號(hào)：20140110）;小鼠血清ET-1、NO、NOS3、TXA2、PGI2、vWF、VCAM-1、TM試劑盒（武漢基因美生物科技有限公司，批號(hào)：201411）。微量高速離心機(jī)（湖南長(zhǎng)沙湘儀檢測(cè)設(shè)備有限公司，型號(hào)：H1650-W）;全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)賽默飛科技公司，美國(guó)，型號(hào)：Multiskan GO no.51119300）;全自動(dòng)動(dòng)物血液分析儀（北京普朗新技術(shù)有限公司，型號(hào)：XFA6130）。

1.2 方法

1.2.1 抗小鼠血小板血清（Anti-platelet Serum，APS）制備與效價(jià)檢測(cè)

本研究中APS的制備與效價(jià)檢測(cè)方法沿用課題組在國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（2013CB531705）“脾主運(yùn)化、主統(tǒng)血等臟象理論研究”項(xiàng)目下的“脾不統(tǒng)血所致血小板減少性紫癜從脾論治的療效機(jī)制及規(guī)律研究”課題中使用的方法[6-8]。

1.2.2 造模與分組給藥

從120只小鼠尾靜脈取血，用全自動(dòng)血液分析儀檢測(cè)PLT，隨機(jī)分為6組（正常對(duì)照組，模型對(duì)照組，潑尼松組，歸脾湯組，健脾益氣組，健脾益氣攝血組），每組20只。給予正常對(duì)照組小鼠生理鹽水腹腔注射（100 μL/20 g），其余5組1次/d腹腔注射黃芪多糖注射液（APS）（100 μL/20 g），直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。注射APS第8天開始，除正常對(duì)照組和模型對(duì)照組外，其余4組均按照0.1 mL/10 g體積灌胃給藥，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后（注射APS第15天）進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)。

1.2.3 外周血PLT檢測(cè)

分別于注射APS前、注射后48 h、第8天（開始給藥）、第12天以及第15天，從各組小鼠尾靜脈取血，用全自動(dòng)血液分析儀檢測(cè)各組小鼠外周血PLT。

1.2.4 出血程度分級(jí)觀察

參照2010年衛(wèi)生部醫(yī)政司發(fā)布的《免疫性血小板減少性紫癜臨床路徑》，結(jié)合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)特點(diǎn)，將出血程度分4級(jí)[9]。0級(jí)：無出血現(xiàn)象。Ⅰ級(jí)：注射部位輕度出血，其他部位有散在出血點(diǎn)。Ⅱ級(jí)：注射部位明顯出血，并見有其他部位瘀斑、瘀點(diǎn)。Ⅲ級(jí)：注射部位嚴(yán)重出血，皮膚大量瘀斑、瘀點(diǎn)，或皮膚發(fā)黑或破潰。觀察時(shí)間點(diǎn)為注射APS第8天（用藥前）、注射APS第13天（用藥第6天）、注射APS第15天（用藥第8天）3個(gè)時(shí)間點(diǎn)動(dòng)態(tài)觀察出血分級(jí)變化。

1.2.5 血管活性因子檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組隨機(jī)取12只小鼠予以斷頸處死，取腹主動(dòng)脈血，稍靜置，上機(jī)560×g離心，收集血清，根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法（ELISA）試劑盒說明書，進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)。其中，6只小鼠血清用于血管促凝活性因子血管內(nèi)皮素-1（ET-1）、血栓素A2（TXA2）、血管性血友病因子（vWF）、血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）檢測(cè);6只小鼠血清用于血管抗凝活性因子前列腺素（PG）、前列環(huán)素（PGI2）、一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶3（NOS3）、血栓調(diào)節(jié)蛋白（TM）檢測(cè)。酶標(biāo)儀測(cè)定OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件分析所有數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間多重比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料則采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抗血清效價(jià)測(cè)定結(jié)果

APS血清組OD值平均為0.300，空白孔OD值平均為0.163，相差約2倍（P<0.01）。

2.2 升血小板療效

注射APS前各組小鼠外周血PLT比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。注射APS后的48 h，實(shí)驗(yàn)各組小鼠外周血PLT均顯著低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），提示已成功建立血小板減少模型。注射APS第8天（開始給藥）到第12天，實(shí)驗(yàn)各組小鼠外周血PLT仍然顯著低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。注射后第15天（給藥第8天），模型對(duì)照組小鼠外周血PLT仍顯著低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），而各給藥組小鼠外周血PLT與正常對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），證明實(shí)驗(yàn)藥物可明顯提高實(shí)驗(yàn)小鼠外周血PLT。其中，潑尼松組（P<0.01），健脾益氣攝血組（P<0.01），歸脾湯組（P<0.05），以及健脾益氣組（P<0.05）小鼠外周血PLT均明顯高于模型對(duì)照組，提示潑尼松與“從脾論治方”在提升ITP模型小鼠外周血PLT方面具有明顯優(yōu)勢(shì)。見表1。

2.3 止血療效

注射APS造模后小鼠出現(xiàn)不同程度出血。如圖1所示，處死小鼠腹腔中有大量出血，腹膜遍布出血點(diǎn)，提示造模成功。

按照觀測(cè)時(shí)間點(diǎn)以及出血分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，每組隨機(jī)觀察10只小鼠出血分級(jí)變化。給藥前（注射APS第8天），除正常對(duì)照組外，實(shí)驗(yàn)各組出血程度分級(jí)分布經(jīng)非參數(shù)檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.998），提示組間具有可比性。說明注射APS后各組小鼠均有不同程度出血傾向。藥物干預(yù)第6天，各組出血等級(jí)顯著降低，與模型對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.014）。下降幅度從大到小依次為潑尼松組（P=0.002）、健脾益氣攝血組（P=0.003）、歸脾湯組（P=0.003）、健脾益氣組（P=0.021）。藥物干預(yù)各組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。藥物干預(yù)第8天，各組出血等級(jí)明顯下降，與模型對(duì)照組比較，經(jīng)非參數(shù)檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。出血等級(jí)下降幅度從大到小依次為潑尼松組（P<0.01）、健脾益氣攝血組（P<0.01）、歸脾湯組（P<0.01）、健脾益氣組（P<0.01）。藥物干預(yù)組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

2.4 血管促凝活性因子

ET-1：實(shí)驗(yàn)各組與正常對(duì)照組比較，ET-1水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。TXA2：實(shí)驗(yàn)各組與正常對(duì)照組、模型對(duì)照組比較，TXA2水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;各給藥組組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。vWF：實(shí)驗(yàn)各組與正常對(duì)照組比較，vWF水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。VCAM-1：實(shí)驗(yàn)各組與正常對(duì)照組比較，VCAM-1水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;但是健脾益氣組和歸脾湯組VCAM-1水平均顯著高于模型對(duì)照組和潑尼松組（P<0.01），健脾益氣攝血組VCAM-1水平明顯高于潑尼松組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;健脾益氣組和歸脾湯組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表3。

2.5 血管抗凝活性因子

NO：實(shí)驗(yàn)各組與正常對(duì)照組比較，NO水平明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。NOS3：除歸脾湯組外，各組檢測(cè)值與正常對(duì)照組比較均明顯下降（P<0.05），歸脾湯組NOS3水平顯著高于模型對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;其余各組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。PGI2：與正常對(duì)照組比較，只有健脾益氣組和歸脾湯組PGI2水平明顯下降（P<0.01），其中歸脾湯組PGI2水平顯著低于模型對(duì)照組（P<0.05）。TM：實(shí)驗(yàn)各組與正常對(duì)照組比較TM水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;健脾益氣攝血組顯著低于模型對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表4。

3 討論

從骨髓巨核細(xì)胞分化產(chǎn)生的血小板在機(jī)體止血和凝血過程中發(fā)揮著重大作用，當(dāng)ITP患者外周血小板計(jì)數(shù)低于50×109/L時(shí)，則存在出血發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，ITP出血與患者外周血PLT數(shù)量及其質(zhì)量密切相關(guān)[10]。然而在臨床實(shí)際中，許多ITP特別是慢性ITP患者，雖然外周血PLT低于50×109/L，甚至低于安全水平（30×109/L），但其出血傾向并不明顯。有些患者經(jīng)相關(guān)治療后外周血PLT依然處于較低水平，但是并沒有伴隨明顯的出血癥狀。可見ITP患者外周血PLT減少并不是導(dǎo)致出血的唯一因素，很可能是參與凝血機(jī)制多個(gè)環(huán)節(jié)共同作用的結(jié)果。

其中，血管及其血管分泌的活性因子發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[11]。血管是生物體運(yùn)送血液的管道，除維持血液與組織間物質(zhì)交換外，正常血管中存在大量的活性物質(zhì)，以調(diào)控血管生理狀態(tài)。特別是血管內(nèi)皮細(xì)胞是分泌、合成和釋放血管活性物質(zhì)的重要場(chǎng)所，這些活性物質(zhì)具有舒縮血管、調(diào)控血管張力與促進(jìn)血液凝固的多重效果。

舒張血管活性因子與抗凝機(jī)制關(guān)系密切，主要包括前列腺素：前列腺素（PG）及其代謝后的衍生物如前列環(huán)素（PGI2）。其對(duì)血液凝固作用主要是導(dǎo)致血管舒張，抑制血小板聚集與調(diào)節(jié)血小板活化[12]。一氧化氮和一氧化氮合酶3：一氧化氮（NO）和一氧化氮合酶3（NOS3）可以通過松弛平滑肌，使血管擴(kuò)張，從而穿過細(xì)胞膜進(jìn)入血管腔，降低血小板的凝集和黏附性，發(fā)揮舒張血管和抗凝作用[13]。血栓調(diào)節(jié)蛋白：血栓調(diào)節(jié)蛋白（TM）是使凝血酶由促凝轉(zhuǎn)向抗凝的重要血管內(nèi)凝血抑制因子，主要是調(diào)節(jié)機(jī)體凝血與抗凝血?jiǎng)討B(tài)平衡[14]。

收縮血管活性因子與凝血機(jī)制密切相關(guān)，主要包括血管內(nèi)皮素：血管內(nèi)皮素（ET）是維持血管張力的重要內(nèi)源性活性因子，具有長(zhǎng)效收縮血管的作用。在ET系統(tǒng)的3個(gè)肽配體中，血管內(nèi)皮素-1（ET-1）收縮血管的作用最強(qiáng)，其對(duì)血管特別是微小血管的收縮作用有利于血液凝固和止血[15]。血栓素A2：血栓素A2（TXA2）是一強(qiáng)血管收縮因子，可以激活血小板、使其聚集，有利于修復(fù)組織損傷和止血[16]。血管性血友病因子：血管性血友病因子（vWF）是一種有黏附性的多聚體糖蛋白。與血小板膜GPⅠb-Ⅸ復(fù)合物及細(xì)胞內(nèi)皮下膠原結(jié)合，介導(dǎo)血小板在血管損傷部位黏附以及與因子凝血因子Ⅷ結(jié)合來有效止血[17]。此外，vWF也能結(jié)合GPⅡb-Ⅲa，參與血小板聚集過程。血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1：血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）是一種介導(dǎo)細(xì)胞間或者細(xì)胞和外基質(zhì)間相互作用的細(xì)胞黏附分子，其活性降低會(huì)導(dǎo)致血管通透性增加，組織缺血與缺氧，增加血液外滲[18]。

控制血管張力的血管舒縮活性因子是一對(duì)矛盾的統(tǒng)一體。一般認(rèn)為，血管舒張活性因子具有抗凝效應(yīng)，既是預(yù)防血栓形成的關(guān)鍵因子，也是影響血液凝固/止血的重要物質(zhì);血管收縮活性因子具有促進(jìn)凝血效應(yīng)，既是血栓形成的危險(xiǎn)因素，也是促進(jìn)血液凝固/止血的關(guān)鍵。二者的動(dòng)態(tài)平衡在不同的疾病中擔(dān)當(dāng)不同角色。當(dāng)機(jī)體發(fā)生血小板減少特別是原發(fā)免疫性血小板減少癥，紊亂的免疫機(jī)制可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，血管分泌、合成和釋放血管活性因子比例失調(diào)，直接或間接影響了血管舒縮與凝血功能。因此，有效的調(diào)節(jié)血管舒縮活性因子，能在ITP患者低血小板數(shù)值情況下，預(yù)防出血風(fēng)險(xiǎn)或達(dá)到止血效果?；诖耍n題組在臨床實(shí)踐中，確立了“從脾論治”ITP的重要治則[19]，擬定了“從脾論治”的健脾益氣攝血方。前期臨床試驗(yàn)證明，該方可明顯提升ITP患者外周血PLT，改善出血與相關(guān)臨床癥狀[20-21]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，該方具有提升模型小鼠外周血PLT與良好的止血效果[22-25]，并明確了部分效應(yīng)機(jī)制[26-28]。為進(jìn)一步探討“從脾論治”ITP療效機(jī)制，我們以健脾益氣攝血方（四君子湯加炙黃芪、阿膠、茜草）為標(biāo)準(zhǔn)觀察藥物，選擇健脾益氣方（四君子湯加炙黃芪）、歸脾湯原方為“從脾論治”方，觀察三方對(duì)ITP動(dòng)物模型外周血PLT、出血程度分級(jí)與血管活性因子影響。經(jīng)效價(jià)檢測(cè)，證實(shí)本研究所制備的血清有效[4]。研究結(jié)果顯示：注射APS后第15天（給藥第8天），模型對(duì)照組小鼠外周血PLT仍顯著低于正常對(duì)照組，而各給藥組小鼠外周血PLT與正常對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且明顯高于模型對(duì)照組;注射APS后各組小鼠均有不同程度出血傾向，藥物干預(yù)第6天及第8天，各觀察組出血等級(jí)明顯低于模型對(duì)照組，提示“從脾論治”方可有效提升ITP小鼠外周血小板數(shù)值，緩解出血癥狀。此外，造模成功后模型對(duì)照組VCAM-1和TM水平顯著降低，而健脾益氣組和歸脾湯組VCAM-1水平均顯著高于模型對(duì)照組和潑尼松組，健脾益氣攝血組VCAM-1水平明顯高于潑尼松組，健脾益氣攝血組TM水平也顯著低于模型對(duì)照組，可見“從脾論治”方可提升ITP小鼠外周血VCAM-1水平，并且降低TM檢測(cè)值。

綜上所述，“從脾論治”方除具有提升ITP模型小鼠外周血PLT、降低出血分級(jí)作用以外，其上調(diào)血管促凝活性因子VCAM-1，下調(diào)血管抗凝活性因子TM檢測(cè)值，調(diào)節(jié)促凝與抗凝活性因子的動(dòng)態(tài)平衡可能是其有效止血的效應(yīng)機(jī)制之一。

參考文獻(xiàn)

[1]熊婷婷.免疫性血小板減少癥的細(xì)胞免疫致病機(jī)制研究最新進(jìn)展[J].中國(guó)小兒血液與腫瘤雜志，2019，24（6）：321-327.

[2]Kühne T，Berchtold W，Michaels LA，et al.Newly diagnosed immune thrombocytopenia in children and adults：a comparative prospective observational registry of the Intercontinental Cooperative Immune Thrombocytopenia Study Group[J].Haematologica，2011，96（12）：1831-1837.

[3]劉元梅，周延峰.中醫(yī)治療原發(fā)免疫性血小板減少癥研究進(jìn)展[J].中國(guó)民族民間醫(yī)藥，2018，27（1）：57-59.

[4]吳玉霞，袁忠，馬西虎，等.從脾論治慢性原發(fā)性免疫性血小板減少性癥臨床療效觀察[J].世界中醫(yī)藥，2016，11（9）：1782-1785.

[5]李天天，侯麗，張雅月，等.從脾論治免疫性血小板減少性紫癜的理論基礎(chǔ)與臨床實(shí)踐[J].北京中醫(yī)藥，2015，34（4）：304-306.

[6]張愛軍，侯明.免疫性血小板減少性紫癜動(dòng)物模型的研究進(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2006，14（3）：623-626.

[7]郎海燕，褚雨霆，馬薇，等.免疫性血小板減少癥病證結(jié)合動(dòng)物模型研究[J].中醫(yī)藥信息，2017，34（1）：39-43.

[8]何昊，徐玥，秦蓓，等.免疫性血小板減少性紫癜動(dòng)物模型建立方法與應(yīng)用評(píng)價(jià)[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2016，16（10）：1971-1974.

[9]陳銳.免疫性血小板減少性紫癜臨床路徑（2010年版）[J].中國(guó)社區(qū)醫(yī)師，2011，27（11）：17.

[10]余鋼成.22例ITP臨床出血風(fēng)險(xiǎn)的分析[J].江西醫(yī)藥，2010，45（8）：801-802.

[11]李偉，張咪娟，王琰，等.血小板活化因子和血管內(nèi)皮活性標(biāo)志物與腔隙性腦梗死的關(guān)系[J].華西醫(yī)學(xué)，2019，34（10）：1143-1147.

[12]蔡大振，張霞.當(dāng)歸對(duì)高血壓病患者中醫(yī)證候療效、血清炎性因子、血漿血栓素及前列環(huán)素水平的影響研究[J].中醫(yī)臨床研究，2019，11（32）：37-39.

[13]全守東，于亞杰，梁志霞.一氧化氮吸入聯(lián)合米力農(nóng)治療新生兒持續(xù)性肺動(dòng)脈高壓的療效及對(duì)血流動(dòng)力學(xué)、血小板聚集功能的影響[J].臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2020，19（1）：89-91.

[14]徐靜，丁艷妮，楊敏，等.聯(lián)合檢測(cè)D二聚體與活化部分凝血活酶時(shí)間、凝血酶調(diào)節(jié)蛋白對(duì)乳腺癌患者術(shù)后下肢深靜脈血栓形成的價(jià)值[J].血栓與止血學(xué)，2019，25（6）：952-953.

[15]武曲星，王攀，王冬芝，等.免疫性血小板減少癥氣不攝血證小鼠模型血管內(nèi)皮活性物質(zhì)變化動(dòng)態(tài)研究[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2019，26（12）：56-61.

[16]張穎，劉紅旭，康群甫，等.參元丹優(yōu)化方對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化小鼠胰島素抵抗及血清血栓素A_2/前列環(huán)素比值和DNA甲基化水平的影響[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2018，25（8）：53-57.

[17]常方圓，馮澤瑞，王志敏.冠心病病人血清vWF、GDF-15、PCSK-9、APN的變化特點(diǎn)及與冠狀動(dòng)脈病變程度的關(guān)系[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2019，17（22）：3570-3573.

[18]朱翔鴻，丁秦超，賴尚磊，等.激活自噬改善炎性因子誘導(dǎo)的血管細(xì)胞粘附分子1的表達(dá)[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2019，46（13）：2419-2423.

[19]吳曉勇，陳廣雷，王云龍，等.中醫(yī)藥治療免疫性血小板減少癥的機(jī)制[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2017，23（8）：213-219.

[20]王珺，張?zhí)N，張玲，等.健脾益氣攝血顆粒治療免疫性血小板減少癥臨床療效觀察[J].中華中醫(yī)藥雜志，2018，33（12）：5700-5704.

[21]郎海燕，張玲，王佳，等.健脾益氣攝血顆粒影響免疫性血小板減少癥患者出血與免疫功能研究[J].醫(yī)學(xué)研究雜志，2019，48（9）：45-49.

[22]李瀟，朱長(zhǎng)樂，趙寧，等.健脾益氣攝血方及其拆方對(duì)辛伐他汀誘導(dǎo)斑馬魚腦出血的防治作用研究[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，40（12）：1004-1010.

[23]張雅月，田劭丹，祁爍，等.健脾益氣攝血方及其拆方對(duì)辛伐他汀誘導(dǎo)斑馬魚心臟出血模型血流量影響研究[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2017，14（36）：9-12，24.

[24]褚雨霆，朱曉宇，張雅月，等.健脾益氣攝血方對(duì)辛伐他汀誘導(dǎo)斑馬魚出血模型的止血效果研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2017，25（3）：853-859.

[25]何昊，孫艷平，鄭蕾，等.健脾益氣攝血方對(duì)ITP模型小鼠外周血象的影響[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2015，43（6）：22-24.

[26]陳科，戴欣媛，趙寧，等.脾不統(tǒng)血證相關(guān)疾病與血液神經(jīng)遞質(zhì)變化關(guān)系研究[J].遼寧中醫(yī)雜志，2018，45（2）：245-248.

[27]徐玥，何昊，鄭蕾，等.健脾攝血方對(duì)ITP小鼠血清神經(jīng)遞質(zhì)表達(dá)影響研究[J].世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2017，12（7）：928-932.

[28]何昊，徐玥，鄭蕾，等.健脾益氣攝血方對(duì)ITP模型小鼠血清SIgA和β-EP影響研究[J].中醫(yī)藥信息，2015，32（5）：47-49.

（2020-02-24收稿 責(zé)任編輯：楊覺雄）