林雨晟 金洪石 張皓楠 金江華 郭偉 李玉娥 趙銘欽 劉鵬飛

摘 要：為快捷準確地測定煙葉中生物堿的含量，本研究通過優(yōu)化提取條件，建立了測定煙草中煙堿、新煙草堿、假木賊堿和降煙堿的高效液相色譜檢測方法。優(yōu)化后的檢測步驟為：干煙葉和5%甲醇的料液比為100 mg/20 mL，在25 ℃下振蕩提取30 min，色譜條件：C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相A（90%水+10%甲醇，pH 6.8，0.15%醋酸鈉），流動相B（90%甲醇+10%水，pH 3.8）。煙堿在0.1～50 μg/mL、其余3種在0.005～2 μg/mL的范圍內(nèi)，4種生物堿均具有較好的線性關系（R2>0.99）;煙堿檢出限為0.000 65 μg/mL，平均回收率100.79%，RSD 3.11%;新煙草堿檢出限0.088 4 μg/mL，平均回收率98.53%，RSD 3.75%;假木賊堿檢出限0.034 8 μg/mL，平均回收率98.70%，RSD 3.63%;降煙堿檢出限0.150 9 μg/mL，平均回收率101.33%，RSD 4.61%。對4種不同類型煙葉共11個不同樣品進行檢測驗證，檢測結(jié)果可靠。該方法前處理簡單快捷，靈敏度高，重復性較好，可以滿足煙草樣品中4種生物堿的檢測要求。

關鍵詞：煙草;煙堿;新煙草堿;假木賊堿;降煙堿;液相色譜法

Abstract： In order to quickly and accurately determine the content of alkaloids in tobacco leaves， the extraction conditions were optimized， and a method for the determination of nicotine， anatabine， anabasine and nornicotine contents in tobacco by HPLC was established. The optimized detection steps are as follows： 100 mg/20 mL solid-liquid ratio， 5% methanol was extracted by oscillation at 25 ℃ for 30 min， the chromatographic conditions were C18 column （250 mm×4.6 mm， 5 μm）， mobile phase A （90% water +10% methanol， pH 6.8， 0.15% sodium acetate）， mobile phase B （90% methanol +10% water， pH 3.8）. Nicotine was in the range of 0.1-50 μg/mL and the other three alkaloids were in the range of 0.005-2 μg/mL， with the standard curves of the four alkaloids all havig good linear relationship （R2 > 0.99）. The limits of detection （LOD） of nicotine were 0.000 65 μg/mL， and the average recoveries were 100.79%， RSD 3.11%; the LOD of anatabine were 0.088 4 μg/mL， and the average recoveries were 98.53%， RSD 3.75%; the LOD of anabasine were 0.034 8 μg/mL， and the average recoveries were 98.70%， RSD3.63%; the LOD of nornicotine were 0.150 9 μg/mL， and the average recoveries were 101.33%， RSD 4.61%. A total of 11 different samples of 4 different types of tobacco leaves were tested， and the results were reliable. The method is simple and fast， sensitive and repeatable， and can meet the requirements of detecting four alkaloids in tobacco samples.

Keywords： tobacco; nicotine; anatabine; anabasine; nornicotine; HPLC

生物堿是一類存在于植物體中的特殊的含氮有機物，是植物體隨外界環(huán)境變化合成的次生代謝產(chǎn)物，一般具有特殊的生理活性，如抗炎、鎮(zhèn)痛和成癮性[1]。煙草中含有超過50種生物堿，含量較高的有煙堿（尼古?。⑿聼煵輭A、假木賊堿、降煙堿（去甲基煙堿）等[2]。其中煙堿含量最高，一般占總生物堿組分的90%以上，其他各種生物堿所占的比例一般不超過10%[3]。不同類型煙葉的生物堿含量差異主要是煙堿和降煙堿的含量差異，而假木賊堿和新煙草堿在各類型煙葉中的含量均較低，且較少出現(xiàn)轉(zhuǎn)移或降解[4]。

生物堿的組成和含量是影響煙葉質(zhì)量的重要因素，直接影響著煙草制品的勁頭、刺激性、吃味和安全性[5]。煙堿含量對評吸質(zhì)量影響極大，過低勁頭不足，過高會造成刺激性大，影響吃味[6-7];在煙堿去甲基酶的作用下，煙堿脫去甲基后形成降煙堿，降煙堿含量高，則會降解生成麥斯明等物質(zhì)，影響煙葉香氣質(zhì)和香氣量，并導致煙草特有亞硝胺（TSNAs）含量上升[8-9];假木賊堿與勁頭得分顯著負相關，且對香氣濃度有顯著影響[10];新煙草堿對香氣質(zhì)、香氣量、刺激性以及TSNAs含量等均有影響[9，11]。因此準確快速簡便的測定煙葉內(nèi)各生物堿含量對于煙草研究有著重要作用。

目前關于煙草生物堿的檢測方法主要有氣相色譜法（GC）[12-15]、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）[1，6-18]、液相色譜法（LC）[19-21]、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS）[22-24]。與其他方法相比，液相色譜法的樣品前處理步驟少、誤差小，檢測更快速、重現(xiàn)性更好，更利于廣泛使用。劉正聰?shù)萚25]利用超高效液相色譜法（UPLC）檢測了卷煙煙絲中的煙堿、降煙堿、麥斯明、新煙草堿和可替寧等5種生物堿，該方法出峰時間較快，出峰較為密集，目標物不容易區(qū)分。本文在前人研究的基礎上，采用高效液相色譜法，建立了同時檢測煙堿、降煙堿、新煙草堿、假木賊堿等煙草中含量較高的4種生物堿[2]的方法，該方法前處理步驟簡便、結(jié)果準確，同時檢測組分多，且峰形良好。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

4種類型煙葉樣品（烤煙4個，云南;白肋煙2個，湖北;雪茄煙海南2個、四川1個;曬紅煙2個，吉林），共計11個。烘干粉碎過40目篩備用。

煙堿、降煙堿、新煙草堿、假木賊堿標準品，純度均大于98%（TRC，加拿大）;醋酸鈉、磷酸、三乙胺、鹽酸、氫氧化鈉均為分析純（天津大茂）;甲醇為色譜純（天津科密歐）。

電子天平（上海上平，精度0.000 1 g），超聲儀（鄭州生元，SYU-10-300 DT），pH計（上海豐控，F(xiàn)K-PH10），LC-20 A液相色譜（日本島津，LC20）。

1.2 前處理方法

1.2.1 標準溶液配制 分別稱取4種生物堿10 mg，用100 mL甲醇溶解，得到100 mg/L的單一標準溶液母液。分別吸取適量母液，配成4種生物堿的標準混合溶液，按照優(yōu)化后的檢測步驟，通過峰面積繪制校準曲線，其中，煙堿的濃度為0.1、0.5、2、10、20、50 mg/g，其余3種生物堿濃度為0.005、0.02、0.1、0.5、1、2 mg/g。

1.2.2 生物堿的紫外掃描及色譜條件 取配制好的單標溶液稀釋后進行波長掃描，掃描范圍為200～400 nm。

色譜條件：島津Shim pack GIST C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相A（90%水+10%甲醇，pH 6.8，0.15%醋酸鈉），流動相 B（90%甲醇+10%水，pH 3.8），柱溫：35 ℃;進樣量：20 μL。

梯度洗脫程序為：0 min （0% B）-8.0 min （0% B）-15.0 min （4% B）-23.0 min （26% B）-34.0 min （35% B）-38.2 min （36% B）-39.0 min （40% B）-41.5 min （40% B）- 44.6 min （0% B）。

1.2.3 提取溶劑的篩選 分別配制2%、4%、6%的鹽酸溶液、氫氧化鈉溶液和氨水溶液以及0%、5%、10%的甲醇水溶液。稱取各煙葉樣品100 mg，分別放入錐形瓶中，加入溶液20 mL，振蕩提取30 min，過濾至50 mL容量瓶中，定容后取10 mL移至100 mL容量瓶中用對應溶液稀釋定容，用磷酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至pH：5（使用甲醇的處理不需要調(diào)節(jié)pH值），待檢測。

1.2.4 提取時間的影響 稱取100 mg煙葉樣品，放入錐形瓶中，加入5%甲醇水溶液20 mL，分別提取10、15、20、25、30 min，過濾至50 mL容量瓶中，定容后取10 mL移至100 mL容量瓶中，用5%甲醇水溶液稀釋定容，待檢測。

1.2.5 提取溫度的影響 稱取100 mg煙葉樣品，放入錐形瓶中，加入5%甲醇水溶液20 mL，分別在25、30、35、40、45 ℃的條件下提取30 min，過濾至50 mL容量瓶中，定容后取10 mL移至100 mL容量瓶中，用5%甲醇水溶液稀釋定容，待檢測。

1.2.6 料液比的影響 分別稱取50、100、150、200、250 mg煙葉樣品，放入錐形瓶中，加入5%甲醇水溶液20 mL，提取30 min，過濾至50 mL容量瓶中，定容后取10 mL移至100 mL容量瓶中，用5%甲醇水溶液稀釋定容，待檢測。

1.3 方法學驗證

1.3.1 檢出限和定量限 將最小濃度的標準溶液逐級稀釋，依次進樣10 μL，計算當信噪比S/N=3時所對應的標準溶液的濃度以確定檢出限（LOD），當信噪比S/N=10時所對應的標準溶液的濃度以確定定量限（LOQ）。

1.3.2 儀器精密度試驗 取同一濃度的混標溶液在1.2.2的色譜條件下連續(xù)進樣5次，每次20 μL，以各對照品的信息，計算各成分的相對標準偏差。

1.3.3 方法重復性試驗 精密稱取同一份烤煙樣品5份，每份100 mg，按優(yōu)選后的提取方法進行提取，得到樣品溶液，在1.2.2的色譜條件下分別進樣，計算樣品中各成分的含量的相對標準偏差值（RSD）。

1.3.4 穩(wěn)定性試驗 精密稱取同一份烤煙樣品5份，每份100 mg，按優(yōu)選后的提取方法進行提取，得到樣品溶液，在上述色譜條件下連續(xù)3 d檢測同一樣品溶液，每次進行5個平行試驗，計算RSD。

1.3.5 加樣回收率試驗 以實際樣品含量為參考，根據(jù)所對應成分含量的0.5、1、2倍進行低、中、高加樣回收率試驗。

1.3.6 樣品檢測 每個樣品稱取100 mg，放入錐形瓶中，按照篩選出的最優(yōu)前處理條件進行提取，用磷酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至pH 5（若使用甲醇的處理則不需要調(diào)節(jié)pH值），過濾至50 mL容量瓶中定容，取10 mL移至100 mL容量瓶中用篩選后溶劑稀釋定容，待檢測。在1.2.2的色譜條件下分別進樣，計算各樣品中4種生物堿的含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

以外標法進行定性和定量測定，以Excel 2016進行數(shù)據(jù)分析，用GraphPad Prism 8.0作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測波長的確定

從生物堿紫外掃描圖可以看出（圖1），4種生物堿均在259 nm處有最大吸收峰，在236 nm處于谷底，超過282 nm后無紫外吸收。甲醇在大于250 nm以后均無紫外吸收干擾，因此選擇259 nm作為4種生物堿的檢測波長。

2.2 檢測條件優(yōu)化

如圖2所示，4種生物堿與雜質(zhì)峰分離較好，保留時間較為適宜。25 min后4種生物堿出峰完成，后續(xù)洗脫時加大流動相B（90%甲醇+10%水，pH 3.8）的比例以沖洗樣品中的醇溶性成分，減少對色譜柱的污染。煙草中極性較強的生物堿能被弱極性的C18柱吸附和分離，原因在于流動相A（90%水+10%甲醇，pH 6.8，0.15%醋酸鈉）處于中性的pH 6.8，抑制了生物堿的離子化，增強其與填料之間的吸附力。煙草中的生物堿為弱堿，在水溶液中以游離態(tài)或單質(zhì)子態(tài)等形態(tài)存在，在檢測時，不同pH的流動相會直接影響到生物堿的存在狀態(tài)。酸性水溶液pH較小，生物堿離子化導致與色譜柱吸附作用降低，因此保留時間減少，難以與溶劑峰、雜質(zhì)峰分離，無法準確檢測;隨著pH的提高，生物堿電離作用減弱，提高了其與填料的吸附力，也就延長了其保留時間。例如，陳燕舞[20]等研究了流動相pH對煙堿保留時間的影響，發(fā)現(xiàn)隨著pH的增加，煙堿的保留時間出現(xiàn)明顯的延長，當流動相pH為3.00時，煙堿保留時間為4.15 min，而當pH為7.00時，保留時間延長至13.37 min。但是流動相pH須小于8.00，否則煙草生物堿不穩(wěn)定，且會降低柱效和影響色譜柱壽命。

2.3 提取條件

煙草4種生物堿屬于分子量較小的極性有機物，易溶于水、甲醇等溶劑，研究者常用不同濃度的酸、堿、乙醇、甲醇等作為提取溶劑。例如，師君麗等[26]和羅瓊等[21]使用10%的氫氧化鈉浸泡提取了煙堿降煙堿麥斯明等8種生物堿;劉正聰?shù)萚25]選擇了5%氫氧化鈉水溶液和無水乙醇混合液提取了可替寧、降煙堿、麥斯明、新煙草堿和煙堿;廖坤等[27]認為單純用異丙醇作提取溶劑萃取時間太長，0.5%的乙酸與異丙醇的混合溶劑提取煙堿效果更好;譚芳等[28]認為將甲醇作為提取溶劑來提取煙堿效果最好。表1結(jié)果表明，6%的鹽酸對煙堿和新煙草堿的提取效果較好，但是對假木賊堿的提取效果很差;各濃度的氫氧化鈉溶液對4種生物堿的提取效果均較差;不同濃度氨水對于新煙草堿提取效果較好，但對于其他3種生物堿的提取效果較差;而5%和10%甲醇對4種生物堿的提取效果均較優(yōu)。由于甲醇為中性溶劑，用甲醇提取的溶液用于HPLC檢測前不需要調(diào)節(jié)pH，因此在處理步驟上更加簡便快捷，并且甲醇具有較好的抑菌性，有利于樣品溶液的儲存，因此綜合考慮后采用5%的甲醇作為提取溶劑。

羅瓊等[21]選擇振蕩30 min提取生物堿;廖坤等[27]認為振蕩30 min提取煙堿的效果較好。表2示出，5%甲醇的振蕩提取25 min和30 min時各生物堿的提取率均高于提取10、15、20 min，提取25 min和30 min無顯著差異，為保險起見，本試驗選擇30 min的振蕩提取時間。

羅瓊等[21]、劉正聰?shù)萚25]、張瑞等[24]、譚芳等[28]均采用了室溫（25 ℃）下提取生物堿。從表3的試驗結(jié)果可以看出，隨著溫度的升高，4種生物堿的提取率有小幅度增加，假木賊堿和新煙草堿在35 ℃條件下提取率有輕微降低，但各處理間沒有顯著差異;并且隨著溫度的升高，提取液明顯可見顏色加深，提取液中色素等雜質(zhì)的含量也隨之升高，考慮到雜質(zhì)對液相色譜柱的影響，本試驗選擇25 ℃作為提取溫度。

儲志兵等[19]選擇的料液比為1：40;丁麗等[13]選擇1：50的料液比;肖遂等[17]進行正交對比試驗認為1：40的料液比更好。從表4的試驗結(jié)果來看，50 mg/20 mL和100 mg/20 mL的料液比條件下提取的生物堿含量差異不顯著，數(shù)值近似，提取完全，而料液比在150 mg/20 mL以上4種生物堿均有降低。與前人研究相比后，決定采用100 mg/20 mL即1：200的料液比作為本試驗樣品的前處理條件。

綜上，最終選擇100 mg/20 mL（1∶200）料液比，5%甲醇在25 ℃室溫下振蕩30 min的提取條件。

2.4 方法學驗證

2.4.1 標準曲線、檢出限及定量限 分別對各濃度的標準溶液進行檢測分析，并對各個生物堿的色譜峰面積及其濃度進行回歸分析，得到回歸方程及相關系數(shù)（表5）。由表5看出，新煙草堿、假木賊堿、降煙堿的線性范圍為0.005～2 μg/mL;煙堿的線性范圍為0.1～50 μg/mL，線性相關系數(shù)R2均大于0.996。煙堿的檢測限為0.006 5 μg/mL，定量限為0.021 7 μg/mL，新煙草堿的檢測限為0.088 4 μg/mL，定量限為0.294 8 μg/mL，假木賊堿的檢測限為0.034 8 μg/mL，定量限為0.116 1 μg/mL，降煙堿稍高，檢測限為0.150 9 μg/mL，定量限為0.503 1 μg/mL。各生物堿的檢出限和定量限均較低，可以滿足各種類型煙草的檢測要求。

2.4.2 方法的重復性與穩(wěn)定性 如表6和表7所示，方法精密度RSD為1.24%～2.56%，重復性RSD為1.62%～4.27%，穩(wěn)定性RSD為1.55%～3.36%，平均加標回收率在98.17%～102.65%之間，RSD在3.64%～4.08%之間。綜合來看，該方法重復性較好，儀器精密度較高，方法穩(wěn)定性較好，加標回收率好，適合用于樣品檢測。

2.4.3 樣品測定 按上述方法對不同類型的煙葉樣品進行檢測后得表8。選用了烤煙、白肋煙、雪茄煙和曬紅煙4種不同類型的煙葉樣品。從表8中可以看出，4種不同類型煙草樣品各生物堿含量差異與文獻[3-4]報道基本一致。

3 結(jié) 論

本文建立了HPLC法測定煙葉中煙堿、降煙堿、新煙草堿和假木賊堿等4種生物堿的方法。通過單一因素篩選，以100 mg/20 mL（1∶200）料液比，5%甲醇在25 ℃室溫下振蕩30 min效果最好;HPLC檢測結(jié)果的線性相關系數(shù)高，檢出限和定量限低，靈敏度高，重復性、穩(wěn)定性及加標回收率均較好。本方法前處理步驟簡單，檢測結(jié)果可靠，適合批量檢測不同類型煙葉樣品中的生物堿含量。

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