李 歡,張靜麗,張?jiān)娪?石明浩,謝 年,周柔靜,劉 蘇 (中國藥科大學(xué)工學(xué)院環(huán)境科學(xué)教研室,江蘇 南京 211198)

近年來抗生素被廣泛應(yīng)用于疾病防治、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、畜牧及水產(chǎn)養(yǎng)殖等領(lǐng)域[1],在使用的過程中,大部分抗生素被生物體排出體外,造成了其在環(huán)境中的大量積累.其中,四環(huán)素類(TCs)抗生素因成本低、抗菌譜廣而成為動(dòng)物醫(yī)療中應(yīng)用最廣泛的抗生素之一[2].盡管環(huán)境水體中 TCs的檢出濃度很低,但由于其在養(yǎng)殖業(yè)和畜牧業(yè)中被長期頻繁使用,殘留在環(huán)境中的 TCs總量大,對水生生態(tài)系統(tǒng)和人體健康構(gòu)成極大的潛在威脅.研究表明,TCs及其代謝產(chǎn)物在水體中不僅會(huì)誘導(dǎo)生物產(chǎn)生抗性基因,還會(huì)對水生生物及人類產(chǎn)生潛在的毒性效應(yīng)[3].其中,鹽酸四環(huán)素(TET)作為重要的 TCs之一,在環(huán)境中分布范圍廣、積累濃度高且不易降解,更應(yīng)值得關(guān)注[4-5].TET能夠抑制或誘導(dǎo)還原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)的活性,并對魚類造成嚴(yán)重的 DNA損傷和免疫毒性[6].因此,TET在水生環(huán)境中的大量殘留帶來的潛在風(fēng)險(xiǎn)不容忽視.

在實(shí)際水環(huán)境中,TET往往與一種或多種毒害污染物共存,污染物共存的多樣性使得復(fù)合污染物的形態(tài)和毒性效應(yīng)更為復(fù)雜[7].研究表明,TET可能會(huì)影響其他共暴露污染物的毒性效應(yīng).例如,TET與Cu聯(lián)合暴露時(shí)會(huì)發(fā)生絡(luò)合反應(yīng),降低 Cu的生物可利用度,進(jìn)而顯著降低Cu對斑馬魚胚胎的發(fā)育毒性,表現(xiàn)出拮抗作用[1].TET和納米二氧化鈦(TiO2-NPs)聯(lián)合暴露時(shí)會(huì)增加 TiO2-NPs與大腸桿菌細(xì)胞接觸的面積,抑制細(xì)胞內(nèi)外的物質(zhì)運(yùn)輸,導(dǎo)致細(xì)胞的代謝中斷或死亡,表現(xiàn)出明顯的協(xié)同作用[8].砷(As)是一種高毒的環(huán)境污染物,廣泛存在于世界各地的環(huán)境水體中[9].As的廣泛分布極大地增加了其與TET共存的可能性.As的過量攝入會(huì)顯著增加人群健康風(fēng)險(xiǎn)[10],氧化應(yīng)激被認(rèn)為是As對水生生物和哺乳動(dòng)物產(chǎn)生毒性最重要的致毒機(jī)制[11].TET的重要致毒機(jī)制之一也是通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激效應(yīng)對斑馬魚等水生生物造成損傷[12].TET和As聯(lián)合暴露時(shí)是否會(huì)通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激對水生生物產(chǎn)生更為嚴(yán)重的損傷尚不清楚.鑒于此,有必要對 TET和 As的聯(lián)合毒性進(jìn)行評估.

由于斑馬魚具有發(fā)育快、繁殖力強(qiáng)和遺傳同源性高等優(yōu)勢,是研究環(huán)境污染物毒性效應(yīng)和環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)的重要模式物種[13],在污染物的聯(lián)合毒性研究中也被廣泛使用.因此,為探究 TET和 As聯(lián)合暴露下對水生生物的毒性效應(yīng),本文選用斑馬魚作為模式生物,結(jié)合組織病理學(xué)、基因表達(dá)、As的含量測定和腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的變化來評估TET和As的聯(lián)合毒性效應(yīng),旨在為TET和As的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù).

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和暴露實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)使用4月齡、健康狀態(tài)良好的雄性斑馬魚,購于中國科學(xué)院水生生物研究所(武漢),使用容積為14L并配有LED燈和曝氣裝置的魚缸進(jìn)行飼養(yǎng),每缸飼養(yǎng)60條斑馬魚.養(yǎng)殖水選用經(jīng)紫外燈照射、除氯 24h的自來水,水溫控制(26±0.5)℃,pH 值控制在7～8,明暗周期為 14h/10h.每天早晚投喂豐年蝦幼蟲(豐年蝦卵在海鹽水中曝氣孵化 24h后使用分離器過濾得到).馴化1周后,斑馬魚隨機(jī)分為4組,暴露方案見表 1.根據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研,我國多地地表水和地下水中TET和As的檢測濃度已達(dá)到10～50μg/L[8]和10～100μg/L[10],結(jié)合早期對TET和As毒性評估時(shí)使用的暴露濃度[4,14],本實(shí)驗(yàn)設(shè)置TET和As的暴露濃度分別為50和100μg/L.實(shí)驗(yàn)中TET購于上海源葉生物科技有限公司.As(Ⅲ) (As(Ⅲ)ICP-MS標(biāo)準(zhǔn)液)購于上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司.在實(shí)驗(yàn)過程中,每天更換1/3左右養(yǎng)殖水.暴露21d后,對斑馬魚進(jìn)行冰凍處死,使用直尺和分析天平分別記錄斑馬魚的體長和體重.隨后對斑馬魚進(jìn)行解剖,采集腸道、肝臟和腸內(nèi)容物樣品.剪取部分腸道和肝臟放入提前裝有1mL福爾馬林(4%甲醛)固定液(西隴科學(xué)股份有限公司)的EP管中.將剩余腸道、肝臟和腸道內(nèi)容物放置于凍存管內(nèi)使用液氮速凍后置于-80℃冰箱保存用于后續(xù)分析.

表1 實(shí)驗(yàn)暴露方案Table 1 Exposure strategy used in this study

1.2 組織病理學(xué)檢測

將斑馬魚腸道和肝臟組織在 10%福爾馬林緩沖液中固定24h,用70%、80%、90%、100%乙醇逐級脫水,將脫水后的組織先后浸漬于無水乙醇、二甲苯混合液及純二甲苯中進(jìn)行透明處理,隨后經(jīng)石蠟包埋,垂直切成4μm切片黏附于載玻片上烘干備用.切片在著色前用二甲苯脫蠟,然后經(jīng)乙醇溶液水化處理.使用蘇木精-曙紅(HE)染色,在100、200和400倍光學(xué)顯微鏡下觀察和拍照,記錄不同暴露組斑馬魚的組織病理學(xué)變化.

1.3 RNA的提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測

斑馬魚腸道和肝臟組織樣本的 RNA提取使用RNA 提取試劑盒(Takara,日本)進(jìn)行,利用超微量分光光度計(jì)(Thermo NanoDrop 2000,美國)檢測總RNA的純度和濃度,以O(shè)D260/OD280作為RNA純度的指標(biāo).對RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為 PrimeScriptRT reagent kit(TaKaRa,日本).以cDNA為模板進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng).RT-qPCR擴(kuò)增條件如下:95℃預(yù)變性30s;95℃變性10s,60℃退火30s,循環(huán)反應(yīng) 40次;循環(huán)完成后,將溫度升至 95℃,持續(xù)15s,然后升至60℃,持續(xù)1min,最后加熱至95℃,以獲得聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物的溶解曲線.以 β-action作為內(nèi)參,使用 2-ΔΔCt方法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對定量分析,比較各組目的基因表達(dá)的差異.目的基因與內(nèi)參引物序列如表2所示.

表2 目標(biāo)基因的qPCR引物序列Table 2 qPCR primer sequence of target gene

1.4 16S rRNA測序及生物信息學(xué)分析

每組中隨機(jī)選取6條斑馬魚的腸道內(nèi)容物作為1個(gè)樣本.采用DNA提取試劑盒(FastDNA? Spin Kit,MP Biomedicals, USA)提取樣本中的 DNA.使用PCR純化試劑盒(QIAquick PCR Purification Kit,QIAGEN, Germany)對得到的 PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化.PCR 擴(kuò)增體系為:2*taq PCR mix:25μL Primer F(10μmol/L):1μL; Primer R(10μmol/L):1μL; gDNA:2～10μL; ddH2O:補(bǔ)足 50μL 體系 PCR 擴(kuò)增程序:1、95℃ 5min; 2、94℃ 1min; 3、57℃ 45s; 4、72℃ 1min,2～4步34個(gè)循環(huán); 5、72 ℃ 10min; 6、16℃ 5min.選取 16S V3-4區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增,該區(qū)域引物序列為:341F:CCTAYGGGRBGCASCAG; 806R:GGACTACNNGGGTATCTAAT.將純化后的PCR產(chǎn)物在Ion S5TMXL高通量測序平臺上測序.對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接、過濾和處理以除去低質(zhì)量的干擾數(shù)據(jù).將預(yù)處理后的測序數(shù)據(jù)利用 QIIME軟件作進(jìn)一步的物種分類,對所有樣品測序數(shù)據(jù)的Effective Tags以97%的相似性將序列聚類成為OTU,并對OTU的代表序列進(jìn)行物種注釋.

1.5 電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)分析

將液氮速凍后的腸道和肝臟新鮮樣品放入凍干機(jī)中冷凍干燥.稱量約 25mg的凍干樣本,并加入2mL36%的硝酸與2mL 40%的雙氧水.經(jīng)加熱消解、趕酸和超純水稀釋定容至 1mL.組織提取液過0.22μm 濾膜,利用 ICP-MS (Agilent 7700,安捷倫科技有限公司)在KED模式下測定As含量.

1.6 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用GraphPad prism 7.0軟件對實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,對照組和實(shí)驗(yàn)組之間的差異采用單因素方差分析.實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)來表示.所有的統(tǒng)計(jì)結(jié)果中以P<0.05視為具有顯著性差異.

2 結(jié)果分析

2.1 TET或/和As對斑馬魚表型特征的影響

如圖1所示,與對照組相比,TET或As的單獨(dú)暴露未導(dǎo)致明顯的體長變化.而TET和As聯(lián)合暴露處理導(dǎo)致斑馬魚的體長顯著地降低(P<0.05).此外,與TET或As單獨(dú)暴露時(shí)相比,TET和As聯(lián)合暴露時(shí)體長的減小也存在顯著性差異(P<0.05).與對照組相比,所有實(shí)驗(yàn)組的體重均無顯著性變化(P>0.05),而與TET組相比,TET和As的聯(lián)合暴露顯著地改變了斑馬魚的體重(P<0.05).結(jié)果表明TET和As的聯(lián)合暴露顯著加重了其單獨(dú)暴露時(shí)對斑馬魚體長和體重的影響.

圖1 TET或/和As的暴露對斑馬魚體長和體重的影響Fig.1 Effects of TET or/and As exposure on body length and weight of zebrafish

2.2 TET或/和 As對腸道和肝臟組織病理學(xué)的 影響

利用HE染色觀察腸道和肝臟的組織病理學(xué)變化.如圖2所示,在對照組中腸絨毛整體形態(tài)比較完整,腸上皮細(xì)胞排列規(guī)則整齊,無明顯的損傷.在TET組發(fā)現(xiàn)了輕微的腸粘膜上皮細(xì)胞脫落現(xiàn)象(藍(lán)色圓圈).As組出現(xiàn)了輕微的腸壁破裂的現(xiàn)象(黑色箭頭).TET+As組出現(xiàn)了明顯的炎性細(xì)胞浸潤(綠色箭頭)并伴有出血的現(xiàn)象(橙色圓圈).肝臟的鏡檢結(jié)果與腸道相似,如圖3所示,對照組的肝臟排列規(guī)則整齊,未見明顯的病變現(xiàn)象.而在 TET組中,觀察到了少量炎性細(xì)胞浸潤的現(xiàn)象(綠色箭頭).在As組中出現(xiàn)了肝索紊亂、竇間隙擴(kuò)大的現(xiàn)象(紅色箭頭).在TET和As聯(lián)合暴露組中觀察到擴(kuò)張的肝血竇中浸潤大量炎性細(xì)胞(綠色箭頭),局部血管周圍出現(xiàn)出血的現(xiàn)象(橙色圓圈).組織病理學(xué)結(jié)果表明,TET和As的聯(lián)合暴露顯著加重了其單獨(dú)暴露時(shí)對腸道和肝臟組織的損傷.

圖2 斑馬魚腸道HE染色切片F(xiàn)ig.2 HE staining section of zebrafish intestine

圖3 斑馬魚肝臟HE染色切片F(xiàn)ig.3 HE staining section of zebrafish liver

2.3 TET或/和 As對腸道和肝臟重要功能基因表達(dá)的影響

腸道的功能性基因表達(dá)結(jié)果如圖 4(a)所示.與對照組相比,腫瘤壞死因子(TNF-α)的表達(dá)水平在TET組和 As組均沒有顯著變化,而在 TET+As組TNF-α的表達(dá)水平顯著地上調(diào) 3.05±0.55倍(P<0.05).與TET和As的單獨(dú)暴露相對比,TET和As的聯(lián)合暴露也明顯地增加了 TNF-α的表達(dá)水平(P<0.05).P-糖蛋白(P-gp)基因的表達(dá)在TET組和As組均沒有顯著差異,而在TET和As聯(lián)合暴露組中顯著地下調(diào),與As組相比,TET和As聯(lián)合暴露組中P-gp的表達(dá)也顯著地下調(diào).與TET和As的單獨(dú)暴露相對比,谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)和原癌基因(C-jun)的表達(dá)在 TET+As組中均顯著上調(diào).緊密連接蛋白(Claudin-1, Occludin)基因的表達(dá)在所有實(shí)驗(yàn)組中均無顯著性差異(P>0.05).腸道基因檢測的結(jié)果表明TET和As的聯(lián)合暴露會(huì)顯著地加重其單獨(dú)暴露時(shí)對腸道造成的損傷且這種損傷與腸道通透性的相關(guān)性不大.

圖4 斑馬魚腸道和肝臟功能基因的表達(dá)Fig.4 Expression of intestinal and liver functional genes in zebrafish

肝臟的功能基因表達(dá)結(jié)果如圖 4(b)所示,與對照組相比,As和TET+As組中的TNF-α的表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05),分別上調(diào)了(1.42±0.25)和(2.45±0.45)倍.與 TET和 As的單獨(dú)暴露相對比,TET和As的聯(lián)合暴露顯著地增加了 TNF-α的表達(dá)(P<0.05).過氧化氫酶(CAT)和GPx的表達(dá)在TET組均沒有顯著性變化,而TET+As組中CAT和GPx基因的表達(dá)顯著上調(diào).此外,C-jun和腫瘤抑制基因(p53)的表達(dá)水平在 TET+As組中也顯著增加(P<0.05).與TET和As的單獨(dú)暴露相對比,TET和As的聯(lián)合暴露明顯地增加了CAT、GPx、C-jun和p53的表達(dá)水平(P<0.05).MRP2(多藥耐藥相關(guān)蛋白-2)基因的表達(dá)在TET和TET+As組中均顯著地下調(diào),與As組相比, TET和As的聯(lián)合暴露顯著地下調(diào)了 MRP2的表達(dá)水平.上述結(jié)果表明 TET和 As的聯(lián)合暴露也會(huì)顯著增加TET和As單獨(dú)暴露時(shí)對斑馬魚肝臟的損傷.

2.4 TET對As在腸道和肝臟分布的影響

利用ICP-MS檢測As在斑馬魚腸道和肝臟的分布.腸道中 As的濃度如圖 5(a)所示,與對照組相比,As和 TET+As組中 As的濃度均顯著性增加(P<0.05),分別達(dá)到(461.68±20.35ng/g)和(704.15±24.50ng/g).與TET組和As組相比,TET和As的聯(lián)合暴露顯著地增加了As在斑馬魚腸道中的積累.肝臟中 As的濃度如圖 5(b)所示,與對照組相比,As和TET+As組中As的濃度均顯著性增加(P<0.05),分別為(322.39±22.28),(458.35±24.25)ng/g.此外,與 TET和As單獨(dú)暴露時(shí)相比,TET與As的聯(lián)合暴露也顯著性增加了As的積累(P<0.05).對As在腸道和肝臟化學(xué)檢測的結(jié)果表明TET和As的共暴露增加了腸道和肝臟中As的積累.

圖5 砷在腸道和肝臟中的濃度Fig.5 The concentration of As in intestine and liver

2.5 TET或/和As對腸道微生物群落的影響

基于 OTU 水平,對樣本進(jìn)行主成分分析(PCA)來確定不同暴露組間微生物群落的分布特征,其中每一個(gè)點(diǎn)表示一個(gè)斑馬魚腸道內(nèi)容物樣本,相同顏色的點(diǎn)表示來自同一個(gè)處理組,兩點(diǎn)之間的距離越近表明兩樣品間的群落構(gòu)成差異越小.如圖 6(a)所示,TET組、As組和對照組相比均有明顯的區(qū)分,而TET+As組與對照組差異性不大,這表明TET和As的單獨(dú)暴露對腸道微生物群落結(jié)構(gòu)具有顯著地影響,但TET和As的聯(lián)合暴露對腸道微生物群落的結(jié)構(gòu)影響較小.如圖6(b)所示,與對照組相比,TET和As的單獨(dú)暴露分別引起5825和3869種不同微生物發(fā)生變化,而TET和As聯(lián)合暴露僅引起623種不同的微生物發(fā)生變化.該結(jié)果也表明TET或As的單獨(dú)暴露顯著地?cái)_亂了腸道微生物群落結(jié)構(gòu),而TET和As的聯(lián)合暴露對腸道微生物群落的影響較小.為觀察斑馬魚腸道微生物在門(phylum)水平上的相對豐度,選取在門水平上的豐度信息,生成相對豐度堆積圖.結(jié)果如圖7所示,可以發(fā)現(xiàn)變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(actinobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)是斑馬魚腸道中的絕對優(yōu)勢菌.與對照組相比,TET的暴露導(dǎo)致變形菌門的豐度從 38%上調(diào)至 87%,As的暴露導(dǎo)致放線菌門的豐度從 15%上調(diào)至 52%,TET和As的聯(lián)合暴露與對照組無明顯差異.經(jīng)典聚類分析(圖7a)的結(jié)果也表明TET組和As組與對照組相比有明顯的區(qū)別,此外,TET組與對照組相比相距較遠(yuǎn),這表明 TET是影響腸道微生物群落變化的主要因素.

圖6 斑馬魚腸道微生物的主坐標(biāo)分析和韋恩圖Fig.6 Principal coordinate analysis and venn diagram of zebrafish intestinal microorganism

圖7 斑馬魚腸道微生物經(jīng)典聚類分析和相對豐度Fig.7 Classical cluster analysis and relative abundance of intestinal microorganism

3 討論

TET和As在水環(huán)境中的廣泛分布對環(huán)境和人體健康存在嚴(yán)重風(fēng)險(xiǎn).盡管TET和As各自的毒性效應(yīng)已有不少文獻(xiàn)報(bào)道,但關(guān)于TET和As同時(shí)暴露的聯(lián)合毒性效應(yīng)及其機(jī)制的研究鮮有報(bào)道.本研究以斑馬魚為模式生物,研究了 50μg/L TET和 100μg/L As的單一暴露和聯(lián)合暴露對斑馬魚腸道和肝臟的影響.結(jié)果表明50μg/L TET的暴露能夠輕微地導(dǎo)致斑馬魚腸絨毛結(jié)構(gòu)破壞,肝臟炎性細(xì)胞浸潤.100μg/L As的暴露可引起斑馬魚腸壁破裂,肝索紊亂和竇間隙擴(kuò)大.此外TET和As的單一暴露均能夠誘導(dǎo)斑馬魚腸道和肝臟一定程度的氧化損傷并誘導(dǎo)腸道微生物群落發(fā)生顯著的變化.與TET和As的單一暴露相比,TET和 As的聯(lián)合暴露能夠顯著增加氧化應(yīng)激、炎癥因子和凋亡因子相關(guān)基因的表達(dá),加重腸粘膜的纖毛損傷和出血,誘導(dǎo)肝臟血管周圍出血和炎性細(xì)胞浸潤.此外還發(fā)現(xiàn)兩者的聯(lián)合暴露顯著增加了 As在腸道和肝臟的累積,這可能是造成 TET和As對斑馬魚腸道和肝臟的協(xié)同毒性的主要原因.

TET進(jìn)入水環(huán)境導(dǎo)致的生態(tài)毒性效應(yīng)已經(jīng)引起人們的高度關(guān)注.據(jù)報(bào)道,20μg/L TET能夠造成斑馬魚胚胎或幼蟲體長縮短、孵化延遲和卵黃囊面積增加等[13].100μg/L TET的暴露可造成腸道微生物群落結(jié)構(gòu)紊亂,以及肝臟脂肪積累[15].本研究中也發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)論,50μg/L TET能夠顯著地增加斑馬魚腸道中變形菌門的豐度,并誘導(dǎo)肝臟組織出現(xiàn)少量炎性細(xì)胞(圖3,圖7).有研究認(rèn)為,氧化應(yīng)激是污染物導(dǎo)致動(dòng)物體內(nèi)誘發(fā)毒性和疾病發(fā)生的重要機(jī)制.在抗氧化防御系統(tǒng)中,CAT和SOD是抵抗ROS的第一道防線,SOD能夠催化 O2-轉(zhuǎn)變成 H2O2,最后在CAT或GPx的作用下轉(zhuǎn)變成H2O[16].GPx是一種重要的抗氧化酶,可作為環(huán)境污染物誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的生物標(biāo)志物[17].本研究發(fā)現(xiàn)TET暴露能顯著增加腸道中GPx基因的表達(dá),這可能由于TET的暴露誘導(dǎo)斑馬魚腸道產(chǎn)生過量的 ROS,激活氧化系統(tǒng),從而使GPx表達(dá)上調(diào).以上數(shù)據(jù)證實(shí)了TET對斑馬魚的生態(tài)毒性.

研究表明,As會(huì)在白粉魚的肝、腎和腸等臟器中積累,并對肝、腎和腸道造成病理學(xué)損傷[14].本研究證實(shí)100μg/L As的暴露能夠顯著誘導(dǎo)斑馬魚肝臟炎癥因子(TNF-α)的表達(dá)上調(diào),破壞腸道上皮細(xì)胞進(jìn)而造成組織病理損傷.As誘導(dǎo)生物毒性的潛在機(jī)制被認(rèn)為與氧化應(yīng)激有關(guān)[11].As可以誘導(dǎo) ROS的增加,破壞蛋白質(zhì)和 DNA或與構(gòu)成細(xì)胞膜的脂肪發(fā)生化學(xué)反應(yīng),產(chǎn)生更具破壞性的脂質(zhì)自由基,進(jìn)而破壞細(xì)胞膜的完整性和功能[17].本研究表明 As的暴露能夠顯著上調(diào)斑馬魚肝臟中 GPx基因的表達(dá),進(jìn)一步證實(shí)了氧化應(yīng)激在 As誘導(dǎo)斑馬魚毒性中的作用.

TET和As的共暴露進(jìn)一步加劇了對斑馬魚毒性的復(fù)雜性.本研究發(fā)現(xiàn),與 TET和 As的單一暴露相比,TET和As的聯(lián)合暴露對斑馬魚的腸道和肝臟的毒性效應(yīng)具有協(xié)同作用.As與環(huán)境污染物的協(xié)同效應(yīng)在其他研究中也有報(bào)道.例如,As和阿特拉津都具有潛在的致畸性和遺傳毒性,并可引起斑馬魚胚胎的氧化應(yīng)激,聯(lián)合暴露時(shí)形成毒性更強(qiáng)的中間代謝物,造成對斑馬魚的更高毒性[18].As和甲基化硒化合物聯(lián)合暴露時(shí),能夠阻斷部分甲基化形式的解毒過程(如甲基化),引起氧化應(yīng)激水平的提高,表現(xiàn)出明顯的協(xié)同毒性[19].本研究表明TET和As聯(lián)合暴露能夠明顯地增加氧化應(yīng)激、炎癥因子和凋亡因子的表達(dá),對斑馬魚的腸道和肝臟造成更嚴(yán)重的損傷.

As的毒性在TET和As的協(xié)同毒性中發(fā)揮著重要的作用.As的毒性效應(yīng)與其形態(tài)有著密切聯(lián)系,通常認(rèn)為 As(Ⅴ)的毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于 As(Ⅲ)[20-21].早期的研究表明腸道微生物群落的變化可能會(huì)導(dǎo)致 As的毒性發(fā)生改變.例如,某些腸道微生物能夠?qū)?As(Ⅲ)主動(dòng)代謝為As(Ⅴ),從而導(dǎo)致As的毒性發(fā)生改變[22].本研究發(fā)現(xiàn)TET和As暴露能夠明顯地影響斑馬魚腸道中變形菌門和放線菌門等優(yōu)勢菌群的豐度,而TET和As的聯(lián)合暴露對腸道微生物群落結(jié)構(gòu)影響不大,這個(gè)結(jié)果表明腸道微生物群落的變化并非是造成TET和As的協(xié)同毒性的原因.微生物群落的變化與環(huán)境污染物毒性效應(yīng)的表征并非完全一致,這一現(xiàn)象在文獻(xiàn)中曾被報(bào)道,如口服納米銀(AgNPs)誘導(dǎo)小鼠腸道和肝臟嚴(yán)重的炎癥和氧化損傷,而小鼠腸道微生物群的組成、結(jié)構(gòu)和多樣性并未發(fā)生明顯變化[23].推測這可能與PCA分析方法有關(guān),首先PCA是建立在微生物DNA提取的基礎(chǔ)上進(jìn)行分析,據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道目前腸道微生物提取效率有限,部分微生物并未被提取到[24],其次,PCA的分析是研究腸道菌群的整體差異,忽略了特異性[25],本研究中腸道和肝臟具體毒性指標(biāo)屬于特異性指標(biāo),相對于整體微生物群落的變化指標(biāo)屬于不同的體系,這可能是導(dǎo)致TET和As聯(lián)合暴露下微生物菌群的變化與毒性效應(yīng)表征不一致的原因.另外,斑馬魚腸道微生物優(yōu)勢菌群主要有厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門等,當(dāng)起毒性作用的屬于少部分微生物時(shí),由于其變化在整個(gè)微生物群中所占的比例很小,導(dǎo)致其在 PCA中沒有體現(xiàn)出來時(shí),可能也會(huì)導(dǎo)致微生物的結(jié)果和聯(lián)合毒性的結(jié)果不同[26].據(jù)以往文獻(xiàn)報(bào)道,生物有效性的變化對污染物的毒性也有顯著的影響,如納米二氧化鈦(TiO2)的加入能夠顯著增強(qiáng)斑馬魚幼魚對鉛的生物累積和吸收,并增強(qiáng)鉛對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育毒性,導(dǎo)致斑馬魚幼魚甲狀腺內(nèi)分泌和神經(jīng)系統(tǒng)的紊亂[27].Cu會(huì)增加氟喹諾酮類化合物(FQS)在斑馬魚腸道和肝臟中的積累,進(jìn)而造成嚴(yán)重的損傷[28].本研究中TET的存在顯著地增加了As在腸道和肝臟的積累,進(jìn)而誘導(dǎo)對腸道和肝臟更嚴(yán)重的損傷.腸道通透性對污染物在生物體內(nèi)的積累有顯著的影響.正常的腸道黏膜屏障能夠有效阻止污染物進(jìn)入機(jī)體,保護(hù)機(jī)體不受外界的侵害[29].然而據(jù)報(bào)道腸道通透性的破壞會(huì)顯著地增加污染物在腸道和肝臟中的積累,進(jìn)而對腸道和肝臟造成一定的損傷[30].Occludin是一種腸上皮緊密連接蛋白,在腸屏障中發(fā)揮重要作用,它對于維持腸粘膜通透性至關(guān)重要[31].本研究發(fā)現(xiàn) Occludin基因的表達(dá)水平在各實(shí)驗(yàn)組中均無顯著性差異,這表明TET和As的協(xié)同毒性可能與腸道通透性的變化無關(guān).P-gp是位于小腸粘膜上皮細(xì)胞的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,能夠?qū)⑦M(jìn)入細(xì)胞的外源化學(xué)物以主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的方式泵出細(xì)胞外,對進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)生物利用度有顯著影響[32].前人的研究表明mdr1a/1b雙基因敲除的小鼠由于P-gp蛋白的活性受到抑制,會(huì)導(dǎo)致As的排出受到限制,組織中的As蓄積增加,顯著地加劇了As的急性毒性[33].本研究發(fā)現(xiàn)TET和As的聯(lián)合暴露能夠明顯下調(diào)P-gp基因在腸道的表達(dá).基于以上分析,推測 TET和 As的聯(lián)合暴露導(dǎo)致斑馬魚腸道中 P-gp基因的活性受到抑制,使As的外排量減少,增加了As在腸道的積累,部分As通過血液循環(huán)到達(dá)肝臟,對腸道和肝臟造成嚴(yán)重的損傷.

4 結(jié)論

4.1 TET和As的單一暴露可導(dǎo)致斑馬魚腸絨毛結(jié)構(gòu)破壞,肝臟炎性細(xì)胞浸潤,并誘導(dǎo)斑馬魚腸道和肝臟一定程度的氧化損傷.

4.2 與TET和As的單一暴露相比,TET和As的聯(lián)合暴露對斑馬魚的腸道和肝臟均產(chǎn)生明顯的協(xié)同毒性,這可能與P-gp基因被抑制介導(dǎo)的As蓄積增加有關(guān).