王麗娜 劉春梅 胡葉青 莊守存

1.河北省唐山市豐南區(qū)胥各莊鎮(zhèn)中心衛(wèi)生院(063300)； 2.河北省唐山市人民醫(yī)院；3.河北省唐山市豐南區(qū)婦幼保健院

妊娠期糖尿病(GDM)發(fā)病因素尚未完全明確，但研究認(rèn)為其與遺傳、炎癥反應(yīng)、胰島素抵抗(IR)、微小RNA(miRNA)、糖脂代謝異常等相關(guān)[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-27a作為miR-27基因家族重要成員，其在IR細(xì)胞中呈高表達(dá)，且具有診治糖尿病IR的潛在價(jià)值[3]；另外，過氧化物酶增殖體激活受體-γ(PPAR-γ)在GDM女性中水平異常，其可能在GDM病理發(fā)展過程中起重要作用[4]。此外，因IR是GDM發(fā)病重要因素，故臨床常以穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)判斷GDM IR水平，且HOMA-IR在GDM孕婦中水平上調(diào)，有助于評估GDM[5]。推測miR-27表達(dá)異常與GDM病理變化有關(guān)。基于此，本研究擬通過初步檢測GDM孕婦血清miR-27、PPAR-γ水平，分析兩者相關(guān)性，以期為臨床診治GDM提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院與唐山市豐南區(qū)婦幼保健院合并以來2017年5月-2020年7月診治的GDM孕婦(GDM組)，按有關(guān)診療指南標(biāo)準(zhǔn)診斷[6]。納入標(biāo)準(zhǔn)：單胎妊娠，符合GDM相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)；檢查資料完整，自愿配合完成研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并甲狀腺疾病、肝腎功能不全、垂體腎上腺、高血壓；②孕前患有糖尿病；③合并惡性腫瘤、多囊卵巢綜合征；④有吸煙、飲酒不良嗜好；⑤有分娩多胎、畸形胎兒、宮內(nèi)生長受限胎兒、死胎史；⑥輔助生殖技術(shù)受孕。同期產(chǎn)前檢查健康孕婦(對照組)。孕婦及家屬簽署知情同意書，研究符合經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1樣本采集收集孕婦空腹外周靜脈血置無菌真空管中，均分成兩份。一份于室溫下靜置30min，離心分離血清，檢測血清miR-27、PPAR-γ水平；另一份置含肝素抗凝管中離心分離血漿，檢測空腹胰島素(FINS)、空腹血糖(FBG)水平。檢測送本市三甲醫(yī)院完成。

1.2.2血清miR-27檢測實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)法。取適量凍存血清冰上解凍，加適量cel-miR-39(校正血清miR-27水平)，按miRNA純化試劑盒(上海富衡生物科技有限公司)說明純化miRNA。根據(jù)microScript microRNA cDNA Synthesis Kit(艾美捷科技有限公司)說明書獲取cDNA。參照miRNA qRT-PCR Kit(北京博邁斯科技發(fā)展有限公司)說明書配反應(yīng)體系，利用qRT-PCR儀(上海力新儀器有限公司)擴(kuò)增。引物均由上海生工生物工程公司合成，以2-△CT法分析血清miR-27相對表達(dá)量，其中△CT=目的基因CT值-cel-miR-39 CT值。

1.2.3血清PPAR-γ檢測酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)。取出人PPAR-γ ELISA試劑盒(上海瓦蘭生物科技有限公司)，依照其說明書將標(biāo)準(zhǔn)品配制成一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，檢測標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度，繪制PPAR-γ標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線；解凍適量血清，室溫下平衡20 min，于酶標(biāo)板中加血清，37℃培養(yǎng)箱中孵育30min，加生物素工作液(含PPAR-γ抗體)，37℃孵育50min 后棄反應(yīng)液，磷酸緩沖液洗3次后 加顯色液，37℃孵育30min 加終止液，利用酶標(biāo)儀(上海格索普生物科技有限公司)測定樣本450nm處吸光度值，計(jì)算血清PPAR-γ濃度。

1.2.4檢測IR相關(guān)指標(biāo)解凍適量血漿，利用人胰島素試劑盒(上海恒斐生物科技有限公司)按化學(xué)發(fā)光法檢測FINS水平；利用葡萄糖測定試劑盒(上海榕柏生物技術(shù)有限公司)及全自動(dòng)生化分析儀(北京益仁恒業(yè)科技有限公司)檢測FBG水平。利用HOMA-IR評價(jià)IR水平，HOMA-IR=FINS×FBG/22.5。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料

GDM組131例，年齡(29.9±6.1)歲(23～38歲)，孕周(33.9±3.6)周(28～38周)；產(chǎn)次(1.8±0.8)次(1～3次)；孕前體質(zhì)量(54.8±6.5)kg(48～65 kg)。對照組135例，年齡(30.1±6.2)歲(23～38歲)；孕周(34.1±3.6)周(28～38周)；產(chǎn)次(1.7±0.7)次(1～3次)；孕前體質(zhì)量(55.0±6.6)kg(47～66 kg)。兩組上述指標(biāo)無差異(P>0.05)。

2.2 血清miR-27、PPAR-γ水平

與對照組相比，GDM組血清miR-27水平升高，PPAR-γ水平降低， FINS、FBG、HOMA-IR水平GDM組均高于對照組(均P<0.05)。見表1。

表1 兩組血清各檢測指標(biāo)水平比較

2.3 GDM孕婦血清各指標(biāo)相關(guān)性

Pearson法分析顯示，GDM孕婦血清miR-27水平與HOMA-IR呈正相關(guān)(P<0.05)，血清PPAR-γ水平與HOMA-IR呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。見表2。GDM孕婦血清miR-27水平與PPAR-γ呈負(fù)相關(guān)(r=-0.457，P<0.05)。見圖1。

表2 GDM孕婦血清miR-27、PPAR-γ水平與FINS、FBG、HOMA-IR的相關(guān)性

圖1 GDM孕婦血清miR-27水平與PPAR-γ的相關(guān)性

3 討論

GDM可導(dǎo)致產(chǎn)婦發(fā)生感染、流產(chǎn)，升高畸形胎兒、極低體重兒、新生兒低血糖發(fā)生率，對母嬰健康構(gòu)成極大威脅[7]。且GDM診療有一定局限性，尋找與GDM發(fā)病相關(guān)因素及時(shí)干預(yù)，對改善孕婦及胎兒結(jié)局有積極意義。

miRNA是穩(wěn)定存在于血清、血漿的RNA小分子，其可調(diào)控自噬、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞發(fā)育、炎癥反應(yīng)等生理病理過程，與糖尿病腎病、糖尿病、肥胖、GDM發(fā)病進(jìn)程關(guān)系密切[8-9]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-27可通過與靶基因PPAR-γ結(jié)合影響脂肪細(xì)胞分化、增殖、脂肪代謝、胰島素信號傳導(dǎo)及炎癥反應(yīng)[10]。體外研究顯示，miR-27a可通過調(diào)節(jié)胰島素信號通路及靶向作用PPAR-γ，進(jìn)而影響脂肪細(xì)胞IR[11]；另外在2型糖尿病患者血清中表達(dá)上調(diào)[12]。以上研究表明，miR-27表達(dá)失調(diào)可能與IR類疾病顯著相關(guān)。本研究中GDM組孕婦血清miR-27表達(dá)水平高于對照組，推測高水平miR-27可能通過靶向相關(guān)基因，影響有關(guān)信號傳導(dǎo)途徑促進(jìn)炎癥反應(yīng)，進(jìn)而調(diào)節(jié)血糖代謝，促進(jìn)IR[3]，從而影響GDM疾病進(jìn)展。具體機(jī)制仍有待研究證實(shí)。

PPAR-γ可影響胎盤發(fā)育、胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞分化、能量代謝，調(diào)節(jié)血壓，抑制炎癥反應(yīng)，與糖尿病、糖尿病腎病、GDM病變過程密切相關(guān)[13-14]。研究發(fā)現(xiàn)，PPAR-γ在GDM孕婦胎盤中水平異常，可能通過影響炎癥反應(yīng)在GDM疾病進(jìn)展中發(fā)揮作用[15]；另外，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究顯示，PPAR-γ在妊娠糖尿病大鼠中表達(dá)下調(diào)，經(jīng)肉桂醛給藥后表達(dá)上調(diào)，PPAR-γ可能參與并影響妊娠糖尿病[16]。以上研究表明，PPAR-γ異常表達(dá)可能與GDM有關(guān)。本研究中GDM組孕婦血清PPAR-γ水平低于對照組，提示PPAR-γ可能在GDM病理過程中起作用，究其原因，低水平PPAR-γ抑制炎癥能力降低，使糖脂代謝紊亂，影響胎盤代謝及IR，從而影響GDM發(fā)生發(fā)展過程，但作用機(jī)制仍需深入探究證實(shí)。

IR是一種由各種因素引發(fā)胰島素作用的細(xì)胞、組織器官利用葡萄糖能力降低的病理狀態(tài)，可由生理性發(fā)展成GDM[17]。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)INS、FBG、HOMA-IR在GDM孕婦中水平均上升，且HOMA-IR是GDM發(fā)生的危險(xiǎn)因素，患者對胰島素敏感性降低[18]。本研究中GDM組孕婦FINS、FBG、HOMA-IR水平均高于對照組，與譚晶等[18]研究結(jié)果相符，提示IR與GDM發(fā)病進(jìn)展相關(guān)。

朱磊等[19]研究顯示，低氧訓(xùn)練可通過miR-27影響靶基因PPAR-γ表達(dá)進(jìn)而改善血脂水平，影響體脂含量。本研究探討GDM孕婦血清指標(biāo)相關(guān)性顯示，血清miR-27水平與PPAR-γ呈負(fù)相關(guān)，提示miR-27可能與PPAR-γ相互影響共同影響GDM病情進(jìn)展，但具體影響機(jī)制有待深入研究證實(shí)。本研究GDM孕婦血清miR-27水平與HOMA-IR呈正相關(guān)，PPAR-γ水平與HOMA-IR呈負(fù)相關(guān)，提示miR-27、HOMA-IR可能與IR相互作用共同在GDM進(jìn)展中發(fā)揮作用。

綜上所述，GDM孕婦血清miR-27水平上調(diào)，PPAR-γ水平降低，兩者呈負(fù)相關(guān)，其可能與IR相互影響，進(jìn)而共同影響GDM疾病過程，miR-27、PPAR-γ可能是診治GDM的潛在靶標(biāo)。但本研究未對miR-27、PPAR-γ在GDM中機(jī)制進(jìn)行深入探究，后續(xù)將加大樣本量進(jìn)一步探討。