張麗，劉娜，張彥青，張彥，曹利慧

(衡水學(xué)院，河北 衡水 053000)

高粱紅色素，屬于黃酮類色素，含有多個(gè)酚羥基，具有特別強(qiáng)的抗氧化活性，可以用于食品、醫(yī)藥、化妝品和染色劑等領(lǐng)域[1-4]。雙水相萃取技術(shù)是一種新型的萃取分離技術(shù)，它的優(yōu)點(diǎn)在于所需設(shè)備簡單、易于操作、傳質(zhì)速度快、條件較溫和、分相時(shí)間較短、易于工藝放大和連續(xù)進(jìn)行操作[5-9]。關(guān)晴月等[10]采用超聲波法和響應(yīng)面分析法對(duì)紫甘薯色素的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化；姜彬等[11]采用雙水相法萃取食用色素檸檬黃；王紅艷等[12]以PEG/(NH4)2SO4為雙水相體系對(duì)食用色素進(jìn)行萃取分離，結(jié)果表明體系具有溶劑價(jià)格低廉、毒性較低、較易揮發(fā)而不需要反萃取等特點(diǎn)。因此，研究雙水相法萃取分離高粱紅色素的最佳工藝條件是非常有意義的。本文確定雙水相體系，進(jìn)行單因素測定，確定PEG分子量、PEG質(zhì)量、(NH4)2SO4質(zhì)量、水浴加熱溫度、粗提取液體積的最佳值。采用響應(yīng)面分析法進(jìn)行分析，得出萃取條件的最優(yōu)值。

續(xù) 表

1 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

1.1 試劑及儀器

95%乙醇(AR)、AB-8大孔樹脂(AR)、PEG(1000，2000，4000，6000)、(NH4)2SO4(AR)：天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠。

722G可見分光光度計(jì) 上海儀電分析儀器有限公司；高速萬能粉碎機(jī) 天津泰斯特儀器有限公司；TD4臺(tái)式低速離心機(jī) 湖南赫西儀器裝備有限公司；BL6-180A超聲波清洗機(jī) 上海比朗儀器有限公司；RE-52C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.2 高粱色素純品的制備

取適量的AB-8大孔樹脂[13-14]于帶塞三角瓶中，再加入無水乙醇沒過大孔樹脂，在室溫下密封浸泡8 h，然后用蒸餾水多次沖洗，直到AB-8大孔樹脂無醇味后備用。

準(zhǔn)確稱取5 g預(yù)處理好的高粱粉末于錐形瓶中，再加入90 mL 40%乙醇和pH 9的氫氧化鈉10 mL，將溫度設(shè)置為50 ℃，超聲提取30 min，過濾后取上清液，然后將事先處理好的AB-8大孔樹脂裝入洗凈晾干的層析柱中，用蒸餾水水洗，緩慢加入上清液進(jìn)行吸附，吸附完全后，用30%乙醇洗脫，重復(fù)以上的過程，得到純化后的高粱色素。將純化后的高粱色素，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸發(fā)出乙醇，得到純的高粱色素固體，然后放入干燥箱中干燥至色素粉末，備用。

1.3 高粱色素波長的測定

取紅高粱色素[15]精制品0.0500 g 用18 mL 40%乙醇和pH 9的氫氧化鈉溶液2 mL充分混合后，用40%乙醇定容到20 mL，使用可見分光光度計(jì)測定200～800 nm范圍內(nèi)的吸光度。

由圖1可知，波長逐漸增加，吸光度值出現(xiàn)先增加后減少的趨勢，最高點(diǎn)出現(xiàn)在494 nm處，故最佳波長為494 nm。

圖1 紅高粱色素吸收光譜Fig.1 The absorption spectra of red sorghum pigment

1.4 高粱色素的標(biāo)準(zhǔn)曲線

取0.0412 g的高粱色素完全溶解于40%乙醇中，然后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，加入10 mL濃度為0.01 mol/L的NaOH溶液，用40%乙醇定容至100 mL，再用移液管移取5，10，15，20，25 mL至5個(gè)100 mL容量瓶中，用乙醇的堿溶液(乙醇與堿的比例為9∶1)定容至100 mL，在494 nm的波長下測定吸光度值。在0～100 mg/L范圍內(nèi)，濃度與吸光度值標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程為：A=-0.00283+0.00990c，相關(guān)系數(shù)R2=0.9996。

1.5 雙水相體系的確定

用移液管移取1 mL高粱紅色素溶液于10 mL刻度離心管內(nèi)，再加入適量的PEG和(NH4)2SO4，最后加入蒸餾水至10 g。上下?lián)u動(dòng)，使其完全溶解，放入離心機(jī)中以2000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，形成雙水相，上相是PEG萃取的色素相，下相為鹽相，倒入分液漏斗后靜置，使其上下相分離，測定上下相的體積并記錄，然后在494 nm的波長下測定上下相的吸光度值，計(jì)算萃取率。

萃取率：Y=上相色素含量/總含量。

1.6 PEG種類和濃度及(NH4)2SO4濃度對(duì)色素吸光度的影響

在10 mL刻度離心管中加入1 mL的色素，分別加入5%、10%、15%、20%的PEG，或者濃度為5%、10%、15%、20%、25%、30%的(NH4)2SO4，加入蒸餾水至10 g，參比為不含色素的溶液，重復(fù)以上步驟，并分別測定不同濃度的PEG1000、PEG2000、PEG4000、PEG6000的吸光度值。在測定的范圍內(nèi)，PEG的分子量和濃度及(NH4)2SO4的濃度對(duì)色素的吸光度影響不大，所以可用相應(yīng)的溶液作參比來消除產(chǎn)生的影響。

2 超聲波輔助雙水相萃取紅高粱色素的工藝研究

2.1 聚乙二醇分子量對(duì)萃取效果的影響

在10 mL刻度離心管中加入1 mL的色素溶液，再加入不同種類的1.8 g PEG(PEG的種類分別為PEG1000、PEG2000、PEG4000、PEG6000)和1.5 g(NH4)2SO4，用蒸餾水定容至10 g，以30 ℃的溫度水浴加熱10 min，放入離心機(jī)中以2000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，可以明顯地看到，刻度離心管內(nèi)分成兩相，倒入分液漏斗內(nèi)靜置后，測定上層和下層的體積(參比液為不加色素的雙水相溶液)，在494 nm的波長下測定吸光度值，代入萃取率的公式得出萃取率。

由圖2可知，PEG2000的萃取率最高，所以采用PEG2000的分子量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，故在下面的測定過程中選擇PEG2000作為測定標(biāo)準(zhǔn)。

圖2 PEG的分子量對(duì)萃取率的影響Fig.2 Effect of PEG molecular weight on the extraction yield

2.2 聚乙二醇質(zhì)量對(duì)萃取效果的影響

在10 mL刻度離心管中加入1 mL的色素，再加入不同質(zhì)量(1.2%、1.5%、1.8%、2.1%、2.4%)的PEG2000和1.5 g的(NH4)2SO4，用蒸餾水定容至10 g，參比為不含色素的雙水相溶液，重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)步驟，在494 nm的波長下測定吸光度值。

由圖3可知，隨著PEG2000質(zhì)量逐漸增加，體系的萃取率呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢，可能是質(zhì)量增加過高時(shí)，PEG2000部分很難溶解，不能很好地形成雙水相體系，導(dǎo)致萃取率降低。所以1.8 g PEG2000和1.5 g (NH4)2SO4形成的雙水相萃取率最高，故在下面的測定過程中選擇1.8 g PEG2000作為測定標(biāo)準(zhǔn)。

圖3 PEG2000質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)萃取率的影響Fig.3 Effect of PEG2000 mass fraction on the extraction yield

2.3 (NH4)2SO4質(zhì)量對(duì)萃取效果的影響

在10 mL刻度離心管中加入1 mL的色素，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.8 g PEG2000和不同質(zhì)量(1.0，1.5，2.0，2.5 g)的(NH4)2SO4，用蒸餾水定容至10 g，參比液為不含色素的雙水相溶液，重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)步驟，在494 nm的波長下測定吸光度值。

由圖4可知，當(dāng)鹽的質(zhì)量大于1 g時(shí)，由于鹽效應(yīng)的影響，PEG相變渾濁且萃取率略有降低，當(dāng)質(zhì)量低于1 g時(shí)，鹽的濃度過低，雙水相為渾濁溶液，不分層。所以選擇加入質(zhì)量為1.8 g的PEG2000和質(zhì)量為1 g的(NH4)2SO4形成的雙水相體系萃取率最高，故在下面的測定過程中選擇1 g (NH4)2SO4作為測定標(biāo)準(zhǔn)。

圖4 (NH4)2SO4質(zhì)量對(duì)萃取率的影響Fig.4 Effect of (NH)2SO4 mass on the extraction yield

2.4 溫度對(duì)萃取效果的影響

在PEG的質(zhì)量為1.8 g、(NH4)2SO4的質(zhì)量為1 g時(shí)，將10 mL刻度離心管放入恒溫水浴鍋內(nèi)加熱10 min，將每次的溫度分別設(shè)置為20，30，40，50，60 ℃，加熱10 min后取出，參比液為不含色素的雙水相溶液，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)步驟，在494 nm的波長下測定吸光度值。

由圖5可知，隨著溫度的升高，色素能更好地溶于PEG相中，但當(dāng)溫度超過50 ℃時(shí)，PEG相與(NH4)2SO4互溶，出現(xiàn)不分層現(xiàn)象，當(dāng)溫度低于20 ℃時(shí)，雙水相的分層也不明顯，故溫度為30 ℃時(shí)萃取效果最佳。

圖5 水浴溫度對(duì)萃取率的影響Fig.5 Effect of water bath temperature on the extraction yield

2.5 粗提取液體積對(duì)萃取效果的影響

在10 mL刻度離心管中加入1.8 g PEG2000、1 g (NH4)2SO4，再加入不同體積的粗提取液(0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL)，加蒸餾水至10 g，用不含色素體積的相同溶液做參比，重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)步驟，在494 nm的波長下測定吸光度值。

由圖6可知，隨著粗提取液的增加，萃取率先增加后減少，當(dāng)提取液的體積大于1.0 mL時(shí)，雙水相萃取色素的體積有限，則沒被萃取的色素殘留在下層，所以萃取率降低。當(dāng)提取液的體積小于0.5 mL時(shí)，雙水相上下層分離不明顯，原因是色素含量較低，所以粗提取液的體積為1.0 mL時(shí)萃取率最高。

圖6 粗提取液體積對(duì)萃取率的影響Fig.6 Effect of crude extract volume on the extraction yield

2.6 提取條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)采用Design-Expert軟件進(jìn)行響應(yīng)面的設(shè)計(jì)[16-18]。選取PEG2000的質(zhì)量、(NH4)2SO4的質(zhì)量、粗提取液的體積、加熱溫度，在上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，以萃取率為響應(yīng)值來設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，見表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案Table 1 Response surface experimental design scheme

利用Design-Expert響應(yīng)面對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，得到以萃取率為響應(yīng)值的二次回歸模型:

萃取率=96.66+0.57A+0.96B+0.24C-0.012AB+0.32AC+0.16AD+0.18BC+0.46BD+0.055CD-2.49A2-2.28B2-1.41C2-4.77D2。

表2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results

對(duì)回歸模型進(jìn)行分析，由表3可知，PEG2000的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和溫度的影響極顯著，粗提取液體積的影響顯著，(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響不顯著，所以，各因素對(duì)萃取率的影響為D>B>A>C。

表3 回歸方程方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance of regression equation

2.7 響應(yīng)曲面分析

圖7 色素體積和PEG2000質(zhì)量對(duì)萃取率的影響

圖8 色素體積和(NH4)2SO4質(zhì)量對(duì)萃取率的影響

圖9 色素體積和溫度對(duì)萃取率的影響

圖10 (NH4)2SO4質(zhì)量和PEG2000質(zhì)量對(duì)萃取率的影響

圖11 溫度和PEG2000質(zhì)量對(duì)萃取率的影響

圖12 (NH4)2SO4質(zhì)量和溫度對(duì)萃取率的影響

上述三維空間曲面圖考察了交互項(xiàng)對(duì)萃取率的影響，再用Design-Expert軟件進(jìn)行回歸分析的優(yōu)化，可以得出高粱色素的最佳條件：色素體積為1.03 mL，PEG2000質(zhì)量為1.85 g，(NH4)2SO4質(zhì)量為1.02 g，水浴加熱溫度為30.82 ℃，加蒸餾水定量至10 g?？紤]到實(shí)際操作的可能性，將其變更為：色素體積為1.00 mL，PEG2000質(zhì)量為1.8 g，(NH4)2SO4質(zhì)量為1 g，水浴加熱溫度為30.00 ℃，加蒸餾水定量至10 g。用該條件進(jìn)行驗(yàn)證，得出該模型的萃取率為98.25%，結(jié)果合理有效，可以應(yīng)用于實(shí)際中。

3 結(jié)論

采用雙水相法萃取分離紅高粱色素，首先純化粗提取的紅高粱色素，制作相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定回歸方程。然后確定494 nm為其最大吸收波長，通過查閱資料確定雙水相體系的組成為PEG/(NH4)2SO4，考察PEG分子量、PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)、(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)、水浴加熱溫度、粗提取液的體積對(duì)色素萃取率的影響，由此建立的多項(xiàng)回歸方程能較好地反映實(shí)際情況的萃取，得到最佳的萃取效果是：1.8 g的PEG2000，1 g的(NH4)2SO4，水浴加熱溫度為30 ℃，加入粗提取液1 mL，加蒸餾水定量至10 時(shí)，紅高粱色素的萃取效果最佳，為98.25%。