許強(qiáng), 袁樂梅, 唐雪梅, 邊名鴻*

(1.固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 宜賓 644000；2.四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 宜賓 644000)

隨著人們生活品質(zhì)的提高及健康意識的逐漸提升，具有一定益生特性的微生物菌劑的開發(fā)及應(yīng)用受到了廣泛關(guān)注。在人、畜體內(nèi)，乳酸菌是重要的菌群，具有維持微生態(tài)平衡的作用，是影響宿主健康的主要益生菌之一[1]。在體外，乳酸菌有類似抗氧化劑的作用，在抗氧化酶的作用下，可以清除體內(nèi)的超氧陰離子及過氧化氫等，有降低機(jī)體氧化損傷、延緩衰老及預(yù)防病變的作用，是一種新型的天然抗氧化劑，因此在食品、醫(yī)藥等行業(yè)中應(yīng)用非常廣泛[2]。

乳酸菌廣泛存在于醪糟、酸奶、泡菜等傳統(tǒng)發(fā)酵食品中，其中有不少具有特殊生理功能的菌株[3]，李丹丹等[4]發(fā)現(xiàn)在西藏牦牛酥油中存在自由基清除能力較強(qiáng)的乳酸菌，王琪等[5]在酸粥發(fā)酵液中篩選得到一株抗氧化活性較強(qiáng)的乳酸菌，鑒定為短乳桿菌。川西彝族酸菜產(chǎn)自川西高海拔地區(qū)，是彝族的傳統(tǒng)美食，在高寒高海拔生態(tài)環(huán)境中網(wǎng)羅了較多功能性強(qiáng)的微生物[6]，乳酸菌是其發(fā)酵過程中重要的優(yōu)勢微生物，其中大多數(shù)具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性。將其中抗氧化活性較強(qiáng)的乳酸菌經(jīng)分離篩選后應(yīng)用到傳統(tǒng)發(fā)酵食品中，不僅可以得到具有抗氧化特性的食品，還可以改善發(fā)酵食品的風(fēng)味，具有較好的研究價值和開發(fā)前景。

本研究以彝族酸菜汁中篩選的乳酸菌為出發(fā)菌株，對比分析其抗氧化能力及胃腸道耐受性能力，旨在篩選具有益生菌潛力的乳酸菌，為乳酸菌益生菌劑的合理開發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

彝族酸菜汁中分離到的40株乳酸菌：實(shí)驗(yàn)室保藏；大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)：四川輕化工大學(xué)公共實(shí)驗(yàn)室保藏。

MRS液體培養(yǎng)基：北京陸橋技術(shù)股份有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、牛膽鹽、胃蛋白酶、胰酶、過氧化氫、鄰苯三酚、三羥甲基氨基甲烷、硫酸亞鐵、水楊酸等：合肥博美生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)儀器

DM300生物顯微鏡 徠卡儀器有限公司；PHS-2C精密pH計 上海虹益儀器儀表有限公司；756紫外可見分光光度計 上海奧普勒儀器有限公司；5424R高速冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司；Scientz-IID超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；2720 thermal cycler PCR儀 Applied Biosystems公司；JY04S-3C凝膠成像系統(tǒng) 君意東方電泳設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 具有抗氧化性菌株的篩選

取乳酸菌發(fā)酵液于離心機(jī)中離心10 min后，用pH為7的PBS緩沖液反復(fù)吹打菌體，離心，重復(fù)3次后將菌體重懸至9.0 log CFU/mL。將菌懸液用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)冰浴破碎10 min，離心2 min后保留上清液，備用。

1.3.1.1 還原能力的測定

參照Lin等[7]的操作方法測定乳酸菌的還原能力，記錄其OD700 nm值。

1.3.1.2 清除羥自由基能力的測定

參照柳青[8]的方法測定乳酸菌羥自由基清除能力，計算公式如下：

清除羥自由基能力/%=(Ai-Aj)/(A0-Aj)×100%。

式中：Ai為DPPH乙醇溶液(0.2 mmoL/L)在OD517 nm的吸光值；Aj為以1 mL蒸餾水代替樣品液的對照組；A0為用1 mL蒸餾水代替樣品且體系中不包含H2O2的空白組。

1.3.1.3 清除超氧陰離子自由基能力的測定

參照Wang等[9]的研究方法，測定乳酸菌清除超氧陰離子自由基能力，計算公式如下：

清除超氧陰離子自由基能力/%=(△Ai-△A0)×100/△A0。

式中：△Ai和△A0為加入樣品和去離子水之前和之后鄰苯三酚自氧化的速率。

1.3.1.4 對DPPH自由基清除能力的測定

參照Wang等的研究方法，測定乳酸菌對DPPH自由基的清除能力，計算公式如下：

DPPH自由基清除能力=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%。

式中：A0為以1 mL乙醇代替樣品液的對照組；Ai為DPPH乙醇溶液(0.2 mmol/L)在OD517 nm的吸光值；Aj為以1 mL乙醇代替DPPH乙醇溶液的空白組。

1.3.1.5 耐受過氧化氫的能力

將乳酸菌菌懸液接種至H2O2濃度分別為0，0.4，0.7，1.0 mmol/L的MRS液體培養(yǎng)基中37 ℃恒溫培養(yǎng)。每隔2 h取樣，在OD600 nm處測定吸光值，觀察各組培養(yǎng)物對不同濃度H2O2耐受能力的變化情況[10]。

1.3.2 乳酸菌通過人體胃腸道能力的檢測

1.3.2.1 耐酸性

參照Abolfazl等[11]的方法并稍作修改，將乳酸菌接種至pH 2和pH 3的MRS液體培養(yǎng)基中。乳酸菌在pH 2的條件下培養(yǎng)60 min，在pH 3的條件下培養(yǎng)180 min，用傾注法計算乳酸菌菌落數(shù)。

1.3.2.2 膽鹽耐受性

參考陳歡等[12]的方法并稍作修改，將乳酸菌接種至牛膽鹽含量為0%、0.3%、0.5%和1.0%的MRS液體培養(yǎng)基中。培養(yǎng)24 h后，使用傾注法計算乳酸菌菌落數(shù)，并計算乳酸菌的膽鹽耐受能力。

1.3.2.3 對人工胃液和腸液的耐受性

將菌懸液分別加入10 mL的人工胃液和人工腸液，37 ℃厭氧培養(yǎng)。在人工胃液培養(yǎng)3 h時取樣，人工腸液培養(yǎng)4 h時取樣，梯度稀釋后以傾注法計算乳酸菌存活的菌落數(shù)并計算乳酸菌存活率。

1.3.2 4 菌株16S rRNA分子生物學(xué)鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

將功能性較好的菌送至擎科生物公司測定16S rRNA序列，用Nucleotide BLAST對比后用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 具有體外抗氧化能力菌株的篩選

2.1.1 還原力和清除羥自由基清除能力

乳酸菌具有一定的還原能力，能避免細(xì)胞受到活性氧的傷害[13]。而羥自由基是最活躍的ROS，會導(dǎo)致DNA、蛋白質(zhì)和多糖化合物等的損傷，羥基自由基清除能力是反映菌株抗氧化能力的重要參數(shù)之一[14]。

由表1可知，菌株無細(xì)胞提取液(CFE)和菌懸液(IC)的還原力大于100 μmol/L L-半胱氨酸鹽酸鹽當(dāng)量的菌株有20株，其中E5菌株的CFE與IC的還原力最高，分別達(dá)到227.33 μmol/L和290.67 μmol/L。所選菌株中有15株菌的CFE和IC的羥自由基清除能力大于30%，其中菌株LBS8的CFE羥自由基能力高達(dá)50.77%； LBS3的IC羥自由基清除能力為41.08%。不同乳酸菌對羥自由基清除能力有較大差異，可能是由于不同乳酸菌分泌抗氧化物質(zhì)的種類和含量不同[15]。

表1 乳酸菌的還原力和清除羥自由基能力Table 1 The reducing power and hydroxyl radical scavenging ability of lactic acid bacteria

2.1.2 菌株超氧陰離子及DPPH自由基清除能力

選擇2.1.1中具有較高還原能力(IC和CFE>100 μmol/L)和羥自由基清除能力(IC和CFE>30%)的15株乳酸菌，測定其超氧陰離子自由基清除能力。

由表2可知，所選的菌株中有12株菌的CFE和IC的超氧陰離子自由基清除能力大于70%，其中MRS12的CFE超氧陰離子自由基清除能力高達(dá)82.91%，MC6的IC超氧陰離子自由基清除能力高達(dá)81.94%。所選15株菌中CFE和IC的DPPH清除能力大于30%的菌株有10株，其中MC2的CFE的DPPH自由基清除能力高達(dá)36.52%，MRS5的IC的DPPH自由基清除能力能達(dá)到39.11%，與Zhang等[16]提出的高活性乳酸菌概念相符。大多數(shù)菌株的菌懸液清除能力高于無細(xì)胞提取液的能力，原因可能是菌體可以持續(xù)分泌胞外多糖，多糖具有一定的供氫能力，通過氫原子或電子轉(zhuǎn)移的方式與DPPH自由基發(fā)生中和，以達(dá)到清除的目的[17]。

表2 乳酸菌的超氧陰離子和DPPH自由基清除能力Table 2 The superoxide anion and DPPH radical scavenging ability of lactic acid bacteria

2.1.3 耐受過氧化氫能力的測定結(jié)果

耐受過氧化氫能力是衡量乳酸菌抗氧化能力的指標(biāo)之一，過氧化氫與超氧陰離子對細(xì)胞有較強(qiáng)的毒害，有加速細(xì)胞的衰老過程甚至殺死細(xì)胞的作用[18]，因此乳酸菌應(yīng)具備一定的過氧化氫耐受能力。選擇2.1.2中還原能力、羥自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基清除能力都較強(qiáng)的菌株MRS2、MRS5、MRS12、SL1、LBS8、LBS9、M2、MC2、MC6、E5進(jìn)行過氧化氫耐受能力分析，見表3。

表3 乳酸菌耐受不同濃度過氧化氫能力Table 3 The resistant ability of lactic acid bacteria to different concentration of hydrogen peroxide

由表3可知，在不同H2O2濃度中培養(yǎng)24 h后，隨著H2O2濃度的增加，菌體濃度均呈下降趨勢，10株菌株中，MRS12、LBS9、M2在1 mmol/L H2O2的環(huán)境中生長受到較大影響；其余7株菌在0～1 mmol/L H2O2的環(huán)境中生長良好。原因可能是這8株菌分泌有機(jī)酸、細(xì)菌素或過氧化氫等抗氧化性物質(zhì)能力較強(qiáng)，使得乳酸菌對過氧化氫的耐受性較強(qiáng)[19]。

2.2 乳酸菌通過胃腸通道存活能力的檢測

2.2.1 菌株耐受pH 2、pH 3的能力

人的胃液pH通常為3左右，若在pH 3的條件下培養(yǎng)2 h后活菌數(shù)依舊高于6 log CFU/mL，菌株即可正常發(fā)揮其功能作用。

由表4可知，選擇耐受過氧化氫能力較強(qiáng)的7株菌在pH 3條件下處理180 min后，菌數(shù)均高于6.5 log CFU/mL，說明菌株在pH 3的條件下存活良好。在pH 2的條件下，僅有菌株MC2和MRS2的生長受到了嚴(yán)重的影響，在培養(yǎng)到60 min時，其活菌數(shù)分別為2.78 log CFU/mL和2.54 log CFU/mL。菌株LBS8、MC6、MRS5、SL1的活菌數(shù)均大于6 log CFU/mL，說明這4株菌能耐受pH 2的生長環(huán)境。

表4 不同pH對乳酸菌生長的影響Table 4 The effect of pH values on the growth of lactic acid bacteria log CFU/mL

2.2.2 菌株的膽鹽耐受力

乳酸菌對膽鹽的耐受力越高，說明其在腸道中的存活能力越強(qiáng)。各組乳酸菌對不同濃度膽鹽耐受能力的變化見表5。

表5 不同膽鹽濃度下乳酸菌的耐受能力變化Table 5 The resistant ability of lactic acid bacteria under different concentration of bile salt

由表5可知，隨著膽鹽濃度的增加，乳酸菌的生長受到一定的抑制。在膽鹽濃度為0.1%的條件下，乳酸菌的膽鹽耐受力均大于58%；在0.3%膽鹽濃度下，菌株LBS8、MC6、MRS5和SL1的膽鹽耐受力高于50%；在0.5%膽鹽濃度下，大部分菌株的生長均受到了抑制，而菌株LBS8、MC6、MRS5和SL1仍能存活，可見其膽鹽耐受能力較強(qiáng)。

2.2.3 乳酸菌對人工胃液和腸液的耐受能力分析

人體胃蛋白酶在酸性環(huán)境中被激活，殺死進(jìn)入胃中的細(xì)菌，因此乳酸菌能通過胃腸道是發(fā)揮其功能特性的前提條件[20]。

由表6可知，在人工胃液中處理3 h后，各株乳酸菌的菌數(shù)均呈下降趨勢。其中菌株MC2的生長受到明顯的抑制，存活率低于40%。其余6株菌在pH 3的人工胃液環(huán)境中均有一定的耐受能力，其中菌株MRS2和MC6對胃液的耐受能力較強(qiáng)，大于90%。經(jīng)過人工腸液處理4 h，除菌株MC2、MRS2以外，其他菌株存的活率較好，SL1、LBS8和E5能達(dá)到60%以上。

表6 乳酸菌在人工胃液和腸液中活菌數(shù)測定結(jié)果Table 6 The determination results of viable lactic acid bacteria number in artificial gastric fluid and intestinal fluid

2.3 16S rRNA分子生物學(xué)鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

綜合比較2.2中7株菌的功能特性，選擇各功能特性都較強(qiáng)的4株菌LBS8、MRS5、MC6、SL1進(jìn)行了分子生物學(xué)鑒定，結(jié)果見圖1。

圖1 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 The phylogenetic tree constructed based on 16S rRNA gene sequence

由圖1可知，菌株LBS8與Lactobacillusplantarumstrain KM4(MN493118.1)聚類在一起，同源性為100%，菌株MRS5與Lactobacillusplantarumstrain GV418(MN686265.1)聚類在一起，同源性為99%，因此這兩株菌鑒定為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)，MC6與Lactobacillusparaplantarumstrain LABD15(MK758083.1)的同源性為98%，因此被鑒定為副植物乳桿菌(Lactobacillusparaplantarum)，SL1 與Lactobacillusparacaseistrain 1601(MN795083.1)的同源性為100%，被鑒定為副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)。

3 結(jié)論

以川西彝族酸菜樣品中分離得到的40株疑似乳酸菌為出發(fā)菌株，分別對其無細(xì)胞提取物與菌懸液的還原力、羥自由基清除能力、超氧陰離子自由基清除能力、DPPH自由基清除能力及H2O2耐受能力進(jìn)行檢測，篩選得到7株抗氧化能力較強(qiáng)的菌株。其中，菌株LBS8、MC6、MRS5、SL1分別在pH 2、pH 3和0.3%、0.5%膽鹽環(huán)境中培養(yǎng)24 h后仍能存活，且經(jīng)人工胃液和腸液處理后，存活率均大于50%，各功能特性都較好。經(jīng)16S rRNA基因同源性分析，確定菌株LBS8、MRS5為植物乳桿菌，菌株MC6為副植物乳桿菌，菌株SL1為副干酪乳桿菌。本研究所篩選的益生性乳酸菌菌株為其應(yīng)用于彝族酸菜或進(jìn)一步開發(fā)新型營養(yǎng)健康食品，所篩選的乳酸菌菌株具有一定的益生特性，并有發(fā)酵彝族酸菜或進(jìn)一步開發(fā)新型營養(yǎng)健康食品的潛質(zhì)。