姚喜喜 孫海群 李長(zhǎng)慧 張振西 陳善晶 謝久祥

(青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，西寧 810016)

牧草營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)是評(píng)價(jià)草地資源最為重要的指標(biāo)之一，牧草營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)包括牧草常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分含量和養(yǎng)分消化率，其直接決定家畜的生長(zhǎng)和發(fā)育，也間接影響畜產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量[1]。干物質(zhì)(dry matter，DM)、粗脂肪(ether extract，EE)、粗蛋白質(zhì)(crude protein，CP)、酸性洗滌纖維(acid detergent fiber，ADF)、中性洗滌纖維(neutral detergent fiber，NDF)、體外干物質(zhì)消化率(in vitro dry matter digestibility，IVDMD)和估算代謝能(estimated metabolizable energy，EME)是評(píng)價(jià)天然牧草營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的重要指標(biāo)。牧草的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)與牧草種類、生育期、成熟期、施肥、氣候條件等有著密切關(guān)系[2-3]。研究表明，不同種類牧草營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)差異較大[4]，同類牧草營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)也會(huì)隨其生育期的推移而顯著下降[3,5]。牧草營(yíng)養(yǎng)價(jià)值廣泛，但變異較大。因此，如何高效、快速、準(zhǔn)確地對(duì)天然牧草營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)進(jìn)行無損檢測(cè)，對(duì)如營(yíng)養(yǎng)成分含量和養(yǎng)分消化率這些參數(shù)的簡(jiǎn)單和準(zhǔn)確預(yù)測(cè)，是評(píng)估天然牧草營(yíng)養(yǎng)供給和家畜能氮均衡需要的基礎(chǔ)，也是合理開發(fā)利用和有效保護(hù)草地資源的重要依據(jù)[6]。

動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)家長(zhǎng)期以來一直認(rèn)識(shí)到測(cè)定牧草中營(yíng)養(yǎng)成分含量的重要性。已經(jīng)建立了用于量化諸如蛋白質(zhì)、能量或礦物質(zhì)含量之類的飼料質(zhì)量參數(shù)的各種傳統(tǒng)的分析化學(xué)技術(shù)，并預(yù)測(cè)其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[7-9]。然而，傳統(tǒng)的天然牧草營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)檢測(cè)方法耗時(shí)、費(fèi)力、成本昂貴，而且在某些情況下涉及到危險(xiǎn)化學(xué)藥品，檢測(cè)方式難以與實(shí)際生產(chǎn)同步。因此，快速、及時(shí)、準(zhǔn)確、廉價(jià)測(cè)定天然牧草營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，是解決當(dāng)前草原生態(tài)保護(hù)和草地畜牧業(yè)生產(chǎn)的關(guān)鍵問題。

本試驗(yàn)從研究樣地廣泛收集不同天然牧草樣品共計(jì)1 280份，測(cè)定其DM、CP、EE、ADF、NDF含量及IVDMD和ME這7項(xiàng)營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)，并評(píng)價(jià)各個(gè)指標(biāo)的變異程度；建立天然牧草中營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的近紅外光譜(NIRS)預(yù)測(cè)模型，并通過比較其定標(biāo)集和驗(yàn)證集樣品對(duì)營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的預(yù)測(cè)效果評(píng)價(jià)，初步建立祁連山高寒牧區(qū)高寒草甸天然牧草DM、CP、EE、ADF、NDF含量及IVDMD和ME定量分析模型，以期為祁連山高寒牧區(qū)天然牧草營(yíng)養(yǎng)價(jià)值數(shù)據(jù)庫(kù)的建立提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品收集與制備

本試驗(yàn)于2015—2018年，每年6—9月份，從研究樣地收集不同放牧強(qiáng)度(0、3.6、5.3、7.6只/hm2)的混合和4個(gè)優(yōu)勢(shì)種(莎草科矮生嵩草、蓼科珠芽蓼、薔薇科金露梅和豆科錦雞兒)牧草樣品共計(jì)1 280份。對(duì)所收集的1 280份牧草樣品分別采用四分法進(jìn)行取樣，將取樣后大約250 g樣品使用立體式粉碎機(jī)(CS200A，河北辰盛農(nóng)業(yè)科技有限公司)粉碎后過40目網(wǎng)篩。制備好的樣品分成3份，1份用于實(shí)驗(yàn)室濕化學(xué)分析，1份用于NIRS收集和掃描，1份作為預(yù)留樣品。

1.2 營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)測(cè)定及方法

牧草DM含量測(cè)定以風(fēng)干牧草樣品為基礎(chǔ)[10]，EE含量采用烘干法和傳統(tǒng)索氏抽提法測(cè)定[10]，CP含量采用全自動(dòng)凱氏定氮儀(Foss Kheltec 8400)測(cè)定[11]；ADF和NDF含量使用全自動(dòng)纖維分析儀(ANKOM 2000 Fiber Analyzer)，采用Van Soest纖維分析法測(cè)定[12]；IVDMD的測(cè)定采用體外發(fā)酵裝置(DaisyPIIPIncubator)，應(yīng)用Tilley等[13]的體外兩步消化法測(cè)定；EME采用模型計(jì)算[14]，公式為：

EME=0.17×IVDMD-2.0。

1.3 儀器參數(shù)及光譜采集

使用可見近紅外快速成分光譜分析儀(XDS-RCA，美國(guó)FOSS公司)進(jìn)行NIRS采集，該儀器采用硅檢測(cè)器(400～1 100 nm)和硫化鉛檢測(cè)器(1 100～2 500 nm)雙檢測(cè)器系統(tǒng)；光譜分辨率為2 nm；儀器同時(shí)配備固定式和移動(dòng)式樣品掃描杯；樣品裝載于移動(dòng)式樣品杯中，掃描光譜范圍為400～2 500 nm，波長(zhǎng)間隔為2 nm；波長(zhǎng)準(zhǔn)確度小于0.05 nm；數(shù)據(jù)采集頻率為2次/s，取平均值，并轉(zhuǎn)化為log1/R數(shù)據(jù)形式記錄數(shù)據(jù)。所有牧草營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)測(cè)定指標(biāo)均以DM基礎(chǔ)表示。每份樣品平行測(cè)定3次，取其均值作為建模的參比值，采用Kovalenko等[15]提出的牧草樣品實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)誤差(stardard error of laboratory，SEL)進(jìn)行樣品誤差檢測(cè)，計(jì)算公式為：

相對(duì)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)誤差(relative standard error of laboratory，RESL)根據(jù)以下公式計(jì)算：

RESL(%)=100×SEL/總體平均值。

1.4 模型的建立與驗(yàn)證

NIRS技術(shù)流程主要分為校正模型的建立和未知樣品的預(yù)測(cè)，如圖1所示[16]。樣品按照3∶1的比例，隨機(jī)從1 280份牧草樣品中選擇854份作為定標(biāo)樣品集(n=854)，用來建立定標(biāo)模型；剩余的426份作為預(yù)測(cè)樣品集(n=426)，對(duì)定標(biāo)模型的預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行外部驗(yàn)證。在所建立的定標(biāo)模型中，CP、DM、IVDMD、EME、ADF和NDF在400～2 499 nm波長(zhǎng)定標(biāo)效果最佳，最佳定標(biāo)方式分別為改進(jìn)偏最小二乘法+矢量歸一化+去散射處理+二階導(dǎo)數(shù)處理、改進(jìn)偏最小二乘法+矢量歸一化+去散射處理+一階導(dǎo)數(shù)處理、改進(jìn)偏最小二乘法+矢量歸一化+去散射處理+二階導(dǎo)數(shù)處理、改進(jìn)偏最小二乘法+矢量歸一化+去散射處理+二階導(dǎo)數(shù)處理、改進(jìn)偏最小二乘法+矢量歸一化處理+一階導(dǎo)數(shù)處理和改進(jìn)偏最小二乘法+矢量歸一化+去散射處理+二階導(dǎo)數(shù)處理，光譜間隔點(diǎn)均為4，一次平滑處理光譜間隔點(diǎn)均為4，二次平滑處理光譜間隔點(diǎn)均為1。利用WinISI Ⅲ定標(biāo)分析軟件，對(duì)定標(biāo)集樣品進(jìn)行聚類分析和運(yùn)算，選擇具有代表性樣品，剔除異常樣品，輸入牧草營(yíng)養(yǎng)成分和消化率等數(shù)據(jù)后利用WinISI Ⅲ軟件建立定標(biāo)模型。

圖1 NIRS技術(shù)分析流程

表1 校準(zhǔn)性能標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié) 果

2.1 牧草樣品光譜掃描結(jié)果

1 280份牧草樣品原始NIRS掃描光譜曲線圖如圖2-a所示。牧草樣品原始光譜在可見光和NIRS區(qū)域均有吸收，表現(xiàn)出了明顯的吸收峰，不同樣品由于散射所表現(xiàn)出的掃描吸收曲線表現(xiàn)出各樣品之間的平行移動(dòng)特點(diǎn)，各吸收曲線變化一致且能互相區(qū)分，吸收峰較寬、基線垂直漂移，表明可以用于進(jìn)一步分析和建模。原始樣品NIRS通過二階導(dǎo)數(shù)處理后(以2,4,4,1為例)，樣品的光譜差異更加明顯，吸收峰也得到明顯的增強(qiáng)，同時(shí)，基線垂直漂移狀況得到了有效的校正(圖2-b)。二階導(dǎo)數(shù)+去散射法處理后(以標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量校正結(jié)合去除趨勢(shì)校正為例)，消除了原始樣品NIRS受去散射現(xiàn)象的影響，各牧草樣品NIRS平移現(xiàn)象得以改善(圖2-c)。

a：全集樣品圖譜 spectra of all samples；b：二階導(dǎo)數(shù)(2,4,4,1) second derivative (2,4,4,1)；c：二階導(dǎo)數(shù)+標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量校正結(jié)合去除趨勢(shì)校正(SNVD) second derivative+stamdard normal variate plus derend correction (SNVD)。

2.2 全集、定標(biāo)集和驗(yàn)證集樣品營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)測(cè)定

牧草中全集、定標(biāo)集和驗(yàn)證集的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分含量、IVDMD和EME見表2，所有營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)指標(biāo)均以DM為基礎(chǔ)。全集牧草樣品的DM、CP、EE、ADF、NDF含量及IVDMD和EME分別為80.38%～98.91%、3.13%～25.10%、0.91%～7.70%、19.98%～58.71%、36.95%～79.38%、38.77%～75.21%和4.88～11.07 MJ/kg，平均值分別為94.33%、11.38%、2.88%、38.15%、62.52%、56.96%和7.97 MJ/kg。定標(biāo)集牧草樣品的DM、CP、EE、ADF、NDF含量及IVDMD和EME分別為91.20%～96.78%、3.13%～21.54%、1.18%～7.47%、27.61%～55.64%、38.47%～75.47%、40.90%～68.84%和5.24～9.99 MJ/kg，平均值分別為94.12%、10.81%、2.71%、38.33%、62.88%、56.57%和7.91 MJ/kg。驗(yàn)證集牧草樣品的DM、CP、EE、ADF、NDF含量及IVDMD和EME分別為80.38%～98.91%、4.31%～25.10%、0.91%～7.70%、19.98%～58.71%、36.95%～79.38%、38.77%～75.21%和4.88～911.07 MJ/kg，平均值分別為94.43%、11.64%、2.95%、38.07%、62.35%、57.14%和8.00 MJ/kg。所測(cè)全集、定標(biāo)集和驗(yàn)證集牧草營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)分別為0.97%～9.35%、10.11%～27.03%、0.91%～7.76%和10.12%～30.81%、0.03%～0.94%和10.02%～33.38%。

表2 牧草中常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分含量、IVDMD和估算代謝能(干物質(zhì)基礎(chǔ))

2.3 定標(biāo)集樣品的最佳定標(biāo)方式及模型參數(shù)

通過對(duì)854個(gè)定標(biāo)集牧草樣品NIRS進(jìn)行預(yù)處理，確定了牧草中常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分含量、IVDMD和EME的最佳定標(biāo)方式，定標(biāo)結(jié)果如表3所示。在所建立的定標(biāo)模型中，CP、DM、IVDMD、EME、ADF和NDF的定標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)偏差(SEC)分為0.001 1、0.902 2、0.378 9、4.454 8、0.171 7和0.344 5，內(nèi)部交互驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)偏差(SECV)分別為0.008 7、0.007 1、0.020 4、0.336 2、0.024 2和0.035 8，而內(nèi)部交互驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)(1-VR)分別為0.967 2、0.947 1、0.929 5、0.925 1、0.915 9和0.909 5。

表3 牧草營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的最佳定標(biāo)方式及定標(biāo)結(jié)果

2.4 驗(yàn)證集樣品定標(biāo)模型的外部驗(yàn)證結(jié)果

表4 牧草營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)定標(biāo)模型的外部驗(yàn)證結(jié)果

3 討 論

自1976年最早開展了對(duì)牧草8種營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行NIRS預(yù)測(cè)飼料營(yíng)養(yǎng)成分潛力的研究以來，NIRS技術(shù)在預(yù)測(cè)牧草營(yíng)養(yǎng)成分的研究和應(yīng)用已走過了40余年的時(shí)間[19-26]。迄今為止，NIRS技術(shù)用于檢測(cè)牧草營(yíng)養(yǎng)成分的相關(guān)研究資料已有很多，主要檢測(cè)成分包括DM、CP、EE、粗灰分(Ash)、ADF、NDF、鈣(Ca)、磷(P)含量及IVDMD等，相應(yīng)地在建立了一些適用于部分地區(qū)特定牧草的NIRS預(yù)測(cè)模型[8,20,27-30]。但由于牧草營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)受牧草種類組成、生長(zhǎng)年際降雨量、生長(zhǎng)季節(jié)、土壤肥力等多種因素的綜合影響，現(xiàn)已有的模型并沒有完全考慮上述因子的影響，開發(fā)的模型實(shí)用性和完整性非常欠缺，不能較好的適應(yīng)特定區(qū)域草地牧草生產(chǎn)和家畜放牧營(yíng)養(yǎng)均衡管理[31-32]。為保證NIRS技術(shù)對(duì)特定牧區(qū)牧草營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的準(zhǔn)確預(yù)測(cè)，實(shí)現(xiàn)放牧家畜的精準(zhǔn)管理和補(bǔ)飼，對(duì)于評(píng)價(jià)草畜營(yíng)養(yǎng)均衡需要、更好地利用和保護(hù)天然草地資源、實(shí)現(xiàn)草原永續(xù)發(fā)展來說，建立針對(duì)牧草種類、年際降雨、生長(zhǎng)季節(jié)不同和不同載畜量的NIRS快速檢測(cè)模型非常必要。

本研究對(duì)祁連山高寒牧區(qū)高寒草甸2015—2018年，每個(gè)放牧年份6—9份，從研究樣地收集的不同放牧強(qiáng)度(0、3.6、5.3、7.6只/hm2)的混合和4個(gè)優(yōu)勢(shì)種(莎草科矮生嵩草、蓼科珠芽蓼、薔薇科金露梅和豆科錦雞兒)牧草樣品共計(jì)1 280份，進(jìn)行了DM、CP、EE、ADF、NDF含量及IVDMD和EME營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)測(cè)定，并試圖建立NIRS預(yù)測(cè)模型，通過對(duì)初步建立的天然牧草營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)NIRS預(yù)測(cè)模型進(jìn)行定標(biāo)和校驗(yàn)，結(jié)果表明了所建立的定標(biāo)模型對(duì)DM、CP、ADF、NDF含量及IVDMD、EME營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)指標(biāo)的驗(yàn)證結(jié)果最佳，其中，模型對(duì)于DM、CP含量及IVDMD、EME的RPD均在4以上；對(duì)于ADF、NDF含量的RPD在3～4；對(duì)于EE的外部驗(yàn)證預(yù)測(cè)效果較不理想，RPD為2.3，說明所建立的定標(biāo)模型對(duì)EE指標(biāo)的粗略定量分析是可行的，但精度有待提高。本研究建立的模型預(yù)測(cè)與李潔等[33]利用新疆伊犁昭蘇草原5—10月份的5種單一品種牧草及混合牧草建立的牧草營(yíng)養(yǎng)成分相關(guān)預(yù)測(cè)模型進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，本研究所建立的NIRS預(yù)測(cè)模型在預(yù)測(cè)DM、CP、ADF、NDF含量及IVDMD和EME營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)指標(biāo)時(shí)預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性評(píng)價(jià)指標(biāo)RPD均高于李潔等[33]的建模結(jié)果，而對(duì)EE含量預(yù)測(cè)效果與李潔等[33]建模效果一樣僅能用于粗略測(cè)定；與薛祝林等[34]利用紫花苜蓿草捆樣品建立的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和消化率預(yù)測(cè)模型CP、NDF、ADF含量和IVDMD預(yù)測(cè)的RPD介于2.5～3.0相比，本研究的RPD介于3.8～5.9，模型預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性顯著提高；與聶志東等[9]建立的對(duì)紫花苜蓿青干草DM、CP、ADF、NDF含量預(yù)測(cè)模型，陳鵬飛等[35]建立的用于青貯苜蓿鮮樣DM、CP、ADF、NDF含量及IVDMD預(yù)測(cè)模型相比，預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性均有所提高；與De Boever等[7]和Shenk等[25]建立的青貯玉米DM、EE、CP、ADF、NDF含量測(cè)定預(yù)測(cè)模型和紅三葉中DM、CP、NDF、Ca、P含量預(yù)測(cè)模型相比，本研究在DM、CP和ADF含量預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性上有所提高。本研究對(duì)EE含量的預(yù)測(cè)效果較差，這一結(jié)論與李潔等[33]、薛祝林等[34]和De Boever等[7]的研究結(jié)果一致，可能的原因除實(shí)驗(yàn)室測(cè)定誤差較大和樣品間差異較小之外，也與EE在牧草樣品中的含量少和靈敏度低有關(guān)。因此，在今后的研究工作中，需要進(jìn)一步降低實(shí)驗(yàn)室測(cè)定誤差、進(jìn)一步擴(kuò)充樣本量等多種方法對(duì)定標(biāo)方程進(jìn)行逐步校正，從而實(shí)現(xiàn)NIRS預(yù)測(cè)模型對(duì)高寒草地天然牧草EE含量的準(zhǔn)確預(yù)測(cè)。

目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)NIRS技術(shù)在農(nóng)業(yè)方面的研究應(yīng)用主要體現(xiàn)在新疆昭蘇草原、人工牧草和青貯飼料營(yíng)養(yǎng)成分預(yù)測(cè)幾個(gè)方面，由于高寒草地天然牧草營(yíng)養(yǎng)成分和品質(zhì)易受氣候、海拔、牧草種類、生長(zhǎng)季節(jié)、放牧及土壤養(yǎng)分等因素的影響[36-40]，目前NIRS技術(shù)在祁連山高寒草原天然牧草營(yíng)養(yǎng)成分和品質(zhì)評(píng)價(jià)方面的應(yīng)用未有報(bào)道，尚未建立不同年份、不同季節(jié)、不同放牧強(qiáng)度和不同物種營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)定量分析模型，在祁連山高寒草地天然草原牧草營(yíng)養(yǎng)成分、消化率、代謝能預(yù)測(cè)方面的研究更是鮮見報(bào)道，因此，建立祁連山高寒草原天然牧草營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)NIRS預(yù)測(cè)模型非常必要。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)利用NIRS技術(shù)建立了祁連山高寒牧區(qū)高寒草甸天然牧草DM、CP、ADF、NDF、EE含量及IVDMD和EME的近紅外預(yù)測(cè)模型。其中，模型對(duì)于DM、CP、ADF、NDF含量及IVDMD和EME的外部RPD均大于3.82，可用于實(shí)際測(cè)定；而對(duì)于EE含量的外部RPD為2.30，模型預(yù)測(cè)效果不太成功，但適度可用。