孫美杰 徐詣軒 曹玉榮 杜風(fēng)光 申軍士* 朱偉云

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué),國家動物消化道營養(yǎng)國際聯(lián)合研究中心，江蘇省消化道營養(yǎng)與動物健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，消化道微生物研究室，南京 210095；2.易高卓新節(jié)能技術(shù)(上海)有限公司，上海 201109)

玉米秸稈是我國最豐富的農(nóng)作物副產(chǎn)品[1-2]，低廉的價(jià)格使其成為反芻動物秸稈飼料、纖維素乙醇生產(chǎn)和生物沼氣生產(chǎn)的豐富原料[3-6]。玉米秸稈主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成，彼此通過化學(xué)鍵緊密連接，這種復(fù)雜的理化結(jié)構(gòu)嚴(yán)重阻礙了玉米秸稈的利用。因此，對玉米秸稈進(jìn)行預(yù)處理是克服木質(zhì)纖維素難分解的有效策略之一，也是現(xiàn)今使用最為廣泛的措施之一。蒸汽爆破是一種有效提高秸稈營養(yǎng)價(jià)值的物理處理方法[7]，經(jīng)高溫高壓飽和蒸汽作用，秸稈中的半纖維素水解成可溶性單糖，木質(zhì)素部分破裂重新排列，暴露出纖維素。經(jīng)過蒸汽爆破處理，不僅提高了秸稈的柔軟性，而且提高了秸稈的比表面積，可促進(jìn)消化道微生物黏附和有關(guān)酶的識別結(jié)合，提高秸稈利用效率[8]。因此，蒸汽爆破被認(rèn)為是21世紀(jì)解決秸稈飼料化的潛在技術(shù)之一，其相關(guān)技術(shù)的完善、在動物體外和體內(nèi)試驗(yàn)上的應(yīng)用效果以及相關(guān)代謝機(jī)理成為今后研究的重點(diǎn)。

蒸汽爆破雖然能夠促進(jìn)秸稈纖維素、半纖維素的降解，但是卻不能解決秸稈本身蛋白質(zhì)含量低的問題，能氮的不平衡性還是不利于反芻動物對秸稈的高效利用。有研究發(fā)現(xiàn)，向飼喂蒸汽爆破玉米秸稈的綿羊飼糧中添加尿素可使瘤胃中可溶性糖含量明顯增加，并顯著增加了纖維素和半纖維素的可消化部分[9]，并且還能使蛋白質(zhì)含量提高2倍多[10]。Hai等[10]對經(jīng)過蒸汽爆破并且添加2%尿素(干物質(zhì)基礎(chǔ))的小麥秸稈進(jìn)行體外發(fā)酵試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，綿羊?qū)φ羝菩←溄斩挼母晌镔|(zhì)消失率(DMD)以及中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌木質(zhì)素(ADL)和纖維素的消化利用率顯著提高。此外，尿素水解產(chǎn)生的氨也為瘤胃微生物提供了充足的氮源[11]。有研究表明，瘤胃微生物對氮源的需求有50%～80%是以氨的形式被滿足，剩下20%～50%是以肽和氨基酸的形式被滿足[12]，并且瘤胃中絕大部分纖維降解細(xì)菌將氨作為其生長的主要氮源。但是，反芻動物對尿素氨的利用情況與尿素添加量存在直接關(guān)系。Kertz[13]報(bào)道，當(dāng)以干物質(zhì)消失率和非氨態(tài)氮(NH3-N)流量為測定指標(biāo)時(shí)，瘤胃氨的最佳濃度在17～25 mg/dL。過量的氨會打破瘤胃內(nèi)氮的平衡，增加反芻動物氨中毒的風(fēng)險(xiǎn)[14]。但在尿素誘導(dǎo)的高氨濃度條件下，瘤胃微生物對秸稈的利用是否會受影響，以及秸稈經(jīng)蒸汽爆破處理后是否可以進(jìn)一步增強(qiáng)瘤胃微生物對NH3-N的吸收和利用等問題仍有待進(jìn)一步的探究。因此，本試驗(yàn)通過靜態(tài)模擬瘤胃體外發(fā)酵法，探究尿素添加誘導(dǎo)的不同氨濃度對蒸汽爆破玉米秸稈發(fā)酵的影響，以期為促進(jìn)蒸汽爆破玉米秸稈的飼料化應(yīng)用提供更多的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

玉米秸稈：將收集的玉米秸稈樣品平均分成兩部分，其中一部分不做任何處理，作為未處理玉米秸稈；另一部分在蒸汽爆炸反應(yīng)器(河南天冠企業(yè)集團(tuán)有限公司自行研制開發(fā))中爆破，制成蒸汽爆破玉米秸稈。蒸汽爆破處理?xiàng)l件為50 L容量罐，兩段變壓汽爆，0.7 MPa、8 min與1.2 MPa、2 min，由河南天冠企業(yè)集團(tuán)有限公司制作完成。將2種玉米秸稈樣品在65 ℃下烘干粉碎，過40目篩，于4 ℃冰箱中儲存?zhèn)溆谩?/p>

添加劑：尿素，純度≥99.5%。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用2×3雙因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，即2種玉米秸稈底物[未處理玉米秸稈(C)與蒸汽爆破玉米秸稈(S)]和3個(gè)尿素添加劑量(0、20、100 mg/dL)，共6個(gè)處理(C-0、C-20、C-100分別為未處理玉米秸稈中添加0、20、100 mg/dL尿素，S-0、S-20、S-100分別為蒸汽爆破玉米秸稈中添加0、20、100 mg/dL尿素)，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)，采用湖羊作為瘤胃液供體，進(jìn)行體外發(fā)酵。

1.3 玉米秸稈的常規(guī)養(yǎng)分含量測定

參照AOAC(1995)[15]方法對飼料樣品進(jìn)行干物質(zhì)(DM)、粗灰分(Ash)和粗蛋白質(zhì)(CP)含量分析。參照Van Soest等[16]描述的方法，使用A220纖維分析儀(ANKOM Technology Corporation，美國)測定飼料樣品中NDF和酸性洗滌纖維(ADF)含量，根據(jù)NDF與ADF含量計(jì)算半纖維素和中性洗滌可溶物(NDS)含量。

1.4 瘤胃液接種與體外發(fā)酵

瘤胃液采自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物房3只健康并裝有瘤胃瘺管的公湖羊，體重(30±2) kg，采食的飼糧為全混合日糧[25%玉米青貯、20%花生藤、42%玉米、4%豆粕、4%麩皮、5%預(yù)混料(每千克預(yù)混料含有：氯化鈉150 g，碳酸氫鈉200 g，鈣75 g，磷20 g，錳600 mg，鐵680 mg，鋅960 mg，銅300 mg，維生素A 140 000 IU，維生素D355 000 IU，維生素E 700 IU，煙酸600 mg)]。每日08:00和17:00各飼喂1次，自由飲水。試驗(yàn)當(dāng)天晨飼前通過瘤胃瘺管收集瘤胃液，保存在39 ℃預(yù)熱并充滿二氧化碳(CO2)的自封袋內(nèi)，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。經(jīng)4層紗布過濾后用于接種。在獲取瘤胃液的整個(gè)過程中都要嚴(yán)格厭氧。人工緩沖液按照Theodorou等[17]的方法配制。將瘤胃液與人工緩沖液在厭氧條件下按照1∶9的體積比混合均勻，制成混合培養(yǎng)液。事先在180 mL發(fā)酵瓶中稱取1 g未處理玉米秸稈或蒸汽爆破玉米秸稈作為體外發(fā)酵底物，并按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)添加不同劑量的尿素，隨后厭氧分裝100 mL混合培養(yǎng)液于發(fā)酵瓶中，密封，置于39 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。

1.5 發(fā)酵參數(shù)測定

體外模擬瘤胃發(fā)酵過程中，參照Theodorou等[17]描述的方法測定總產(chǎn)氣量。體外發(fā)酵72 h后，迅速從各發(fā)酵瓶中取5 mL發(fā)酵液用pH計(jì)(Ecoscan pH 5,Singapore)測定pH，隨后置于冰水混合物中終止發(fā)酵。收集發(fā)酵液，分裝后于-20 ℃冰箱保存。參照Weatherburn[18]的方法測定NH3-N濃度，參考申軍士等[19]的氣相色譜法測定揮發(fā)性脂肪酸(VFA)濃度；參照Liu等[20]的尼龍袋法，將發(fā)酵后的底物全部轉(zhuǎn)移至已稱好的尼龍濾袋中，烘干稱重，計(jì)算DMD。采用Gompertz模型分析產(chǎn)氣動態(tài)參數(shù)變化[21-22]。應(yīng)用非線性軟件(R)對體外發(fā)酵產(chǎn)氣參數(shù)進(jìn)行擬合，統(tǒng)計(jì)方程如下：

式中：G為t時(shí)刻累積產(chǎn)氣量(mL)；A為理論最大產(chǎn)氣量(mL)；exp表示帶截距的簡單指數(shù)增長；k為產(chǎn)氣速率常數(shù)(mL/h)；L為體外發(fā)酵產(chǎn)氣延滯時(shí)間(h)；t為發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)。

1.6 功能微生物數(shù)量分析

瘤胃液樣品解凍后，9 000 r/min離心10 min，利用珠磨法提取瘤胃微生物總DNA[23-24]，并使用Nanodrop 2000分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific Inc., Madison, Wisconsin,美國)對提取的發(fā)酵液微生物總DNA在260和280 nm下測定吸光度(OD)，OD260/280 nm在1.8～2.0表示純度較好，可用于下一步分析。參考申軍士等[19]的方法構(gòu)建20 μL反應(yīng)體系，使用PCR儀(ABI 7500，英國)對瘤胃液中的總菌、甲烷菌、真菌和原蟲進(jìn)行定量分析。分別以總菌的16S rRNA基因、真菌和原蟲的18S rRNA基因、甲烷菌的甲基輔酶M還原酶(mcrA)基因作為模板制作各目標(biāo)微生物定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)時(shí)定量PCR(real-time qPCR)引物序列見表1。

表1 瘤胃目標(biāo)微生物實(shí)時(shí)定量PCR引物序列

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2007初步整理后，利用SAS 9.4混合模型(mixed model)對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行雙因素方差分析，模型包括玉米秸稈類型效應(yīng)、尿素添加劑量效應(yīng)及玉米秸稈類型與尿素添加劑量的交互作用。如果交互作用顯著，則不考慮自變量效應(yīng)，僅對不同玉米秸稈類型條件下不同尿素添加劑量進(jìn)行差異分析。因?yàn)槟蛩靥砑觿┝坎坏乳g距，首先使用SAS IML(交互式矩陣語言)程序?qū)Χ囗?xiàng)式對比系數(shù)進(jìn)行校正，然后采用正交多項(xiàng)式矩陣(orthogonal polynomial contracts)對尿素不同添加劑量進(jìn)行一次(linear)和二次(quadratic)效應(yīng)分析。顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 常規(guī)養(yǎng)分含量

表2顯示了未處理玉米秸稈與蒸汽爆破玉米秸稈樣品的常規(guī)養(yǎng)分含量。由表可知，蒸汽爆破處理使玉米秸稈的NDF和半纖維素含量分別從72.13%和31.54%下降到52.88%和7.98%，NDS和ADF含量分別從27.87%和40.59%上升到47.12%和44.90%，而DM、CP和Ash含量基本沒有發(fā)生變化。

表2 玉米秸稈常規(guī)養(yǎng)分含量

2.2 總產(chǎn)氣量、DMD和產(chǎn)氣動力學(xué)參數(shù)

玉米秸稈體外瘤胃發(fā)酵總產(chǎn)氣量和DMD數(shù)據(jù)見圖1，產(chǎn)氣動力學(xué)參數(shù)見表3。玉米秸稈類型和尿素添加劑量對總產(chǎn)氣量和產(chǎn)氣動力學(xué)參數(shù)[產(chǎn)氣速率常數(shù)(k)、理論最大產(chǎn)氣量(V)、產(chǎn)氣延滯時(shí)間(L)]不存在顯著的交互作用(P>0.05)；蒸汽爆破處理使總產(chǎn)氣量和理論最大產(chǎn)氣量顯著升高(P<0.01)，產(chǎn)氣速率常數(shù)和體外發(fā)酵產(chǎn)氣延滯時(shí)間顯著降低(P<0.01)，同時(shí)在不同尿素添加劑量中也表現(xiàn)出差異。總產(chǎn)氣量隨尿素添加劑量的增加線性降低(P<0.01)。尿素添加劑量與產(chǎn)氣動力學(xué)參數(shù)(產(chǎn)氣速率常數(shù)、理論最大產(chǎn)氣量、產(chǎn)氣延滯時(shí)間)存在二次劑量效應(yīng)(P<0.01)。玉米秸稈類型和尿素添加劑量對DMD存在顯著的交互作用(P<0.01)，蒸汽爆破玉米秸稈各組的DMD均顯著高于未處理玉米秸稈各組(P<0.05)，其中以蒸汽爆破玉米秸稈S-20組最高，未處理玉米秸稈C-20組最低。

試驗(yàn)結(jié)果均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，每組重復(fù)數(shù)為5。數(shù)據(jù)柱形標(biāo)注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。S表示玉米秸稈效應(yīng)，D表示尿素添加劑量效應(yīng)，S×D表示玉米秸稈類型與尿素添加劑量的交互作用，Lin表示線性劑量效應(yīng)，Qua表示二次劑量效應(yīng)。

表3 不同尿素添加劑量對蒸汽爆破玉米秸稈瘤胃體外發(fā)酵產(chǎn)氣動力學(xué)參數(shù)的影響

2.3 體外瘤胃發(fā)酵參數(shù)

2.3.1 發(fā)酵液pH和NH3-N濃度

由表4可知，玉米秸稈類型和尿素添加劑量對pH(P<0.01)和NH3-N濃度(P=0.02)存在顯著的交互作用。蒸汽爆破玉米秸稈S-100組和未處理玉米秸稈C-100組的pH要顯著高于C-0、C-20、S-0和S-20組(P<0.05)，而C-0、C-20和S-20組彼此之間的pH差異不顯著(P>0.05)。隨著尿素添加劑量的升高，蒸汽爆破玉米秸稈和未處理玉米秸稈的NH3-N濃度均顯著升高(P<0.05)，且3個(gè)蒸汽爆破玉米秸稈組的NH3-N濃度分別顯著低于對應(yīng)尿素添加劑量的3個(gè)未處理玉米秸稈組(P<0.05)。

2.3.2 發(fā)酵液VFA濃度

由表4可知，對于總VFA、乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸和戊酸濃度和乙丙比來說，玉米秸稈類型和尿素添加劑量之間不存在顯著的交互作用(P>0.05)。蒸汽爆破玉米秸稈的總VFA和乙酸濃度顯著高于未處理玉米秸稈(P<0.05)，丁酸和異丁酸濃度顯著低于未處理秸稈(P<0.05)；隨著尿素添加劑量的增加，戊酸濃度存在線性(P=0.02)和二次(P=0.03)劑量效應(yīng)，總VFA(P<0.05)和乙酸濃度(P=0.04)存在二次劑量效應(yīng)，以尿素添加劑量為20 mg/dL時(shí)總VFA和乙酸濃度最高。玉米秸稈類型和尿素添加劑量對丙酸濃度和乙丙比均無顯著影響(P>0.05)。玉米秸稈類型和尿素添加劑量對異戊酸濃度存在顯著的交互作用(P=0.03)。當(dāng)?shù)孜锝斩挒檎羝朴衩捉斩挄r(shí)，尿素添加劑量對異戊酸濃度的影響不顯著(P>0.05)；而當(dāng)?shù)孜锝斩挒槲刺幚碛衩捉斩挄r(shí)，C-20組的異戊酸濃度顯著高于C-0和C-100組(P<0.05)。

表4 不同尿素添加劑量對蒸汽爆破玉米秸稈體外瘤胃發(fā)酵液中pH、NH3-N和VFA濃度的影響

續(xù)表4項(xiàng)目 Items未處理玉米秸稈 Untreated corn stoverC-0C-20C-100蒸汽爆破玉米秸稈Steam-exploded corn stoverS-0S-20S-100SEMP值 P-valueS尿素 UreaDLinQuaS×D丙酸 Propionate/(mmol/L)14.615.113.714.514.915.70.5180.220.660.980.370.06乙丙比 Acetate/propionate4.184.154.534.644.744.230.2420.220.950.830.830.16丁酸 Butyrate/(mmol/L)6.616.796.536.166.046.030.158<0.010.670.420.710.60異丁酸 Isobutyrate/(mmol/L)0.620.610.590.610.540.550.015<0.010.030.060.060.26戊酸 Valerate/(mmol/L)0.390.450.470.400.430.420.0150.13<0.010.020.030.12異戊酸 Isovalerate/(mmol/L)0.56b0.65a0.56b0.50bc0.49bc0.45c0.019<0.01<0.010.040.010.03

2.4 發(fā)酵液功能微生物數(shù)量

由表5可知，玉米秸稈類型與尿素添加劑量對于總菌(P<0.01)、甲烷菌(P=0.04)和原蟲數(shù)量(P<0.01)存在顯著交互作用，其中均以蒸汽爆破玉米秸稈S-0組最高，未處理玉米秸稈C-100組最低。而對于真菌數(shù)量來說，玉米秸稈類型與尿素添加劑量之間不存在顯著的交互作用(P>0.05)，蒸汽爆破玉米秸稈組的真菌數(shù)量顯著高于未處理玉米秸稈組(P<0.01)，尿素添加劑量也顯著影響真菌數(shù)量(P<0.01)。隨著尿素添加劑量的增加，真菌數(shù)量存在線性(P<0.01)和二次(P=0.04)劑量效應(yīng)，以尿素添加劑量為20 mg/dL時(shí)的真菌數(shù)量最高。

表5 不同尿素添加劑量對蒸汽爆破玉米秸稈體外瘤胃發(fā)酵液中功能微生物數(shù)量的影響

3 討 論

3.1 蒸汽爆破處理對玉米秸稈常規(guī)養(yǎng)分含量的影響

玉米秸稈的纖維素和半纖維素含量高，通過對常規(guī)養(yǎng)分含量進(jìn)行測定，可以評估半纖維素和纖維素在蒸汽爆破過程中的降解情況。本研究發(fā)現(xiàn)，蒸汽爆破使玉米秸稈中的NDF和半纖維素含量降低，而ADF和NDS含量升高。半纖維素在高溫高壓處理下易降解為可溶性單糖或低聚糖，此外，乙酰纖維素產(chǎn)生的乙酸會進(jìn)一步加速纖維素和半纖維素的降解[28-31]。本研究中，蒸汽爆破玉米秸稈中半纖維素含量較未處理玉米秸稈明顯降低，降低了23.56%，表明蒸汽爆破使玉米秸稈中半纖維素的降解或去除程度增強(qiáng)，此結(jié)果與Shi等[32]、Chang等[33]和Zhao等[34]的研究結(jié)果相同。本試驗(yàn)中蒸汽爆破玉米秸稈中NDS含量的增加可能是由于蒸汽爆破使半纖維素分解所致，這進(jìn)一步證明了玉米秸稈在蒸汽爆破處理后的易降解性。Shi等[32]和Zhao等[34]研究發(fā)現(xiàn)，玉米秸稈經(jīng)蒸汽爆破處理后木質(zhì)素含量顯著增加。因此推測本研究中蒸汽爆破玉米秸稈中ADF含量的增加可能是木質(zhì)素含量增加所致，但木質(zhì)素含量增加的具體原因仍不清楚，相關(guān)研究者也未給出合理解釋，后續(xù)還需更深入的試驗(yàn)加以探究。

3.2 蒸汽爆破玉米秸稈中添加不同劑量尿素對體外瘤胃發(fā)酵總產(chǎn)氣量和DMD的影響

瘤胃體外發(fā)酵產(chǎn)氣量是評定反芻動物瘤胃發(fā)酵程度的一個(gè)重要指標(biāo)，與DMD存在一定的正相關(guān)關(guān)系，并且體外發(fā)酵產(chǎn)氣量的高低也能反映瘤胃內(nèi)微生物活性的強(qiáng)弱[35]。本研究發(fā)現(xiàn)，蒸汽爆破玉米秸稈組的總產(chǎn)氣量和DMD較未處理玉米秸稈組顯著提高，與李德勇等[36]、Zhao等[34]和He等[4]所報(bào)道的結(jié)果相一致，說明蒸汽爆破可以提高瘤胃微生物的活性和消化速率，對玉米秸稈的降解有一定的促進(jìn)作用。有研究指出，瘤胃液中適宜的NH3-N濃度在17～25 mg/dL，過低和過高都會對瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生不利影響[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，不同尿素添加劑量對DMD沒有產(chǎn)生顯著影響，但是添加尿素使總產(chǎn)氣量顯著降低，并呈現(xiàn)出顯著的線性劑量效應(yīng)。20 mg/dL劑量組的總產(chǎn)氣量下降不明顯，說明適宜氨濃度不會影響產(chǎn)氣量，但100 mg/dL劑量組的產(chǎn)氣量下降明顯，其原因可能與發(fā)酵液pH的升高有關(guān)。人工緩沖液中含有大量碳酸氫根離子，在低pH條件下會還原產(chǎn)生CO2，而在本試驗(yàn)條件下添加高劑量尿素使得發(fā)酵液pH顯著升高，進(jìn)而導(dǎo)致產(chǎn)氣量減少。

3.3 不同尿素添加劑量對蒸汽爆破玉米秸稈體外瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

瘤胃液內(nèi)NH3-N濃度的高低直接反映了瘤胃內(nèi)微生物對氮的利用情況[14]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，蒸汽爆破玉米秸稈相較于未處理玉米秸稈，其發(fā)酵液NH3-N濃度顯著降低，這與Zhao等[34]和李德勇等[36]的研究結(jié)果一致，表明蒸汽爆破處理玉米秸稈提高了瘤胃微生物對氨的利用效率。在本試驗(yàn)中，隨著尿素添加劑量的增加，發(fā)酵液pH和NH3-N濃度顯著升高，這是因?yàn)槟蛩卦谶M(jìn)入瘤胃后會被完全降解為氨，氨水解呈堿性，所以隨著尿素添加劑量的增加pH顯著升高。Prasad等[37]在水稻秸稈中添加尿素后發(fā)現(xiàn)奶牛的瘤胃液pH升高，與本試驗(yàn)結(jié)果相同。這些結(jié)果表明，當(dāng)尿素添加劑量過高時(shí)會顯著提高瘤胃液氨濃度和pH，但對玉米秸稈進(jìn)行蒸汽爆破處理可以提高瘤胃微生物對氨的利用效率，緩解高氨對瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生的不利影響。

瘤胃VFA是反芻動物重要的能量來源，可為機(jī)體提供70%～80%的可消化能[38]。本研究發(fā)現(xiàn)，玉米秸稈經(jīng)蒸汽爆破處理后，發(fā)酵液中總VFA和乙酸濃度顯著升高，總VFA濃度的升高表明微生物的生長和發(fā)酵能力提高，對能量的利用效率提高。乙酸是纖維分解菌的主要產(chǎn)物，乙酸濃度與纖維分解菌數(shù)量之間存在一定的正相關(guān)關(guān)系，蒸汽爆破處理后的纖維素可接觸面積增大，使得纖維分解菌數(shù)量增多，因此發(fā)酵液中乙酸濃度也相應(yīng)增加。發(fā)酵液中丙酸濃度和乙丙比沒有因蒸汽爆破處理發(fā)生顯著變化，說明蒸汽爆破處理并未改變瘤胃發(fā)酵模式，此結(jié)果與李德勇等[36]和He等[4]的研究結(jié)果不一致，可能是由于所選的秸稈類型不同導(dǎo)致蒸汽爆破后的物理化學(xué)性質(zhì)變化存在差異。在本試驗(yàn)中，尿素添加劑量與發(fā)酵液中總VFA、乙酸和戊酸濃度存在顯著的二次劑量效應(yīng)，均以尿素添加劑量為20 mg/dL時(shí)最高，說明在本底氨濃度基礎(chǔ)上添加此劑量尿素所分解產(chǎn)生氨的最終濃度(16.92～18.87 mg/dL)有利于瘤胃微生物的發(fā)酵和對能量的利用。

3.4 不同尿素添加劑量對蒸汽爆破玉米秸稈體外瘤胃發(fā)酵液中功能微生物數(shù)量的影響

反芻動物自身不能分泌纖維素降解酶，所以飼糧中的纖維素主要依靠瘤胃內(nèi)存在的微生物來分解，這些微生物主要包括細(xì)菌、古菌、真菌和原生動物[39]，因此它們的存在與反芻動物能量利用密切相關(guān)。有研究報(bào)道，經(jīng)過蒸汽爆炸處理的玉米秸稈，其孔隙率和微生物可定植面積都有所增加[40]。本研究發(fā)現(xiàn)，蒸汽爆破玉米秸稈發(fā)酵液中總菌、甲烷菌、真菌和原蟲數(shù)量要顯著高于未處理玉米秸稈，表明蒸汽爆破通過破壞底物的結(jié)構(gòu)，促進(jìn)了微生物的生長定植，此結(jié)果與總產(chǎn)氣量的增加和DMD的提高相一致。Zhao等[34]用掃描電鏡觀察玉米秸稈的物理結(jié)構(gòu)變化發(fā)現(xiàn)，蒸汽爆破處理顯著增加了玉米秸稈在瘤胃中的微生物定植，在培養(yǎng)4、12和24 h時(shí)，蒸汽爆破玉米秸稈表面的微生物數(shù)量明顯多于未處理玉米秸稈，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。因此，蒸汽爆破可通過破壞底物結(jié)構(gòu)來增加瘤胃微生物數(shù)量，從而達(dá)到提高底物利用率的目的。

瘤胃微生物可以介導(dǎo)瘤胃內(nèi)氨的生成，同時(shí)瘤胃內(nèi)產(chǎn)生的氨也會反饋影響微生物的數(shù)量與結(jié)構(gòu)[41]。在適宜的氨濃度范圍內(nèi)，瘤胃微生物可以有效利用NH3-N[42]，但如果氨濃度過高，就會對微生物產(chǎn)生抑制作用，進(jìn)而影響微生物的正常功能。本研究發(fā)現(xiàn)，在未處理秸稈組中，當(dāng)尿素添加劑量達(dá)到100 mg/dL時(shí)，發(fā)酵液中氨濃度達(dá)44.05～47.69 mg/dL，總菌、甲烷菌和原蟲的數(shù)量顯著降低，這說明高濃度的氨會抑制瘤胃微生物的生長和繁殖，進(jìn)而影響其對底物的發(fā)酵利用。但是我們發(fā)現(xiàn)，在以蒸汽爆破玉米秸稈為底物時(shí)，100 mg/dL的尿素添加劑量并沒有對發(fā)酵液中總菌、甲烷菌和原蟲的數(shù)量產(chǎn)生顯著抑制作用，這與未處理秸稈組得到的結(jié)果相反，這說明蒸汽爆破通過提高能量的釋放速率，在一定程度上使尿素氨的釋放與能量釋放更為同步，促進(jìn)瘤胃微生物的生長繁殖以提高NH3-N的利用效率，進(jìn)而緩解高氨濃度對瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生的不利影響。

4 結(jié) 論

蒸汽爆破處理改變玉米秸稈的化學(xué)組成，可通過增加功能微生物數(shù)量改善瘤胃發(fā)酵；在本底氨濃度(10.82 mg/dL)的基礎(chǔ)上，適量(20 mg/dL)添加尿素可提高玉米秸稈瘤胃體外發(fā)酵總VFA產(chǎn)量，而過量添加尿素則會抑制玉米秸稈體外瘤胃發(fā)酵，但蒸汽爆破處理可緩解高氨濃度對其產(chǎn)生的不利影響。