余 洋 沈媛媛* 楊彩梅 劉金松 曾新福 馮 杰

(1.浙江農(nóng)林大學(xué)動物科技學(xué)院·動物醫(yī)學(xué)院，浙江省畜禽綠色生態(tài)健康養(yǎng)殖應(yīng)用技術(shù)研究重點實驗室，動物健康互聯(lián)網(wǎng)檢測技術(shù)浙江省工程實驗室，臨安 311300；2.浙江萬方生物科技有限公司，安吉 313300；3.浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，杭州 310058)

大蒜為百合科蔥屬植物，含有糖類、蛋白質(zhì)、脂類、酶類，同時還富含維生素和微量礦物元素[1]。研究表明大蒜素有“天然抗生素”之稱，其具有廣泛的抗菌作用，可通過競爭性抑制菌體巰基酶、損傷菌體膜系統(tǒng)、抑制菌體生物被膜、產(chǎn)生多靶點抑制效應(yīng)、影響核酸及蛋白質(zhì)合成等方式達(dá)到抑菌效果[2]。大蒜還可間接通過抑制病毒合成而發(fā)揮抗病毒作用，其所抗病毒包括腺病毒、冠狀病毒、甲型流感病毒等[3]。此外，大蒜還具有抗糖化、抗氧化及抗癌作用[4-5]。隨著大蒜藥理、生化、臨床等方面研究的深入，其生物功效(抗菌、消炎、殺蟲、抗氧化等作用)也逐步引入畜牧研究，大蒜作為一種天然的食、藥兩用原材料，有望發(fā)展為綠色、健康、高效的飼料添加劑。研究表明，飼糧中添加大蒜可提高斷奶仔豬的生長性能，改善健康狀況[6]。Shojai等[7]發(fā)現(xiàn)，大蒜對雞胚傳染性支氣管炎病毒有抑制作用，添加大蒜可提高肉雞先天免疫力，抑制腸道致病菌增殖[8-9]。大蒜應(yīng)用于蛋雞可提高其產(chǎn)蛋性能、蛋品質(zhì)[10]。目前大蒜在肉雞上的應(yīng)用研究較少，本研究旨在探究大蒜粉對肉雞生長性能、抗氧化能力、免疫力和腸道形態(tài)的影響，以期為大蒜在畜禽養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用金霉素和大蒜粉均為市購，大蒜粉中大蒜總糖含量≥40%、大蒜蛋白含量≥16%。

1.2 試驗設(shè)計

試驗采用單因子完全隨機(jī)化設(shè)計，選取體重相近、健康狀況良好的1日齡白羽肉雞480羽(公母各占1/2)，隨機(jī)分為4組，每組8個重復(fù)，每個重復(fù)15羽，進(jìn)行為期42 d的飼養(yǎng)試驗。對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，抗生素組飼喂基礎(chǔ)飼糧+75 mg/kg金霉素，2個大蒜粉組分別飼喂基礎(chǔ)飼糧+1 000 mg/kg大蒜粉(1 000 mg/kg大蒜粉組)、基礎(chǔ)飼糧+2 000 mg/kg大蒜粉(2 000 mg/kg大蒜粉組)?；A(chǔ)飼糧參照NRC(1994)肉雞營養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配制，其組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.3 飼養(yǎng)管理

飼養(yǎng)試驗期間480羽肉雞飼養(yǎng)于同一雞舍，每個重復(fù)1籠，采用普通平養(yǎng)模式，按常規(guī)方法定期進(jìn)行免疫接種及疾病預(yù)防、消毒。

1.4 樣品采集

42日齡時每組取8只雞，頸靜脈采血5～6 mL，室溫靜置凝血后放入高速冷凍離心機(jī)(Heal Force-Neofuge 13R，上海智城分析儀器制造有限公司)，以3 000 r/min離心15 min，取血清于500 μL離心管中，-80 ℃保存待測。采血后將試驗雞屠宰，用無菌載玻片刮取回腸黏膜，迅速放入2 mL無RNA酶凍存管中，于-80 ℃保存待測；另用無菌組織剪剪取一段0.5 cm左右的回腸中段，用0.9%生理鹽水沖洗干凈后放入4%甲醛溶液中固定24 h以上。

1.5 指標(biāo)測定及方法

1.5.1 生長性能

空腹稱量1、21、42日齡體重，試驗期間每天記錄每組每個重復(fù)的采食量、死淘率，計算1～21日齡、22～42日齡以及1～42日齡的平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)和料重比(F/G)。

1.5.2 腸道形態(tài)

取出固定好的回腸組織，采用由低到高梯度濃度的酒精作為脫水劑，將組織脫水后置于二甲苯(透明劑)中透明，然后經(jīng)石蠟包埋處理后切成4 μm厚的薄片，置于載玻片上制作切片，常規(guī)蘇木精-伊紅(HE)染色，最后中性樹脂封片。采用光學(xué)顯微鏡(ae-2000，Nikon，日本)觀察切片，記錄絨毛高度、隱窩深度，并計算絨毛高度/隱窩深度(V/C)。

1.5.3 血清和回腸黏膜抗氧化指標(biāo)

取血清及回腸黏膜，按試劑盒說明測定丙二醛(MDA)含量以及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性，測定所用儀器主要有恒溫水浴鍋(HH-2，方科儀器有限公司)、多功能酶標(biāo)儀(Multiskan FC，Thermo Fisher，美國)，所用試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。

1.5.4 血清免疫指標(biāo)

按照酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒說明測定血清中免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白Y(IgY)、免疫球蛋白M(IgM)及炎癥相關(guān)因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)含量，測定所用儀器主要有生化培養(yǎng)箱(SPX-105，寧波海曙賽福光照培養(yǎng)箱)、多功能酶標(biāo)儀(Multiskan FC，Thermo Fisher，美國)，所用ELISA試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。

1.5.5 腸道炎癥相關(guān)基因表達(dá)

取回腸黏膜，勻漿后提取RNA，再利用普通PCR儀(TC-96，BioRad，美國)反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以β-肌動蛋白(β-actin)為內(nèi)參基因，采用實時定量PCR儀(CFX96，BioRad，美國)測定Toll樣受體2(TLR2)、髓樣分化因子88(MYD88)、TNF-α、IL-1β的mRNA相對表達(dá)量。參照文獻(xiàn)設(shè)計TLR2[11]、MYD88[12]、TNF-α[13]、IL-1β[14]引物，并委托擎科生物科技有限公司合成，引物序列見表2。目的基因mRNA相對表達(dá)量的計算采用2-ΔΔCt法，反轉(zhuǎn)錄和實時定量PCR所用試劑盒均購于TaKaRa。

表2 實時定量PCR引物

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2013整理后采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，并采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。

2 結(jié) 果

2.1 大蒜粉對肉雞生長性能的影響

由表3可以看出，與對照組相比，添加大蒜粉顯著降低了1～21日齡肉雞的料重比(P<0.05)，且2 000 mg/kg大蒜粉組1～21日齡肉雞的料重比顯著低于抗生素組(P<0.05)；與對照組相比，添加1 000 mg/kg大蒜粉可顯著提高1～42日齡肉雞的平均日增重(P<0.05)。

2.2 大蒜粉對肉雞腸道形態(tài)的影響

由表4可以看出，21日齡時，大蒜粉組與抗生素組肉雞絨毛高度較對照組顯著提高(P<0.05)，且抗生素組絨毛高度顯著高于1 000 mg/kg大蒜粉組(P<0.05)；2 000 mg/kg大蒜粉組隱窩深度顯著高于對照組和抗生素組(P<0.05)，而1 000 mg/kg大蒜粉組隱窩深度較對照組和抗生素組顯著降低(P<0.05)，且1 000 mg/kg大蒜粉組V/C較對照組和抗生素組顯著升高(P<0.05)。42日齡時，大蒜粉組隱窩深度較對照組和抗生素組顯著降低(P<0.05)，V/C較對照組顯著提高(P<0.05)，但與抗生素組無顯著差異(P>0.05)。

表3 大蒜粉對肉雞生長性能的影響

表4 大蒜粉對肉雞腸道形態(tài)的影響

2.3 大蒜粉對肉雞血清和回腸黏膜抗氧化指標(biāo)的影響

由表5可以看出，2 000 mg/kg大蒜粉組血清GSH-Px活性顯著高于對照組(P<0.05)。各組間血清MDA含量、T-SOD活性差異不顯著(P>0.05)。回腸黏膜中，各組間MDA含量及GSH-Px、T-SOD活性差異均不顯著(P>0.05)。

表5 大蒜粉對肉雞血清和回腸黏膜抗氧化指標(biāo)的影響

2.4 大蒜粉對肉雞血清免疫指標(biāo)的影響

由表6可以看出，大蒜粉組血清IgA、IgY、IgM含量較對照組和抗生素組顯著提高(P<0.05)，血清TNF-α含量則較對照組和抗生素組顯著降低(P<0.05)。1000mg/kg大蒜粉組血清IL-1β含量顯著低于抗生素組(P<0.05)，2 000 mg/kg大蒜粉組血清IL-1β含量顯著低于對照組和抗生素組(P<0.05)。大蒜粉組血清IL-6含量顯著低于抗生素組(P<0.05)。

表6 大蒜粉對肉雞血清免疫指標(biāo)的影響

2.5 大蒜粉對肉雞腸道炎癥相關(guān)基因表達(dá)的影響

由表7可以看出，大蒜粉組回腸黏膜TLR2相對表達(dá)量較對照組顯著降低(P<0.05)，但與抗生素相比則無顯著變化(P>0.05)；抗生素組回腸黏膜MYD88相對表達(dá)量顯著低于對照組和大蒜粉組(P<0.05)；回腸黏膜IL-1β相對表達(dá)量各組間無顯著差異(P>0.05)。

表7 大蒜粉對肉雞腸道炎癥相關(guān)基因表達(dá)的影響

3 討 論

3.1 大蒜粉對肉雞生長性能的影響

研究顯示，飼糧中添加大蒜多糖可提高斷奶仔豬的平均日增重[15]，添加大蒜葉粉可改善肉雞生長性能[16]。但目前關(guān)于大蒜粉對肉雞生長性能影響的研究很少，本試驗結(jié)果表明添加1 000 mg/kg大蒜粉可顯著提高1～42日齡肉雞的平均日增重，降低1～21日齡肉雞的料重比，說明大蒜作為飼料添加劑可提高肉雞的生長性能。

3.2 大蒜粉對肉雞腸道形態(tài)的影響

腸道是營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的最終場所，絨毛高度及隱窩深度影響機(jī)體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，絨毛高度增加，腸道吸收面積及對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收率也增加，隱窩深度越淺，分泌酶的細(xì)胞成熟度越高，分泌功能越強(qiáng)，V/C增加說明腸道消化吸收能力增強(qiáng)[17-18]。本試驗中，大蒜粉組肉雞21日齡回腸絨毛高度顯著高于對照組，42日齡時V/C優(yōu)于對照組，這與Peinado等[9]在肉雞飼糧中添加大蒜衍生物所得試驗結(jié)果基本一致，說明添加大蒜粉有利于肉雞腸道組織形態(tài)發(fā)育和成熟，有利于營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，促進(jìn)肉雞生長。

3.3 大蒜粉對肉雞抗氧化能力的影響

腸道作為機(jī)體防御體系的第1道屏障，其健康是保障動物生長的重要基礎(chǔ)。氧化應(yīng)激極易觸發(fā)炎癥反應(yīng)，誘發(fā)腸道健康問題，且氧化應(yīng)激問題在畜牧養(yǎng)殖中非常普遍，相關(guān)經(jīng)濟(jì)損失巨大[19]。大蒜中的黃酮類物質(zhì)、硒元素、多酚及大蒜素等可通過清除活性氧，增強(qiáng)細(xì)胞中超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和GSH-Px活性，并增加細(xì)胞中谷胱甘肽的含量，進(jìn)而發(fā)揮抗氧化作用[20]；此外，大蒜中的烯丙基半胱氨酸可通過防止細(xì)胞中谷胱甘肽的消耗、抑制過氧化物的表達(dá)來抵抗氧化應(yīng)激損傷[21]。本試驗結(jié)果表明，飼糧中添加2 000 mg/kg大蒜粉可顯著提高肉雞血清中GSH-Px活性，說明大蒜粉可提高肉雞血清抗氧化能力，雖然添加大蒜粉對肉雞回腸黏膜中抗氧化酶活性無顯著影響(可能與肉雞處于非應(yīng)激狀態(tài)有關(guān))，但結(jié)合血清抗氧化指標(biāo)和腸道形態(tài)結(jié)果，可知大蒜粉對解決氧化應(yīng)激引起的腸道健康問題具有一定潛力，但具體作用機(jī)理仍需進(jìn)一步探究。

3.4 大蒜粉對肉雞免疫力的影響

血清免疫球蛋白含量可衡量動物免疫機(jī)能狀況，IgA在病原感染時對維持機(jī)體功能性免疫應(yīng)答至關(guān)重要，IgM、IgY是機(jī)體受抗原誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體，可殺菌、抗病毒，有益于機(jī)體健康。血清白細(xì)胞介素含量可反映機(jī)體炎癥狀況，同時體現(xiàn)機(jī)體免疫力[22]。大蒜中的大蒜素是主要的免疫功效成分。研究顯示，大蒜油對大鼠的輔助型T細(xì)胞(Th1/Th2)有雙重影響，高劑量時，可觸發(fā)Th2型反應(yīng)；低劑量時，Th1型反應(yīng)增強(qiáng)[23]。Keiss等[24]的研究顯示，大蒜可抑制脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，降低血清中細(xì)胞因子IL-1β及TNF-α含量，抑制核因子-κB(NF-κB)的活性。本試驗結(jié)果表明，飼糧中添加大蒜粉可顯著提高肉雞血清IgA、IgY、IgM含量，顯著降低血清促炎因子TNF-α的含量，這與Keiss等[24]的結(jié)果研究一致，說明大蒜可調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力，減輕炎癥反應(yīng)。

TLR2可識別各種微生物成分(各種病原體的脂蛋白、脂肽，來自革蘭氏陽性菌的肽聚糖和脂蛋白酸)，引發(fā)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并導(dǎo)致炎癥介質(zhì)的釋放[25]。TLR2表達(dá)下調(diào)表明炎癥反應(yīng)降低，本試驗中，相比對照組和抗生素組，飼糧中添加大蒜粉顯著降低了肉雞回腸黏膜中TLR2的相對表達(dá)量，與Simon等[26]的研究結(jié)果基本一致。這在血清免疫指標(biāo)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步說明大蒜粉可提高機(jī)體免疫力，有效緩解機(jī)體炎癥反應(yīng)，并可能通過提高免疫力對肉雞腸道、血清抗氧化能力和平均日增重產(chǎn)生積極影響。

4 結(jié) 論

飼糧中添加1 000 mg/kg大蒜粉可提高肉雞的生長性能，提升免疫力，緩解炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激，并有助于改善腸道形態(tài)。