李建兵，喬海清，劉 黎，李世全，王曉濱

（1.青島市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，山東 青島 266101；2.國(guó)家海洋精細(xì)化工及其生物制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，山東 青島 266101；3.青島市黃島區(qū)檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東 青島 266555）

農(nóng)藥是確保農(nóng)業(yè)高收豐產(chǎn)的重要農(nóng)資之一，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)離不開農(nóng)藥[1]。我國(guó)是農(nóng)藥生產(chǎn)和使用大國(guó)，也是農(nóng)藥出口大國(guó)。農(nóng)藥產(chǎn)品質(zhì)量事關(guān)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全、農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全和生態(tài)環(huán)境安全，然而農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公布的近3 年農(nóng)藥產(chǎn)品質(zhì)量總體合格率為88.7%，不合格產(chǎn)品主要集中于有效成分不合格和隱性農(nóng)藥的添加[2]。農(nóng)藥有效成分及含量的監(jiān)管面臨著嚴(yán)峻的考驗(yàn)，關(guān)鍵在于農(nóng)藥中有效成分和隱性成分的準(zhǔn)確定量測(cè)定。

各類農(nóng)藥及其制劑產(chǎn)品中有效成分的液相色譜檢測(cè)方法大多選用甲醇或者甲醇水作為溶劑，可濕性粉劑在加工過(guò)程中一般會(huì)加入載體和助劑，甲基硫菌靈的測(cè)定一般用甲醇提取[3,4]，外標(biāo)法具有操作簡(jiǎn)單，分析快速的優(yōu)點(diǎn)，但在復(fù)雜組分中可能存在基質(zhì)效益的影響；標(biāo)準(zhǔn)加入法能夠有效消除基質(zhì)干擾，但操作略為復(fù)雜，結(jié)果更加準(zhǔn)確[5]。本文選取常見的甲基硫菌靈可濕性粉劑為研究對(duì)象，采用高效液相色譜法進(jìn)行分析，采用外標(biāo)法和標(biāo)準(zhǔn)加入法兩種定量測(cè)定方法進(jìn)行比較研究，為在以后的農(nóng)藥產(chǎn)品仲裁檢驗(yàn)、產(chǎn)品復(fù)檢、標(biāo)準(zhǔn)制修訂時(shí)提供依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

1200 高 效 液 相 色 譜 儀（Agilent）；ML204T/02，0.1mg 電子天平（METTLER）。

甲醇（色譜純CNW 安譜）。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：甲基硫菌靈（Dr.Ehrenstorfer）。

1.2 液相色譜條件

Thermo Hypersil Gold C18柱（250mm×4.6mm，粒徑5μm），流動(dòng)相甲醇∶水=60∶40，流速1.0mL·min-1，進(jìn)樣體積10μL，紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)269nm。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配置

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液 稱取0.1g（精確至0.0001g）甲基硫菌靈標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于50mL 容量瓶中，加入甲醇溶解，并定容至刻度線，配制成2mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)中間液 準(zhǔn)確移取5.0mL 1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于50mL 容量瓶中，加入甲醇定容至刻度線，配制成0.2mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)中間液。

1.3.3 外標(biāo)法標(biāo)準(zhǔn)工作液 取1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)中間液用甲醇逐級(jí)稀釋成0.02～0.6mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4 樣品前處理

共選取3 個(gè)不同廠家甲基硫菌靈可濕性粉劑產(chǎn)品，標(biāo)稱濃度為70%。

1.4.1 外標(biāo)法前處理 分別稱取0.1、0.143、0.2、0.4g 樣品于50mL 容量瓶中，然后準(zhǔn)確移取5.0mL于50mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度線，稀釋10倍，過(guò)濾待測(cè)。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)加入法前處理 分別稱取0.1、0.143g 各3 組樣品于50mL 容量瓶中，加入甲醇溶解定容至刻度線。準(zhǔn)確移取5.0mL 于50mL 容量瓶中，第2、3 組樣品再準(zhǔn)確加入2.5 和5.0mL 0.2mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)使用液（1.3.2），用甲醇定容至刻度線。過(guò)濾待測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 外標(biāo)法標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

外標(biāo)法配制0.02～0.6mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析，線性回歸方程為y=30916.4x+14.15。標(biāo)準(zhǔn)加入法曲線按照1.4.3 處理，以0 倍、1 倍、2 倍加標(biāo)量峰面積為縱坐標(biāo)，加標(biāo)量為橫坐標(biāo)擬合曲線并進(jìn)行樣品檢測(cè)。外標(biāo)法和標(biāo)準(zhǔn)加入法曲線線性相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99，結(jié)果表明，在所測(cè)定濃度范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好。

2.2 方法精密度

取其中一個(gè)70%甲基硫菌靈可濕性粉劑樣品連續(xù)測(cè)定8 次，外標(biāo)法和標(biāo)準(zhǔn)加入法精密度分別為0.83%和1.49%（見圖1），表明外標(biāo)法和標(biāo)準(zhǔn)加入法精密度良好。

圖1 外標(biāo)法和標(biāo)準(zhǔn)加入法精密度Fig.1 Precision of external standard method and standard addition method

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是農(nóng)藥測(cè)定時(shí)不可忽視的一個(gè)重要問(wèn)題，采用t 檢驗(yàn)比較外標(biāo)法和標(biāo)準(zhǔn)加入法標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率來(lái)考察甲基硫菌靈可濕性粉劑的基質(zhì)效應(yīng)。標(biāo)準(zhǔn)加入法與外標(biāo)法斜率比較的t 值根據(jù)公式（1）計(jì)算。標(biāo)準(zhǔn)加入法與外標(biāo)法斜率統(tǒng)計(jì)量t 值為96.24（＞t（11）0.05臨界值=2.20）。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，對(duì)于甲基硫菌靈可濕性粉劑，標(biāo)準(zhǔn)加入法的斜率與外標(biāo)法的斜率存在顯著差異（置信水平α=0.05）。標(biāo)準(zhǔn)加入法的斜率遠(yuǎn)小于外標(biāo)法斜率，這表明，甲基硫菌靈可濕性粉劑的基質(zhì)效應(yīng)為強(qiáng)的抑制效應(yīng)，標(biāo)準(zhǔn)加入法定量甲基硫菌靈可濕性粉劑的檢測(cè)結(jié)果更可靠。

式中 t：標(biāo)準(zhǔn)加入法與外標(biāo)法斜率的統(tǒng)計(jì)量；X：標(biāo)準(zhǔn)加入法斜率平均值；μ：外標(biāo)法斜率；σX：標(biāo)準(zhǔn)加入法斜率標(biāo)準(zhǔn)差；n：標(biāo)準(zhǔn)加入法斜率測(cè)定次數(shù)。

2.4 外標(biāo)法及標(biāo)準(zhǔn)加入法的檢出限和定量限

以3 倍和10 倍信噪比作為外標(biāo)法和標(biāo)準(zhǔn)加入法的檢出限和定量限。外標(biāo)法檢出限和定量限分別為4mg·kg-1和14mg·kg-1，標(biāo)準(zhǔn)加入法檢出限和定量限23mg·kg-1和78mg·kg-1。外標(biāo)法和標(biāo)準(zhǔn)加入法的檢出限和定量限差別較大可能是由于標(biāo)準(zhǔn)加入法的抑制基質(zhì)效應(yīng)產(chǎn)生的。

2.5 外標(biāo)法和標(biāo)準(zhǔn)加入法的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

依照1.4 樣品處理和1.2 液相色譜條件，對(duì)3 個(gè)不同廠家的產(chǎn)品分別用外標(biāo)法和標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行了檢測(cè)，3 個(gè)產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)加入法定量結(jié)果分別為70.09%、70.11%、70.91%；外標(biāo)法定量結(jié)果分別為73.34%、73.73%、74.11%。采用F 檢驗(yàn)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)加入法和外標(biāo)法定量結(jié)果進(jìn)行比較，標(biāo)準(zhǔn)加入法與外標(biāo)法（p<0.001）有顯著差異（見表1）。對(duì)任意兩種不同定量方法測(cè)試結(jié)果的一致性采用t 檢驗(yàn)方法進(jìn)行比較，有顯著差異的兩種定量方法，采用異方差假設(shè)的t 檢驗(yàn)方式。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)加入法與外標(biāo)法檢測(cè)結(jié)果間存在顯著差異（顯著性水平α=0.05）；而標(biāo)準(zhǔn)加入法檢測(cè)的結(jié)果更接近企業(yè)按照配方生產(chǎn)的甲基硫菌靈可濕性粉劑的標(biāo)稱濃度，間接說(shuō)明標(biāo)準(zhǔn)加入法檢測(cè)的結(jié)果更加準(zhǔn)確和可靠。

表1 甲基硫菌靈可濕性粉劑兩種定量方法測(cè)定結(jié)果（采用F 檢驗(yàn)）Tab.1 F test of two different quantitative methods of thiophanate-methyl in wettable powder

表2 甲基硫菌靈可濕性粉劑兩種定量方法測(cè)定結(jié)果（采用t-檢驗(yàn)）Tab.2 t-test of two different quantitative methods of thiophanate-methyl in wettable powder

3 結(jié)論

本文利用HPLC 法對(duì)不同的70%甲基硫菌靈可濕性粉劑農(nóng)藥產(chǎn)品進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)對(duì)外標(biāo)法和標(biāo)準(zhǔn)加入法分別定量分析比較，兩種方法線性好，精密度高，外標(biāo)法測(cè)定甲基硫菌靈可濕性粉劑時(shí)存在基質(zhì)效應(yīng)，F(xiàn)-檢驗(yàn)和t-檢驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)標(biāo)準(zhǔn)加入法和外標(biāo)法在測(cè)定甲基硫菌靈可濕性粉劑時(shí)存在顯著差異，在實(shí)際檢測(cè)中建議采用標(biāo)準(zhǔn)加入法獲得更加準(zhǔn)確可靠的結(jié)果。