聶 振，林思芹，林元山

（湖南農(nóng)業(yè)大學生物科學技術(shù)學院，湖南 長沙 410128）

長期不合理施用無機磷肥易生成難溶性沉淀，使我國南方水稻耕作底層土壤板結(jié)硬化的問題日益突出[1]。研究表明，土壤微生物可有效改善土壤質(zhì)量；水稻根際接中微生物復(fù)合肥，水稻根際固氮菌、磷細菌及解鉀菌的菌數(shù)高于土體1～2 個數(shù)量級[2]。解磷菌范圍廣泛，霉菌、放線菌、細菌均有分布，其中細菌解磷效果較好，種類多，如芽胞桿菌、假單胞菌、洋蔥伯克霍爾德菌等[3-4]。假單胞菌JP2-3 在土壤中具有顯著的解磷和硝態(tài)氮去除效應(yīng)，并能促進黃瓜植株生長。解磷菌劑的應(yīng)用能減少農(nóng)田土壤磷素的流失[5]。解磷細菌的解磷機制十分復(fù)雜，其中，分泌小分子有機酸、無機酸溶解難溶性磷酸鹽的“溶磷”為主，也有解磷菌分泌磷酸酶解磷，還有底物降解釋放磷[6]。為此，深入研究解磷菌及其應(yīng)用對水稻生產(chǎn)和土壤保護具有及其重要現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 培養(yǎng)基（1）有機磷篩選培養(yǎng)基[7]：蛋白胨10.0 g，氯化鈉0.5 g，雞蛋黃20.0 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂粉20.0 g，加蒸餾水至1 000 mL，調(diào)pH 值 7.0～7.5，121℃滅菌25 min。（2）無機磷篩選培養(yǎng)基[8]：葡萄糖20.0 g，磷酸三鈣10.0 g，氯化鎂5 g，硫酸銨5.0 g，氯化鉀0.5 g，瓊脂粉20.0 g，加蒸餾水至1 000 mL，調(diào)pH 值 7.0～7.5，121℃滅菌25 min。（3）斜面培養(yǎng)基：酵母浸膏 5.0 g，氯化鈉 5.0 g，葡萄糖10.0 g，可溶性淀粉10.0 g，瓊脂粉20.0 g，加蒸餾水至1 000 mL，調(diào)pH 值 7.0～7.5，121℃滅菌25 min。（4）解磷基本培養(yǎng)基：葡萄糖2.0 g，硫酸銨0.5 g，磷酸三鈣1.0 g，硫酸鎂0.05 g，氯化鈉0.05 g，氯化鉀0.05 g，七水硫酸亞鐵0.005 g，一水硫酸錳0.003 g，加蒸餾水至100 mL，調(diào)pH值 7.0～7.5，121℃滅菌25 min。（5）阿須貝無氮培養(yǎng)基：甘露醇10.0 g，碳酸鈣 5.0 g，七水硫酸鎂 0.2 g，磷酸二氫鉀 0.2 g，硫酸鈣 0.1 g，氯化鈉 0.2 g，瓊脂粉20.0 g，加蒸餾水至1 000 mL，調(diào)pH 值 7.0～7.5，121℃滅菌25 min。（6）解鉀培養(yǎng)基：三氯化鐵0.005 g，碳酸鈣0.1 g，磷酸氫二鈉2.0 g，七水硫酸鎂0.5 g ，硫酸銨1.0 g，蔗糖5.0 g，鉀長石粉0.1 g，瓊脂20 g，加蒸餾水至1 000 mL，調(diào)pH 值7.0～7.5。121℃滅菌25 min。

1.1.2 水稻根際土壤通過GPS 定位經(jīng)緯度，在湖南省農(nóng)業(yè)科學院至湖南農(nóng)業(yè)大學一帶水稻田大田（東經(jīng)113°4′35″～113°4′47″，北緯28°11′41″～28°11′54″） 范圍內(nèi)，均勻分布采集根際土若干份，取樣深度 5～30 cm，每份樣品濕重200～300 g，置于無菌封口袋中，準確標記，盡快帶回實驗室進行土壤解磷菌株的分離。

1.2 方 法

1.2.1 解磷菌的初步篩選取10 g 新鮮土加入90 mL無菌水至250 mL 無菌三角瓶中， 在200 r/min 恒溫振蕩30 min 后，按10 倍稀釋法依次配制10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的土壤懸浮液，吸取100 μL 均勻涂布于有機或無機磷分離培養(yǎng)基的90 mm 培養(yǎng)皿中，每梯度設(shè)3～6 個重復(fù)，37℃培養(yǎng)3～7 d，觀察是否出現(xiàn)解磷圈，測量解磷圈直徑（D）和菌落直徑（d），并計算溶磷圈的直徑和菌落直徑的比值（D/d），并接種斜面，4℃冰箱保存。

1.2.2 解磷菌的搖瓶復(fù)篩將初篩菌株接種于解磷基本培養(yǎng)基中，于37℃恒溫搖床、200 r/min 的條件下培養(yǎng)6 d，發(fā)酵液在分離因素10 000 g 離心 5 min，以不接種培養(yǎng)基作為空白對照，上清液用鉬銻抗比色法[9]測定可溶性磷含量，每處理設(shè)3 個重復(fù)。菌體磷按釩鉬銻抗比色法測定[10]。

1.2.3 解磷細菌的鑒定（1）解磷菌形態(tài)、生理生化特征按平板觀察。常規(guī)染色顯微觀察，參照《伯杰細菌鑒定手冊》的方法進行。（2）16S rDNA 測序分析。高活性解磷菌株送蘇州金唯智生物科技有限公司，進行16S rDNA 測序，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定種屬。

1.2.4 菌株解鉀能力鑒定將菌株接種至解鉀培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～7 d，觀察是否有解鉀圈。

1.2.5 菌株固氮能力鑒定將菌株接種至阿須貝培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～7 d，觀察菌株能否生長。

2 結(jié)果與分析

2.1 平板初篩

從水稻田中取回12 份土壤樣品，分別進行無機磷降解菌和有機磷降解菌的單菌落分離，分別獲得具有水解圈的無機磷降解菌79 株，有水解圈的有機磷降解菌287 株。經(jīng)形態(tài)初步判斷，無機磷降解菌以細菌為主，少量放線菌，霉菌和酵母菌未曾發(fā)現(xiàn)；有機磷降解菌種類分布較廣，以細菌和霉菌為主，其次為放線菌，少量酵母菌。部分篩選菌落直觀圖片見圖1。從圖1a 可知，無機磷篩選培養(yǎng)基，以無機氮硫酸銨為氮源，營養(yǎng)匱乏，解磷菌在無機磷平板上菌落和溶磷圈較小，土壤無機磷降解菌菌落總數(shù)維持在（5.0±0.5）×107CFU/g 土壤；相反，從圖1b 可知，因養(yǎng)分充足，在有機磷篩選平板上的菌落較大，水解圈也大，土壤有機磷降解菌菌落總數(shù)達（8.0±0.5）×108CFU/g。溶磷圈直徑與菌落的直徑之比（D/d）在1～2 之間，特別是無機磷培養(yǎng)基的溶磷圈難以測定，需要復(fù)篩確定解磷水平。由于耕地土壤板結(jié)主要是無機磷板結(jié)危害影響大，因而，重點研究無機磷的降解菌更有實際意義。

圖1 解磷菌的平板初篩及顯微觀察

2.2 解磷菌的搖瓶復(fù)篩

將初篩菌株進一步接種于解磷基本培養(yǎng)基，于37℃恒溫搖床、200 r/min 的條件下培養(yǎng)6 d 后，測定發(fā)酵液的可溶性磷含量，盡管平板初篩獲得較多的單菌落，但搖瓶復(fù)篩的差異很大，有的菌落難以在解磷基本培養(yǎng)基中有效生長繁殖，有的解磷活性很低，甚至檢測不出。解磷活性較高的部分菌株解磷能力結(jié)果見表1。從表1 可以看出，菌體磷在55 μg/mL 以內(nèi)，發(fā)酵液水溶性磷均低于30 μg/mL，說明菌體在苛刻條件下，主要用于菌體磷的合成，用于自身代謝需要。發(fā)酵液的pH 值普遍低于初始培養(yǎng)基pH 值，一般處于pH 值 5.0～6.8，說明在現(xiàn)有培養(yǎng)基條件下，改變酸堿度的能力有限，但發(fā)酵液的pH 值高低與水溶性磷和菌體磷不成正相關(guān)關(guān)系，可能與菌體分泌小分子酸的強弱有關(guān)，其具體小分子酸的種類和強度有待進一步確定。菌株LSQ31 和NZ 204 的菌體磷和水溶性磷較高，特別菌株LSQ31 菌體磷達52.4 μg/mL，水溶性磷達26.9 μg/mL，總磷達79.3 μg/mL。有望深入基礎(chǔ)研究、探索應(yīng)用潛力。

表1 解磷菌對無機磷的降解利用分析

2.3 氮源對菌株LSQ31 解磷的影響

由于無機磷培養(yǎng)基中有機氮源匱乏，菌體生長較少，而且周期長。在水稻耕作施肥的情形下，水稻田既有有機肥也有無機肥，肥料中的氮源對解磷菌的生長繁殖及解磷效果有影響。圖2 顯示，在搖瓶發(fā)酵條件下，維持基本培養(yǎng)基不變（葡萄糖2.0%），單一更換不同的氮源，菌株LSQ31 在有機氮源的發(fā)酵液中的菌體磷、水溶性磷和總磷差異顯著（P＜0.05，下同）；發(fā)酵液pH 值總體呈酸性。其中菌株LSQ31 在黃豆粕中的菌體磷達102.5 μg/mL，水溶性磷達44.8 μg/mL，總磷達147.3 μg/mL；發(fā)酵液渾濁度更深，pH 值 5.5，顯示更多的生物量。菜籽粕是其次好的一種氮源，有利于解磷菌生長、解磷。

2.4 碳源對菌株LSQ31 解磷的影響

碳源是微生物菌體合成、產(chǎn)物合成和能量代謝的重要成分，也是構(gòu)成菌體小分子有機酸的碳架。圖3顯示，在搖瓶發(fā)酵條件下，變更基本培養(yǎng)基中氮源為黃豆粕（0.5%），同時更換不同的碳源，菌株LSQ31在不同碳源發(fā)酵液中的菌體磷、水溶性磷和總磷差異較大，影響解磷效果降序次序是葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、果糖及可溶性淀粉。其中菌株在葡萄糖中的菌體磷達98.4 μg/mL，水溶性磷達46.8 μg/mL，總磷達145.2 μg/mL；葡萄糖和蔗糖二者的影響差異不大，麥芽糖、果糖和乳糖也比較接近。比較氮源、碳源對解磷的影響，顯然有機氮源的影響更為明顯。

圖3 碳源對菌株LSQ31 解磷的影響

2.5 LSQ31 菌株的鑒定與保存

2.5.1 LSQ31菌株形態(tài)學觀察將LSQ31 菌株接種于LB 培養(yǎng)基平板上進行培養(yǎng)24～72 h，菌落呈圓形，淺黃色不透明，表面粗糙、濕潤、有暈環(huán)、無凸起；在顯微鏡下觀察該菌為球狀，無芽孢產(chǎn)生，運動，不產(chǎn)孢；經(jīng)革蘭氏染色觀察其為革蘭氏陰性菌株，如圖1c 所示。

2.5.2 LSQ31菌株的16S rRNA序列分析LSQ31

菌株經(jīng)測序以及在GenBank 進行BLAST 比對分析，LSQ31 菌株與Vogesella urethralisYM-1(NR169490.1)的同源性達99%。結(jié)果見圖4，初步鑒定菌株LSQ31為Vogesella屬，并且命名為Vogesellasp. LSQ31（福格斯氏菌LSQ31）。

圖4 LSQ31 菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

2.6 LSQ31 菌株的生理生化特征

LSQ31 菌株能在LB 培養(yǎng)基上能生長良好，最適生長溫度為37℃，生物量24 h 達到峰值；在pH 值 5.5～7.5，33～37℃能很好地生長，能好利用葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、阿拉伯糖、果糖、淀粉；能利用明膠、干酪素以及常規(guī)的有機氮源。菌株在LB 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)15 d，仍然有生物活性；在LB 斜面培養(yǎng)基上4℃冰箱保存90 d 仍然存活；在LB 斜面培養(yǎng)基上室溫保存40 d 仍然存活，90 d 后全部死亡。LSQ31 菌株能在無氮培養(yǎng)基上，可能有固氮功能；也能在解鉀培養(yǎng)基上生長，也說明該菌具有一定的解鉀能力。

3 結(jié)論與討論

從水稻根際土壤中篩選出一株解磷活性較高的菌株LSQ31。該菌為革蘭氏陰性球菌，無芽孢。經(jīng)16S rDNA 測序分析，菌株LSQ31 鑒定為Vogesella 屬，并且命名為福格斯氏菌（Vogesella sp.）LSQ31。該菌能利用多種碳源和有機氮源，具有與有機肥相互作用有效解磷，并改善土壤退化的潛力。

福格斯氏菌（Vogesella）的解磷作用，國內(nèi)外鮮見報道。目前，土壤退化較為突出的問題為土壤鹽漬化、土壤酸化、土壤板結(jié)和土壤重金屬污染[11]。添加石灰治理土壤酸化、微生物、有機質(zhì)可以有效修復(fù)土壤鹽漬化、板結(jié)和重金屬污染[12-13]。試驗篩選的福格斯氏菌LSQ31 菌株能更好的利用黃豆粕、菜籽粕等有機氮源，以發(fā)揮解磷功效，預(yù)示該菌株與有機肥可以實現(xiàn)相互作用實現(xiàn)土壤修復(fù)，特別在土壤板結(jié)和重金屬污染方面。該菌的解磷活性與不動桿菌解磷活性（143 μg/mL）相當[6]，具有進一步研究和應(yīng)用的潛力。