河南省許昌市中心醫(yī)院（461000）張應(yīng)

墊狀卷柏是卷柏科卷柏屬植物，在我國(guó)有廣泛的分布和使用，具有活血通經(jīng)、化癖止血的功效[1]。近年來藥理學(xué)研究表明墊狀卷柏具有多種藥理學(xué)活性，其中抗腫瘤活性具有特異性得到關(guān)注和重視[2][3]。本課題組前期對(duì)墊狀卷柏提取物(Selaginelpulvinate extracts，SP)的抗腫瘤活性進(jìn)行系統(tǒng)性的篩選，發(fā)現(xiàn)SP對(duì)人白血病細(xì)胞系K562有較強(qiáng)的增殖抑制作用，且其增殖抑制作用是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的，但同時(shí)也注意到SP的體外抗腫瘤活性不是很強(qiáng)，故筆者開展SP不同極性部位對(duì)K562腫瘤細(xì)胞活性的進(jìn)一步研究。匯報(bào)如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及藥材 人慢性髓系白血病細(xì)胞系（K562）購于中國(guó)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究院細(xì)胞庫。墊狀卷柏購于安徽亳州滕王藥業(yè)有限公司，批號(hào)為1907003，為全草干燥狀態(tài)。

1.2 試劑 RPMI-1640培養(yǎng)液、滅菌胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶購于Gibco公司；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）、無水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇購于國(guó)藥化試。

1.3 儀器 超聲波清洗儀（KQ-500，昆山市超聲儀器有限公司）；HERACELL 150i型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermofisher公司）；生物安全柜（美國(guó)LABCONCO公司）；CKX41型倒置光學(xué)顯微鏡（Olympus公司）；全自動(dòng)酶標(biāo)儀（Thermo）；Anke TDL-40型臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；HH-60L型恒溫水浴鍋（常州國(guó)華電器有限公司）；壓力蒸汽滅菌器（LDZX-50KB，安海申安醫(yī)療器械廠）。

1.4 SP不同極性部位的制備 取墊狀卷柏干燥全草，粉碎過40目篩備用。稱取10kg狀卷柏干燥全草粉末，以75%乙醇作為提取溶劑（料液比1∶20），浸提24h后，加熱回流提取1h，真空抽濾后濾渣重復(fù)上操作2次，最后合并濾液，旋蒸濃縮后并減壓干燥，共得589g（得率為5.89%）。取墊狀卷柏提取物500g用適量純化水混懸后，采用不同極性溶劑進(jìn)行依次萃取，依次為：石油醚、乙酸乙酯、正丁醇。減壓濃縮干燥后分別得到SP不同極性部位粉末或浸膏，石油醚極性部位4.2g（得率為0.049%），乙酸乙酯極性部位60.2g（得率為0.709%），正丁醇極性部位110.7g（得率為3.185%）；剩余的水液減壓濃縮干燥，得到水層極性部位270.4g（得率為3.185%）。

1.5 樣品溶液的制備 實(shí)驗(yàn)臨用前用DMSO溶解得到高濃度的母液，0.22μm濾膜過除濾后待用，給藥時(shí)用PBS溶液稀釋至所需的濃度。最高給藥濃度組所用的藥液中DMSO濃度均小于0.3%，預(yù)實(shí)驗(yàn)表明含0.3%DMSO的PBS組與PBS空白組相比較，對(duì)本研究所涉及腫瘤細(xì)胞株的吸光度均無顯著性差異（P>0.05），說明含0.3%DMSO的PBS對(duì)本研究中所有腫瘤細(xì)胞株的增殖無影響。

1.6 SP不同極性部位對(duì)腫瘤細(xì)胞的體外抗腫瘤活性檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人慢性髓系K562腫瘤細(xì)胞，脫壁重懸后，以6×104個(gè)/mL濃度接種于96孔板中，每孔100μL，移入CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，吸棄原培養(yǎng)液，加入RPMI1640培養(yǎng)液90μL，再加入10μL不同濃度的SP不同極性部位溶液，每個(gè)藥物濃度設(shè)置平行6個(gè)復(fù)孔，上下為本底對(duì)照，并另設(shè)PBS作為空白對(duì)照組。最后移入CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱再培養(yǎng)，48h后吸棄培養(yǎng)液，加入0.5mg/mL MTT溶液10μL培養(yǎng)4h后棄MTT溶液，每孔加DMSO150μL，在微量振蕩儀避光振蕩10min，用酶標(biāo)儀檢測(cè)490nm波長(zhǎng)處的吸光度（A值）。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組A值/空白對(duì)照組A值）×100%。藥物半數(shù)抑制濃度IC50用SPSS16.0軟件進(jìn)行計(jì)算。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件統(tǒng)計(jì)分析。組間計(jì)量數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SP不同極性部位對(duì)多種腫瘤細(xì)胞株增殖的影響 MTT結(jié)果顯示，與PBS空白對(duì)照組相比，在設(shè)定實(shí)驗(yàn)濃度下SP水層部位對(duì)細(xì)胞增殖抑制率未發(fā)現(xiàn)有明顯差異(P＞0.05)，說明SP水層部位在設(shè)定的濃度下對(duì)K562腫瘤細(xì)胞株的增殖無影響；與PBS空白對(duì)照組相比，SP石油醚部位(10μg/mL～250μg/mL濃度范圍內(nèi))、SP乙酸乙酯部位(5μg/mL～250μg/mL濃度范圍內(nèi))和SP正辛醇部位(25μg/mL～250μg/mL濃度范圍內(nèi))對(duì)K562腫瘤細(xì)胞株均有明顯增殖抑制作用(P＜0.05)，且抑制效應(yīng)呈明顯的濃度依賴性，如附圖所示。

附圖 不同濃度SP極性部位對(duì)各系腫瘤細(xì)胞增殖作用的影響(±s,n=6)

2.2 SP不同極性部位對(duì)多種腫瘤細(xì)胞株增殖抑制的IC50SP不同極性部位對(duì)K562腫瘤細(xì)胞株的IC50通過SPSS16.0軟件計(jì)算，SP水層部位無細(xì)胞增殖活性無法計(jì)算；SP石油醚部位、SP乙酸乙酯部位和SP正辛醇部位分別為45.7μg/mL、16.1μg/mL和159.8μg/mL，其中SP乙酸乙酯部位的IC50遠(yuǎn)小于其他極性部位的IC50，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討論

卷柏屬植物作為民間傳統(tǒng)草藥被用于腫瘤方面的治療，其中卷柏屬植物中的墊狀卷柏被中國(guó)藥典收錄，主治經(jīng)閉痛經(jīng)、損傷跌等癥，其成分較為復(fù)雜，主要有雙黃酮類、炔酚類、苯丙素類、生物堿類等[4][5]。

本課題組前期對(duì)SP在不同系列腫瘤細(xì)胞系的增殖活性進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)對(duì)人白血病細(xì)胞系K562的敏感性最高且作為機(jī)制是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但I(xiàn)C50均較高約在200μg/mL；筆者對(duì)SP通過萃取得到不同極性部位，發(fā)現(xiàn)SP乙酸乙酯部位活性最高，IC50僅為SP的1/10。但SP乙酸乙酯部位其中化學(xué)成分也較為復(fù)雜，有些化合物可能并不具有抗腫瘤活性，甚至可能抑制抗腫瘤活性。這些都十分值得進(jìn)一步的深入研究，這也是本課題組下一步的主要研究方向。

綜上所述，SP乙酸乙酯部位對(duì)K562腫瘤細(xì)胞有較高的增殖抑制活性，其中可能發(fā)揮抗腫瘤活性的主要成分及相應(yīng)機(jī)制需進(jìn)一步的研究。