李祎龍, 雷 凱, 張小昭, 丁敬健, 張升濤, 喬 偉, 郭永峰

(陜西省西安市第九醫(yī)院 普外一科, 陜西 西安, 710054)

結(jié)腸癌是一種普遍存在于發(fā)達(dá)國家和發(fā)展中國家的常見惡性腫瘤，在全世界與癌癥相關(guān)的死亡原因中排名第2位，占所有癌癥的10%～15%[1]。細(xì)胞凋亡是對抗癌癥的重要防御機(jī)制，可導(dǎo)致潛在的有害細(xì)胞死亡[2]。自噬可能在癌癥的發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮不同的作用，同時也可能在腫瘤生長的不同階段促進(jìn)或抑制細(xì)胞增殖[3-4]。在應(yīng)激反應(yīng)中，自噬調(diào)節(jié)是由激酶介導(dǎo)的，如哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和腺苷單磷酸活化蛋白激酶(AMPK)[5]。WEI Q等[6]研究發(fā)現(xiàn)，山楂酸可通過AMPK/mTOR信號通路抑制結(jié)腸腫瘤的發(fā)生。1, 25-二羥維生素D3[1, 25-(OH)2D3]作為一種多效激素，除具有對鈣和磷酸鹽代謝以及骨骼生物學(xué)的經(jīng)典調(diào)節(jié)作用外，還具有抗增殖、促凋亡和促分化等作用，這些作用表明1, 25-(OH)2D3具有顯著的抗癌活性[7-9]。相關(guān)研究[10]發(fā)現(xiàn), 1, 25-(OH)2D3對結(jié)腸癌有保護(hù)作用，但其作用機(jī)制尚不明確。本研究以HCT-116人結(jié)腸癌細(xì)胞為模型，觀察1, 25-(OH)2D3對細(xì)胞凋亡和自噬的影響，并通過AMPK/mTOR通路探究其作用機(jī)制，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。1, 25-(OH)2D3, 貨號705942, 購自美國Sigma公司。Dorsomorphin(AMPK抑制劑)，貨號ab120843, 購自美國Abcam公司。Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，序號G003-1-2, 購自南京建成生物工程研究所。cleaved Caspase 3一抗(貨號9664), cleaved Caspase 8一抗(貨號8592), LC3A/B一抗(貨號12741), Beclin-1一抗(貨號3495), mTOR一抗(貨號2983), p-mTOR一抗(貨號5536), 辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗小鼠IgG二抗(貨號7074), 均購自美國Cell Signaling Technology公司。AMPK一抗，貨號MA5-15815; p-AMPK一抗，貨號44-1150G, 購自美國Thermo Fisher Science公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo Fisher Scientific公司，流式細(xì)胞儀(ZS-AE7S)購自中生(蘇州)醫(yī)療科技有限公司，凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng): 人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116用含有10%胎牛血清和青鏈霉素(100 U/mL)的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中。將細(xì)胞培養(yǎng)至生長對數(shù)期用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 分組及給藥: 經(jīng)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選1, 25-(OH)2D3對HCT-116細(xì)胞的處理濃度，分為5組，即對照組(正常培養(yǎng)基培養(yǎng))、低劑量組[1, 25-(OH)2D310 nmol/L]、中劑量組[1, 25-(OH)2D3100 nmol/L]、高劑量組[1, 25-(OH)2D31 000 nmol/L]和聯(lián)合組[1, 25-(OH)2D31 000 nmol/L加AMPK抑制劑Dorsomorphin 10 μmol/L]。

1.3.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況: 將生長對數(shù)期的HCT-116細(xì)胞(1×106個/mL)取1 mL接種于6孔板中，于37 ℃孵育24 h。不同組別采用相應(yīng)濃度的1, 25-(OH)2D3和Dorsomorphin處理，再連續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，采用Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒的方案進(jìn)行檢測。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞，以FlowJo軟件分析數(shù)據(jù)。

1.3.4 透射電鏡觀察細(xì)胞自噬情況: 根據(jù)1.3.3方法處理細(xì)胞，收集藥物處理后的細(xì)胞，胰蛋白酶處理，用2.5%磷酸鹽緩沖的戊二醛固定30 min, 再固定在1%四氧化鋨中。將細(xì)胞包埋、切片，用乙酸鈾酰和檸檬酸鉛雙重染色，并應(yīng)用JEM-1200EX透射電子顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.3.5 Western blot(WB)分析凋亡相關(guān)蛋白、自噬相關(guān)蛋白和AMPK/mTOR通路相關(guān)蛋白: 根據(jù)1.3.3方法處理細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌經(jīng)藥物處理后的HCT-116細(xì)胞，收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，提取總蛋白，以BCA法檢測蛋白濃度。SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，加一抗(Caspase 3、Caspase 8、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、Beclin-1、p-AMPK、AMPK、mTOR、p-mTOR，稀釋比例為1∶1 000), 4 ℃孵育過夜，洗膜加二抗，在37 ℃條件下孵育1 h, 曝光顯色。以β-actin為內(nèi)參蛋白，分析各蛋白的相對表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 1, 25-(OH)2D3對HCT-116細(xì)胞凋亡的影響

低劑量組、中劑量組、高劑量組的HCT-116細(xì)胞凋亡率均高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 聯(lián)合組的HCT-116細(xì)胞凋亡率低于高劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。聯(lián)合組的HCT-116細(xì)胞凋亡率與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1、表1。

表1 各組HCT-116細(xì)胞凋亡情況比較

2.2 1, 25-(OH)2D3對HCT-116細(xì)胞自噬情況的影響

與對照組相比，低劑量組、中劑量組、高劑量組存在更高水平的自噬; 與高劑量組相比，聯(lián)合組的HCT-116細(xì)胞自噬程度降低。見圖2。

2.3 1, 25-(OH)2D3對HCT-116細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

低劑量組、中劑量組、高劑量組的cleaved Caspase3、cleaved Caspase8蛋白表達(dá)水平高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 聯(lián)合組的cleaved Caspase3、cleaved Caspase8蛋白表達(dá)水平低于高劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3、表2。

表2 各組HCT-116細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況比較

2.4 1, 25-(OH)2D3對HCT-116細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

低劑量組、中劑量組、高劑量組的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1蛋白表達(dá)水平高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 聯(lián)合組的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1蛋白表達(dá)水平低于高劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4、表3。

表3 各組HCT-116細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)情況比較

2.5 1, 25-(OH)2D3對HCT-116細(xì)胞AMPK/mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

低劑量組、中劑量組、高劑量組的p-AMPK/AMPK蛋白水平高于對照組, p-mTOR/mTOR蛋白水平低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 聯(lián)合組的p-AMPK/AMPK蛋白水平低于高劑量組, p-mTOR/mTOR蛋白水平高于高劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖5、表4。

表4 各組HCT-116細(xì)胞AMPK/mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況比較

3 討 論

結(jié)腸癌是世界范圍內(nèi)最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，臨床常選擇手術(shù)、放療、化療等方法治療結(jié)腸癌[11]。盡管結(jié)腸癌的治療已經(jīng)取得進(jìn)展，但結(jié)腸癌的復(fù)發(fā)率和病死率仍然很高。1, 25-(OH)2D3是具有強(qiáng)大抗癌活性的激素，具有廣泛的抗腫瘤譜[12]。近年來，學(xué)者們對1, 25-(OH)2D3在腫瘤中的作用機(jī)制開展了大量研究，并揭示了其作用的一些潛在分子機(jī)制，本研究則觀察了1, 25-(OH)2D3對人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞凋亡和自噬的影響并初步探討其機(jī)制。

細(xì)胞凋亡又稱程序性細(xì)胞死亡，是細(xì)胞維持生命活動的重要過程[13]。細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是有效的抗癌治療方案的關(guān)鍵。1, 25-(OH)2D3可上調(diào)p53并調(diào)節(jié)其下游線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑，發(fā)揮抑制人肝癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)其凋亡的作用[14]。LEE J等[15]研究發(fā)現(xiàn)，1, 25-(OH)2D3可通過上調(diào)FOXO3抑制腎癌細(xì)胞的腫瘤活性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Caspase家族是哺乳動物中程序性細(xì)胞死亡的“發(fā)起者”和“執(zhí)行者”。Caspase啟動子首先被凋亡信號激活，然后激活下游級聯(lián)的Caspase效應(yīng)分子; 細(xì)胞中的一系列底物被特異性地水解，最后導(dǎo)致細(xì)胞解體。Caspase-3是其中最重要的凋亡效應(yīng)分子，其位于每個凋亡信號傳導(dǎo)途徑的中心。Caspase-3激活后，細(xì)胞死亡是不可避免的[16-17]。本研究WB結(jié)果顯示, 1, 25-(OH)2D3處理顯著上調(diào)cleaved Caspase-3和cleaved Caspase-8表達(dá)，誘導(dǎo)HCT-116細(xì)胞凋亡，這與Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果一致，表明1, 25-(OH)2D3可刺激Caspase-3、Caspase-8蛋白激活，增強(qiáng)結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞凋亡。

自噬是一個關(guān)鍵的細(xì)胞過程，通常保護(hù)細(xì)胞和生物體免受營養(yǎng)缺乏等應(yīng)激源的影響，除了在正常生理過程中的作用外，還在癌癥等病理過程中發(fā)揮重要作用。相關(guān)研究[18]發(fā)現(xiàn)，自噬可抑制腫瘤生長，自噬基因的缺失會導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。Beclin-1最初被鑒定為腫瘤抑制基因，是凋亡和自噬之間的關(guān)鍵分子之一，可通過促進(jìn)細(xì)胞自噬來抑制腫瘤[19]。當(dāng)自噬過程開始時, LC3Ⅰ(16 kDa)被轉(zhuǎn)換為LC3Ⅱ(14 kDa), 通過檢測LC3Ⅱ、LC3Ⅰ水平獲得LC3Ⅱ/LC3Ⅰ, 可反映自噬水平[20]。本研究透射電鏡結(jié)果證實(shí), 1, 25-(OH)2D3處理可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬特征的改變。WB結(jié)果顯示, 1, 25-(OH)2D3可上調(diào)Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(dá)，表明1, 25-(OH)2D3可增強(qiáng)HCT-116細(xì)胞自噬誘導(dǎo)。

AMPK作為一種能量傳感器，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝和穩(wěn)態(tài)、促進(jìn)自噬等功能，而mTOR為一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖、運(yùn)動和生存，是自噬的抑制劑[5]。AMPK/mTOR作為與細(xì)胞自噬相關(guān)的信號傳導(dǎo)途徑，與腫瘤抑制作用密切相關(guān)。WANG F等[21]研究發(fā)現(xiàn)，通過激活A(yù)MPK-mTOR-ULK1軸增強(qiáng)自噬，天然植物提取物10-羥基喜樹堿可促進(jìn)人膀胱癌細(xì)胞凋亡。百里香亦可通過AMPK/mTOR信號通路誘導(dǎo)自噬，抑制腎癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[22]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn), HCT-116細(xì)胞經(jīng)1, 25-(OH)2D3處理后, AMPK磷酸化水平升高, mTOR磷酸化水平降低，表明1, 25-(OH)2D3可促進(jìn)AMPK蛋白激活，抑制mTOR蛋白激活。此外，在AMPK抑制劑的作用下, 1, 25-(OH)2D3誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡和自噬作用減弱，表明1, 25-(OH)2D3通過調(diào)控AMPK/mTOR信號通路改變結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡和自噬。

綜上所述, 1, 25-(OH)2D3可通過調(diào)控AMPK/mTOR信號通路增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡和自噬，發(fā)揮抗腫瘤作用。然而，結(jié)腸癌細(xì)胞的自噬過程比較復(fù)雜，仍有很多作用機(jī)制尚未闡明，未來還需進(jìn)一步深入研究。