劉運(yùn)華 吳坤 劉曉燕

大多數(shù)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase Deficiency，G6PD）缺乏癥終生無(wú)癥狀，而感染等促發(fā)因素作用下或者在伯氨喹、拉布立酶等藥物使用下，會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重急性溶血性貧血和黃疸［1］。研究發(fā)現(xiàn)，新生兒黃疸患者中G6PD 缺乏癥的優(yōu)勢(shì)比（Odds Ratio）為8.01［2］，及早發(fā)現(xiàn)和治療能夠有效避免和減少輸血治療。

按《新生兒疾病篩查技術(shù)規(guī)范（2010年版）》［3］和《新生兒疾病篩查管理辦法》［4］要求，用熒光免疫分析法測(cè)G6PD 活性進(jìn)行篩查。G6PD 活性受基因調(diào)控，研究表明G6PD 缺乏癥有遺傳異質(zhì)性，發(fā)現(xiàn)200 多種G6PD 基因突變位點(diǎn)［5］。G6PD 的活性和穩(wěn)定性與突變位點(diǎn)密切相關(guān)［6］。因不同種族、地域G6PD 基因突變頻率不同及實(shí)驗(yàn)環(huán)境等多方面的差異，需建立實(shí)驗(yàn)室的截?cái)嘀?。用ROC 曲線法建立河源地區(qū)新生兒G6PD 缺乏癥篩查截?cái)嘀担瑸楫?dāng)?shù)爻錾巳篏6PD 防控策略提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本

標(biāo)本均在家屬同意條件下采集。檢測(cè)2015年1月至2020年12月在轄區(qū)內(nèi)分娩的新生兒干血斑，共213 261 例，男性113 842 例，女 性99 419例。按《新生兒疾病篩查技術(shù)規(guī)范（2010年版）》［3］要求，納入標(biāo)準(zhǔn)：充分哺乳條件下，于分娩后3～7 天（早產(chǎn)兒、極低體重兒等可延遲至20 天）采血，至少3 個(gè)血斑，且每個(gè)血斑直徑大于8 毫米，血滴自然滲透，濾紙正反面血斑一致，無(wú)污染。常溫下平放晾干，應(yīng)避免紫外線或陽(yáng)光照射，信息完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：血斑過(guò)小，血滴未滲透，有污染，溶血，信息不完整等。研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意開展。

1.2 試劑與儀器

G6PD 測(cè)定試劑盒（熒光法，6199860，芬蘭雷勃診斷試劑有限公司，960T/盒）、G6PD 測(cè)定試劑盒（比值法，20152400813，科方生物技術(shù)股份有限公司，A 液：5 mL/盒，B 液：5 mL/盒）、G6PD 基因突變檢測(cè)試劑盒（20071501，廈門致善生物科技股份有限公司，48T/盒）。Fluoroskan Ascent 熒光讀數(shù)儀（Thermo，美國(guó)）、iEMS 恒溫孵育振蕩器（Thermo，美國(guó)）、ANI Labsystems Woodpecker 打孔儀（Thermo，美國(guó)）、日立7180 全自動(dòng)生化分析儀（HITACHI，日本）、核酸提取儀Lab-Aid 824（致善，中國(guó)）、實(shí)時(shí)熒光PCR 儀CFX96（伯樂(lè)，美國(guó)）。

1.3 篩查方法

按說(shuō)明書操作，以中、低值的質(zhì)控品作為質(zhì)量控制，每年參與并通過(guò)國(guó)家臨床檢驗(yàn)中心室間質(zhì)量評(píng)價(jià)。結(jié)果判斷：以說(shuō)明書推薦的截?cái)嘀担ā?.00 U/gHb）或暫行截?cái)嘀担ā?.50 U/gHb），如G6PD活性≤3.00 或4.50 U/gHb 為篩查陽(yáng)性；如G6PD 活性＞3.00 或4.50 U/gHb 為篩查陰性。按《新生兒疾病篩查管理辦法》［4］召回管理制度，非本院分娩的篩查陽(yáng)性新生兒由采血單位召回驗(yàn)證。

1.4 驗(yàn)證方法

取枸櫞酸抗凝血2 mL，以G6PD/6PGD 比值法進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證結(jié)果判斷：新生兒（年齡≤28 d），比值＞1.1，判為陰性，1.05≤比值≤1.10 為可疑陽(yáng)性，建議復(fù)查，比值＜1.05，判為陽(yáng)性；非新生兒（年齡＞28 d），比值＞1.0，判為陰性，0.95≤比值≤1.00 為可疑陽(yáng)性，建議復(fù)查，比值＜0.95，判為陽(yáng)性。

1.5 G6PD 基因突變檢測(cè)

取EDTA 抗凝血2 mL，用熒光PCR 熔解曲線法測(cè)中國(guó)人群常見12 種突變點(diǎn)：c.517T＞C、c.392G＞T、c.487G＞A、c.592C＞T、c.95A＞G、c.871G＞A、c.1004C＞A、c.1024C＞T、c.1360C＞T、c.1376G＞T、c.383T＞C 和c.1388G＞A。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行分析；計(jì)數(shù)資料用n（%）表示，用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料用（）表示，組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；篩查截?cái)嘀涤肦OC 曲線，用MedCalc 軟件制作受試者工作特征曲線；P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 G6PD 缺乏癥篩查截?cái)嘀档慕?/h3>

在男性和女性組中，G6PD 缺乏癥分別占21.00%（1548/7373）、25.04%（335/1338），ROC 曲線下面積分別為0.995（標(biāo)準(zhǔn)誤為0.001，95%CI：0.993～0.997，U=367.727，P＜0.001）、0.983（標(biāo) 準(zhǔn)誤 為0.0002，95%CI：0.974～0.989，U=174.302，P＜0.001），對(duì)應(yīng)男、女性的截?cái)嘀稻鶠?.42 U/gHb。見圖1。

圖1 G6PD 活性ROC 曲線Figure 1 ROC Curve for G6PD Activity

2.2 不同G6PD 截?cái)嘀档南嚓P(guān)指標(biāo)評(píng)價(jià)

對(duì)說(shuō)明書推薦的截?cái)嘀担?.00 U/gHb）、暫行截?cái)嘀担?.50 U/gHb）、ROC 曲線推薦的截?cái)嘀担?.42 U/gHb）進(jìn)行分析，不同截?cái)嘀翟诓煌詣e中的相關(guān)評(píng)價(jià)指標(biāo)。見表1、表2。

表1 男性新生兒不同G6PD 截?cái)嘀档南嚓P(guān)指標(biāo)評(píng)價(jià)Table 1 Evaluation of relevant indicators of different G6PD cut-off values in male newborns

表2 女性新生兒不同G6PD 截?cái)嘀档南嚓P(guān)指標(biāo)評(píng)價(jià)Table 2 Evaluation of relevant indicators of different G6PD cut-off values in female newborns

2.3 部分新生兒G6PD 基因突變情況

隨機(jī)選取14 名男性與27 名女性新生兒行G6PD 基因檢測(cè)，結(jié)果：在男性組，11 名未發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)，3 名半合子突變，突變位點(diǎn)分別為c.1376G＞T、c.95A＞G、c.871G＞A。在女性組，4 名未發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)，1 名雙雜合子突變（c.1024C＞T 合 并c.1376G＞T），22 名雜合子突變：突變位點(diǎn)依次為9例c.1376G＞T、6 例c.1388G＞A、2 例c.95A＞G、1 例c.871G＞A、1 例c.392G＞T、1 例c.517T＞C、1 例c.519C＞T、1 例c.592C＞T。選擇女性新生兒的G6PD 突變基因與G6PD 活性和G6PD/6PGD 比值均進(jìn)行相關(guān)性分析，21 例G6PD 雜合突變新生兒G6PD 活性大于3.00 U/gHb，其中8 例G6PD/6PGD比值＜1.05 為G6PD 缺乏癥者，13 例G6PD/6PGD 比值≥1.05。見圖2。

圖2 41 例新生兒G6PD 突變基因分析Figure 2 Analysis of G6PD mutation gene in 41 newborns

2.4 不同截?cái)嘀礕6PD 缺乏癥篩查情況

截?cái)嘀涤?.00 U/gHb 升至4.50 U/gHb，女性陽(yáng)性率明顯升高，男性升高不明顯，見表3。

表3 不同截?cái)嘀礕6PD 缺乏癥篩查結(jié)果［n（%）］Table 3 Screening results for G6PD deficiency at different cut-off values［n（%）］

2.5 不同截?cái)嘀礕6PD 缺乏癥篩查陽(yáng)性確診情況

截?cái)嘀禐?.00 U/gHb 時(shí)，本院標(biāo)本篩查總陽(yáng)性率為6.66%（1 171/17 575），男性為10.59%（1 019/9 625），女性為1.91%（152/7950）。截?cái)嘀禐?.50 U/gHb 時(shí)，本院標(biāo)本篩查總陽(yáng)性率為8.89%（3 669/41 251），男性為11.61%（2 587/22 285），女性為5.70%（1 082/18 966）。截?cái)嘀禐?.00 U/gHb 與4.50 U/gHb 時(shí)確診情況如表4。由截?cái)嘀禐?.00 U/gHb、4.50 U/gHb 時(shí)可推算河源新生兒G6PD 缺乏癥總體發(fā)生率分別為6.57%、8.84%。

表4 不同截?cái)嘀等狈ΠY初篩陽(yáng)性新生兒確診情況［n（%）］Table 4 Confirmation of newborns with positive primary screening for deficiency at different cut-off values［n（%）］

2.6 河源地區(qū)新生兒G6PD 活性分布情況

113 842 例男性和99 419 例女性新生兒G6PD活性均屬正偏態(tài)性分布，見圖3。男性組，1%、5%、10%分位數(shù)值分別為0.21 U/gHb、0.62 U/gHb、2.00 U/gHb，均值為8.06 U/gHb，標(biāo)準(zhǔn)差為3.49 U/gHb；女性組，1%、5%、10%分位數(shù)值分別為1.02 U/gHb、4.01 U/gHb、4.91 U/gHb，均值為8.34 U/gHb，標(biāo)準(zhǔn)差為2.88 U/gHb。截?cái)嘀涤?.00 U/gHb 升至4.50 U/gHb 時(shí)，男女可分別新增917、3 791 名 可 疑G6PD 缺乏癥。

圖3 新生兒G6PD 活性分布Figure 3 Distribution of G6PD activity in newborns

3 討論

篩查截?cái)嘀颠x擇有三種方式，一是根據(jù)試劑盒截?cái)嘀祦?lái)判讀結(jié)果［7］，二是參考G6PD 缺乏癥新生兒篩查診斷和治療專家共識(shí)［8］，三是根據(jù)當(dāng)?shù)厍闆r，建立截?cái)嘀?。盡管國(guó)內(nèi)有將百分位數(shù)法作為制定篩查截?cái)嘀档难芯?，但其無(wú)法具體表達(dá)敏感度和特異度兩者間的關(guān)系，僅適用于建立醫(yī)學(xué)參考范圍。ROC 曲線通過(guò)動(dòng)態(tài)改變G6PD 活性的截?cái)嘀?，獲得對(duì)應(yīng)靈敏度與特異度，較百分位數(shù)法更能展示任意截?cái)嘀禃r(shí)對(duì)疾病的識(shí)別能力。ROC 曲線的截?cái)嘀禐?.42 U/gHb，男性和女性ROC 曲線下面積分別為0.995、0.983。一般認(rèn)為ROC 曲線下面積大于0.9 時(shí)診斷準(zhǔn)確性較好。研究發(fā)現(xiàn)，以說(shuō)明書推薦的3.00 U/gHb 為截?cái)嘀?，可大大減少召回?cái)?shù)量，減輕家長(zhǎng)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，但會(huì)大幅增加假陰性，讓G6PD 缺乏癥新生兒錯(cuò)過(guò)最佳治療時(shí)期，造成嚴(yán)重后果。綜合各評(píng)價(jià)指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)室仍用4.50 U/gHb 作為G6PD 缺乏癥篩查截?cái)嘀怠?/p>

為驗(yàn)證截?cái)嘀档目茖W(xué)性，隨機(jī)選取14 名男性與27 名女性新生兒行G6PD 基因檢測(cè)，研究發(fā)現(xiàn)，不同基因突變會(huì)導(dǎo)致不同水平的G6PD 活性下降，與以往研究一致，女性雜合子G6PD 活性范圍波動(dòng)較大［9］。部分?jǐn)y帶G6PD 突變基因的女性，其G6PD 活性為3.00～4.50 U/gHb，按3.00 U/gHb 作為截?cái)嘀?，將?huì)漏診。男性組未發(fā)現(xiàn)G6PD 活性為3.00～4.50 U/gHb 的半合子新生兒，其原因可能是標(biāo)本量少。此外發(fā)現(xiàn)c.1376G＞T、c.1388G＞A、c.95A＞G 是3 種主要基因突變類型，與全國(guó)其它地區(qū)一致［10］。

河源地區(qū)出生人群G6PD 缺乏癥陽(yáng)性率高于同為粵北地區(qū)的梅州市5.18%［11］、清遠(yuǎn)市7.94%［12］、韶關(guān)市5.19%［13］，結(jié)論同以往研究一致［14-15］。男性G6PD 缺乏癥比女性更易受累，主要臨床表現(xiàn)一般在半合子男性和純合子女性中被注意到［16］，而一些雜合女性因臨床表現(xiàn)輕而拒絕召回。

研究收集部分新生兒數(shù)據(jù)繪制ROC 曲線，建立的G6PD 篩查截?cái)嘀敌柙谂R床實(shí)踐中不斷進(jìn)行驗(yàn)證，定期重新評(píng)估。研究發(fā)現(xiàn)，常規(guī)G6PD 酶測(cè)定法易漏診雜合子女性，了解女性G6PD 基因的雜合子狀態(tài)將有助避免雜合子女性成為氧化應(yīng)激食物和藥物的受害者［17］。近年來(lái)，有研究人員設(shè)置不同G6PD 活性的截?cái)嘀担詤^(qū)分正常、雜合基因突變個(gè)體［18］，豐富了常規(guī)G6PD 酶測(cè)定法的意義。

建立河源地區(qū)G6PD 篩查截?cái)嘀担兄谔岣弑镜谿6PD 缺乏癥檢出率，減少和預(yù)防G6PD 缺乏引起的系列疾病發(fā)生。