胡榮鎖 況沁蕊 王曉陽 William SOLANO 龍宇宙 陳治華 李學(xué)俊 蔣快樂 董文江

摘 ?要：為研究‘迷你紅柚果實(shí)發(fā)育過程中的類胡蘿卜素組分與含量變化，本研究采用正乙烷-無水乙醇-丙酮（2∶1∶1）萃取法對(duì)‘迷你紅柚果實(shí)中的類胡蘿卜素進(jìn)行快速提取，利用高效液相色譜（HPLC）測(cè)定了果實(shí)海綿層、囊衣和汁胞及其不同發(fā)育時(shí)期的類胡蘿卜素組分和含量。結(jié)果表明，流動(dòng)相為乙腈-甲醇-四氫呋喃（90∶5∶5），流速0.3?mL/min，進(jìn)樣量10 μL，柱溫40?℃，樣品室溫度20?℃，檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm，3種類胡蘿卜素8 min內(nèi)即可較好地分離;‘迷你紅柚成熟果實(shí)中含有3種類胡蘿卜素，含量從高到低依次是番茄紅素、β-胡蘿卜素和玉米黃素;類胡蘿卜素主要積累在汁胞中，番茄紅素是紅色的汁胞、囊衣和海綿層中最重要的色素;隨著果實(shí)的發(fā)育成熟，類胡蘿卜素的含量逐漸升高，番茄紅素和β-胡蘿卜素在汁胞和囊衣中隨著果實(shí)的發(fā)育而累積，玉米黃素只在成熟階段的果實(shí)中檢測(cè)到，且含量顯著低于番茄紅素和β-胡蘿卜素。研究結(jié)果為‘迷你紅柚果實(shí)品質(zhì)評(píng)價(jià)和開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：柚;番茄紅素;β-胡蘿卜素;玉米黃素

色澤是果實(shí)感官品質(zhì)的重要指標(biāo)，對(duì)果實(shí)及其后續(xù)生產(chǎn)加工具有重要的影響，色素的積累是果實(shí)色澤形成的基礎(chǔ)，色素的種類、含量決定了果實(shí)的色質(zhì)和呈色深度[1]。類胡蘿卜素在園藝產(chǎn)品中分布廣泛，吸光能力強(qiáng)，在400～500?nm內(nèi)具強(qiáng)吸收，能呈現(xiàn)出紅色、橙色以及黃色[2]。類胡蘿卜素由于具有多個(gè)共軛雙鍵，具有抗氧化、預(yù)防慢性疾病、抗癌和增強(qiáng)抵抗力等功效，對(duì)人體具有一定的保健功能。

類胡蘿卜素具有親脂性，不同結(jié)構(gòu)的類胡蘿卜素所用的提取溶劑差異較大[3]，傳統(tǒng)的提取方法常用組合溶劑提高提取效率[4]。目前，酶輔助提取[5]、微波輔助提取[6]、超聲波輔助提取[7]和超臨界流體萃取[8]等提取技術(shù)也被廣泛應(yīng)用。類胡蘿卜素的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法（high performance liquid chromatography， HPLC）[9]、超高效液相色譜法（ultra performance liquid chromatography， UPLC）[10]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatograph-mass spectrometer /mass spectrometer，LC-MS /MS）[11]，其中，UPLC是最常用的方法，具有價(jià)廉、易操作和穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，是分析果實(shí)類胡蘿卜素的有效工具。

柚[Citrus maxima （Burm.） Merr.]含有豐富的類胡蘿卜素。研究發(fā)現(xiàn)，成熟時(shí)期的紅色蜜柚果實(shí)中含有豐富的類胡蘿卜素，紅肉的‘琯溪蜜柚突變體以番茄紅素為主要呈色色素，‘三元紅心柚的海綿層和果肉的紅色也是因積累番茄紅素而著色[12]，‘紅綿蜜柚和‘三紅蜜柚的外果皮、海綿層、囊衣等組織因含有番茄紅素與β-胡蘿卜素而顯紅色，且不同類型的蜜柚類胡蘿卜素的含量存在明顯差異[13]。類胡蘿卜素在果實(shí)發(fā)育過程中的積累呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化，種類和含量差異很大[14-15]。對(duì)‘紅肉蜜柚等紅肉品種的蜜柚果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期類胡蘿卜素的積累過程研究發(fā)現(xiàn)，外果皮類胡蘿卜素的積累機(jī)制與海綿層、囊衣和汁胞不同[13]，類胡蘿卜素合成途徑基因的表達(dá)量在各組織中存在差異[16]，但柚果實(shí)中類胡蘿卜素的積累機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

‘迷你紅柚是一個(gè)疑似從‘琯溪蜜柚芽變產(chǎn)生的新種質(zhì)[17]，其果形較小，具有海綿層薄、無籽、不?；葍?yōu)點(diǎn)，與‘琯溪蜜柚相比，其果肉呈紅色，外果皮和海綿層呈淡紅色，但其主要色素組分尚不明確。為確定‘迷你紅柚果實(shí)所含類胡蘿卜素主要組分和含量及其在不同組織和不同發(fā)育時(shí)期的積累規(guī)律，本研究采用UPLC技術(shù)檢測(cè)了‘迷你紅柚汁胞、囊衣、海綿層類胡蘿卜素的成分與含量，探究其顯色規(guī)律和累積變化，為‘迷你紅柚的果實(shí)品質(zhì)評(píng)價(jià)和開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?材料與試劑 ?‘迷你紅柚果實(shí)采自福建省平和縣，從花后150?d開始取樣，此后每隔30?d取樣1次，直至果實(shí)完全成熟，共取樣5次。每次取樣選擇大小、成熟度相近的果實(shí)，3個(gè)果實(shí)為1個(gè)重復(fù)，每組樣品3個(gè)重復(fù)。采收后立即取出海綿、囊衣、汁胞，用錫箔紙包裝后，液氮速凍，置于–80?℃冰箱中保存。

番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品、β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品、玉米黃素標(biāo)準(zhǔn)品以及丁羥甲苯（BHT），美國(guó)Sigma公司;四氫呋喃（色譜純），購(gòu)自上海Macklin公司;甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純），購(gòu)自德國(guó)Merck公司;石油醚、丙酮、正乙烷、甲醇、無水乙醇、二氯甲烷等均為分析純，購(gòu)自上海滬式實(shí)驗(yàn)室器材股份有限公司;超純水為自制。

1.1.2 ?儀器與設(shè)備 ?主要儀器設(shè)備包括ACQUITY UPLC?（美國(guó) WATERS 公司）超高效液相色譜儀，配有自動(dòng)進(jìn)樣器、四元溶劑管理器、C18色譜柱（ACQUITY-X Bridge BEH，2.1?mm× 100?mm，1.7 ?m），ACQ-TUV紫外檢測(cè)器（ACQUITY UPLC H-Class系統(tǒng)）、和WATERS? EMPOVER 3分析軟件;Allegra 64R高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Backman公司）;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本Eyela公司）等。

1.2 ?方法

1.2.1 ?類胡蘿卜素的提取 ?參照龔江美[18]的方法提取類胡蘿卜素。將樣品在液氮下迅速研磨成粉末，轉(zhuǎn)移入50 mL離心管中，加入10 mL預(yù)冷提取劑;恒溫水浴鍋40?℃下振蕩浸提30 min;4?℃下12000 r/min離心15 min;取上清液于50 mL離心管;重復(fù)3次，合并上層有機(jī)相，得到樣液。將樣液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用雙蒸水洗滌3～4次至中性、潔凈無渣，加入少量無水硫酸鈉脫水;轉(zhuǎn)移至蒸餾燒瓶，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中200 MPa、35?℃條件下蒸干;加入2 mL二氯甲烷充分溶解，轉(zhuǎn)移至2 mL離心管中，低溫避光保存。所有樣品進(jìn)樣前經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾。

提取劑采用以下5種：石油醚-丙酮（1∶1）、石油醚-丙酮（2∶1）、正乙烷-丙酮（2∶1）、正乙烷-甲醇-丙酮（2∶1∶1）、正乙烷-無水乙醇-丙酮（2∶1∶1）。

1.2.2 ?色譜條件 ?流速0.3 mL/min;進(jìn)樣量10?μL;柱溫40?℃;樣品溫度20?℃;檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm;流動(dòng)相為乙腈-甲醇-四氫呋喃（90∶5∶5），等度洗脫。

1.2.3 ?標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 ?精密稱取番茄紅素、β-胡蘿卜素、玉米黃素標(biāo)準(zhǔn)品各1.0 mg，溶于二氯甲烷中，定容為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)母液。 逐級(jí)稀釋，制成0.77、1.53、3.06、6.12、12.5、25、50、100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣經(jīng)UPLC測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo)（y），濃度為橫坐標(biāo)（x），制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 ?精密度、重復(fù)性和回收率試驗(yàn) ?取番茄紅素、β-胡蘿卜素、玉米黃素標(biāo)準(zhǔn)品母液，重復(fù)進(jìn)樣10次，分別記錄保留時(shí)間和峰面積，計(jì)算出平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)，評(píng)價(jià)儀器的精密度和方法的重復(fù)性。取‘迷你紅柚樣液3份，測(cè)定其色素含量;參考陳銀花等[19]的方法，分別加入70 μg番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品、70 μg β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品、80 μg玉米黃素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率，平行測(cè)定3次。

1.2.5 ?樣品類胡蘿卜素的測(cè)定 ?利用ACQUITY UPLC?超高效液相色譜儀，按上述篩選后的方法進(jìn)行上樣測(cè)定，記錄色譜圖峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出類胡蘿卜素含量。計(jì)算公式如下：

類胡蘿卜素物質(zhì)含量（mg/g）=（C×V）/M

其中，C為標(biāo)準(zhǔn)曲線算得的樣品濃度（mg/mL）;V為樣品定容體積（mL）;M為樣品稱樣量（g）。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，采用S-N-K法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?不同提取劑對(duì)‘迷你紅柚果實(shí)類胡蘿卜素的提取差異

比較5種提取劑對(duì)‘迷你紅柚果實(shí)（花后180?d）中類胡蘿卜素的提取效果，結(jié)果如圖1、圖2所示。正乙烷-無水乙醇-丙酮（2∶1∶1）的提取效果最佳，在相同的色譜條件下，各相鄰色譜峰分離較好，所提取得到的類胡蘿卜素（420??g/g）顯著高于其他提取劑，其次為正乙烷-甲醇-丙酮（2∶1∶1）（350 ?g/g），石油醚-丙酮（1∶1，2∶1）和正乙烷-丙酮（2∶1）的提取效果較差，本研究選擇正乙烷-無水乙醇-丙酮（2∶1∶1）作為柚果實(shí)類胡蘿卜素的提取劑。

2.2 ?標(biāo)準(zhǔn)曲線、重復(fù)性、精密度和回收率分析

番茄紅素、β-胡蘿卜素與玉米黃素的線性相關(guān)系數(shù)依次為0.9985、0.9990、0.9987，線性回歸方程分別為：y=22693x–27915，y=24512x–29459，y=29837x–34619。由表1可知，番茄紅素、β-胡蘿卜素、玉米黃素標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間的變異系數(shù)分別為0.25%、0.30%、0.21%，重復(fù)性良好。峰面積的變異系數(shù)分別為0.69%、1.00%、0.41%，儀器精密度良好。本研究建立的UPLC測(cè)定方法較為準(zhǔn)確，可用于檢測(cè)果實(shí)類胡蘿卜素含量。

將檢測(cè)總量減去樣液原測(cè)出量，再除以加標(biāo)量，得到回收率，結(jié)果如表1所示，3種類胡蘿卜素的平均回收率分別為98.6%、102.3%、99.1%，說明該本測(cè)定方法準(zhǔn)確度較高。

2.3 ?成熟果實(shí)中的類胡蘿卜素組分及含量分析

‘迷你紅柚的成熟果實(shí)如圖3所示，汁胞紅色，囊衣粉紅色，海綿層淡粉色。UPLC的測(cè)定結(jié)果表明，果實(shí)中含有番茄紅素、β-胡蘿卜素和與米黃素。在成熟果實(shí)不同組織中，類胡蘿卜素含量差異顯著（表2）。汁胞中的類胡蘿卜素含量最高，達(dá)461.10 μg/g，顯著高于囊衣中所含的122.81?μg/g，海綿層中所含的類胡蘿卜素最少，僅有51.49?μg/g。汁胞中番茄紅素含量為387.65?μg/g，占汁胞中所含類胡蘿卜素的84.07%，是主要的成色色素，β-胡蘿卜素含量為66.79 μg/g，占14.48%，玉米黃素含量6.66 μg/g;在囊衣中，含量最高的亦是番茄紅素，占囊衣中類胡蘿卜素含量的61.34%，β-胡蘿卜素占33.12%，玉米黃素占5.53%;海綿層中主要含有番茄紅素和β-胡蘿卜素。

2.4 ?果實(shí)發(fā)育過程中的胡蘿卜素組分與含量分析

在果實(shí)發(fā)育期間，不同類胡蘿卜素組分在果實(shí)不同組織中的積累和變化趨勢(shì)如圖4所示。結(jié)果表明，番茄紅素和β-胡蘿卜素在汁胞和囊衣中隨著果實(shí)的發(fā)育而累積，玉米黃素只在成熟階段的果實(shí)中檢測(cè)到，且含量顯著低于番茄紅素和β-胡蘿卜素。在果實(shí)發(fā)育早期，汁胞中就含有大量的番茄紅素，從花后180 d至果實(shí)成熟，番茄紅素的含量無顯著差異（P=0.67>0.05），說明汁胞中的番茄紅素主要是在果實(shí)發(fā)育的早期積累，這與觀察結(jié)果相一致，即在果實(shí)發(fā)育的早期汁胞即表現(xiàn)出紅色;而β-胡蘿卜素則隨著果實(shí)的發(fā)育而顯著增加，玉米黃素只在成熟果實(shí)中積累。囊衣中的番茄紅素含量呈先上升后下降的趨勢(shì)，β-胡蘿卜素含量在果實(shí)發(fā)育過程中呈現(xiàn)顯著上升的變化趨勢(shì)，與汁胞相同，只在成熟果實(shí)的囊衣中檢測(cè)到玉米黃素。海綿層中的番茄紅素、β-胡蘿卜素和玉米黃素的變化趨勢(shì)與囊衣的變化趨勢(shì)一致，但3種組分的含量在各個(gè)發(fā)育時(shí)期均低于囊衣和汁胞。

3 ?討論

由于類胡蘿卜素種類繁多，結(jié)構(gòu)也不盡相同，且廣泛存在于各種果蔬中，目前并無一種溶劑或混合試劑可廣泛應(yīng)用于各種材料、各種類胡蘿卜素的提取。極性大的含氧類胡蘿卜素主要使用丙酮等極性強(qiáng)的溶劑，極性小的主要使用石油醚等極性弱的溶劑[20]。孫丹等[21]在用HPLC-MS/MS法測(cè)定甜櫻桃花色苷與非花色苷酚時(shí)，用甲酸–甲醇提取花色苷，用乙酸乙酯提取非花色苷酚;趙文恩等[22]在測(cè)定蘋果果皮的類胡蘿卜素時(shí)以丙酮與石油醚為提取劑。柚果實(shí)中類胡蘿卜素的提取方法較多，針對(duì)不同類型的柚品種和組織有不同的提取試劑，邵金華等[23]用丙酮作為萃取劑提取柚皮中的類胡蘿卜素，陶俊等[24]用含有1% BHT的丙酮溶液提取柑橘果實(shí)的類胡蘿卜素，而乙醇-丙酮（1∶1）適于提取柑橘葉片中的類胡蘿卜素[25]，本試驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上，通過比較確定了正乙烷-無水乙醇-丙酮（2∶1∶1）是提取‘迷你紅柚果實(shí)類胡蘿卜素的最適宜提取劑，這與陳細(xì)羽等[10]的研究結(jié)果一致，說明‘迷你紅柚果實(shí)中的類胡蘿卜素為極性較大的含氧類胡蘿卜素。

柑橘類果實(shí)的呈色色素包括類胡蘿卜素和花青素[24]，柑橘果實(shí)中的類胡蘿卜素有115種[26]，果實(shí)中主要積累葉黃素，包括玉米黃素，β-隱黃質(zhì)等[27-28]。在目前所發(fā)現(xiàn)的柚資源中，僅有紫皮柚的果皮含有花青苷，而其他資源都是積累類胡蘿卜素而呈色[29]，紅色汁胞主要是因?yàn)楹休^高含量的番茄紅素、β-胡蘿卜素或β-隱黃質(zhì)而呈色[14]，因此本研究只檢測(cè)‘迷你紅柚果實(shí)中的番茄紅素等類胡蘿卜素組分。不同類型的柑橘果實(shí)積累的類胡蘿卜素種類不同，比如宮內(nèi)伊予柑果皮中以玉米黃素、β-隱黃質(zhì)2種色素為主，β-胡蘿卜素含量不足類胡蘿卜素的 1%，α-胡蘿卜素極低[30-31]，在柚果實(shí)中，主要是由于β-胡蘿卜素、八氫番茄紅素和番茄紅素等類胡蘿卜素的積累而使果實(shí)呈現(xiàn)紅色[32]。在‘三紅蜜柚和‘紅肉蜜柚成熟果實(shí)中含有大量的番茄紅素[13]，本研究發(fā)現(xiàn)，‘迷你紅柚汁胞中含量最高的類胡蘿卜素為番茄紅素，這與柚果實(shí)紅色芽變品種的呈色色素一致，說明番茄紅素也是‘迷你紅柚的主要呈色色素。在葡萄柚果實(shí)中，主要的色素成分為β-胡蘿卜素[33]，而寬皮柑橘果實(shí)中的主要類胡蘿卜素是β-隱黃質(zhì)，但是在‘迷你紅柚中，β-胡蘿卜素的含量低于番茄紅素，沒有檢測(cè)到β-隱黃質(zhì)，表明‘迷你紅柚果實(shí)β-胡蘿卜素的代謝途徑與葡萄柚和寬皮柑橘有較大差異。在‘紅肉蜜柚汁胞中含有葉黃素[13]，果肉呈黃色的‘黃金蜜柚汁胞中含有β-隱黃質(zhì)，但未檢測(cè)出玉米黃素[32]，葡萄柚果實(shí)中只含有約0.50 μg/g的玉米黃素[33]，本研究發(fā)現(xiàn)‘迷你紅柚中含有玉米黃素，但含量低于其他類型的類胡蘿卜素，這與前人的研究結(jié)果一致。

果實(shí)不同組織中積累的色素組分不同。果皮是類胡蘿卜素積累的主要部位，通常果皮比果肉類胡蘿卜素含量高 2.5～15倍[34]。在‘紅肉蜜柚果實(shí)中，汁胞和囊衣中的番茄紅素?zé)o顯著差異，但在‘三紅蜜柚中，囊衣中的番茄紅素含量是汁胞中的2倍左右[13]，在‘迷你紅柚中，番茄紅素只要集中在汁胞，這與形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果一致，但番茄紅素在不同組織中如何形成和運(yùn)輸還有待進(jìn)一步研究。在柚果實(shí)發(fā)育過程中，類胡蘿卜素的含量隨著果實(shí)的發(fā)育逐漸增加[13]，在本研究中也發(fā)現(xiàn)，汁胞、囊衣中的類胡蘿卜素含量隨著果實(shí)的發(fā)育逐漸增加，但玉米黃素只在成熟果實(shí)中出現(xiàn)。在類胡蘿卜素的代謝途徑中，番茄紅素是第一個(gè)合成的有色類胡蘿卜素物質(zhì)，番茄紅素在β-環(huán)化酶的催化下進(jìn)一步生成β-胡蘿卜素，然后在羥化酶的作用下生成玉米黃素[35-36]，在‘迷你紅柚的成熟果實(shí)中，可能存在著類似的類胡蘿卜素合成途徑，導(dǎo)致有部分玉米黃素生成，且是在囊衣中首先出現(xiàn)，推測(cè)玉米黃素的合成首先在囊衣中進(jìn)行，但累積的色素是在果實(shí)內(nèi)部合成或是果實(shí)外部合成后轉(zhuǎn)運(yùn)至果實(shí)中，還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，‘迷你紅柚果實(shí)所含類胡蘿卜素類組分和積累規(guī)律與‘紅肉蜜柚等柚果實(shí)相似，類胡蘿卜素的合成和積累受特定的細(xì)胞器官、發(fā)育時(shí)期等因素共同調(diào)控。本研究明確了‘迷你紅柚果實(shí)的色素組分，對(duì)柚類果實(shí)的類胡蘿卜素代謝機(jī)制研究具有重要意義，也為其果實(shí)品質(zhì)的評(píng)價(jià)提供了理論依據(jù)，有助于該品種的推廣應(yīng)用。

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