羅琳 黃學敏 陳曉悅 李龍 邢玥 林作棟 景詩夢 劉舒雅 彭東輝

摘 ?要：真菌誘導子可在一定程度上提高植物次生代謝物的積累，而白芨是一種具有極高經(jīng)濟價值和藥用價值的藥材。本文從野生寒蘭的根中培養(yǎng)分離得到23種內(nèi)生真菌，再制成真菌誘導子添加到自制的液體培養(yǎng)基中，將白芨種子放入該液體培養(yǎng)基進行無菌震蕩培養(yǎng)，以研究真菌誘導子對白芨種子萌發(fā)和幼苗生長的影響。結(jié)果表明，15號真菌誘導子能顯著縮短白芨種子的萌發(fā)時間，而且其幼苗鮮重增長量是對照組的5.4倍，株高是對照組的3.7倍。經(jīng)過鑒定，15號真菌屬于多孔菌科（Polyporaceae）栓菌屬（Trametes）的毛栓菌（Trametes hirsuta）。

關(guān)鍵詞：內(nèi)生真菌;毛栓菌;白芨;種子萌發(fā);幼苗生長

Abstract： Fungal elicitor can increase the accumulation of secondary metabolites in plants to a certain extent， and Bletilla striata is a medicinal material with extremely high economic and medicinal value. In this paper， 23 species of endophytic fungi were isolated from the roots of Cymbidium kanran. They were made into fungal elicitors and added to the self-made liquid medium. The seeds of B. striata were put into the liquid medium for aseptic shaking culture to study the effects of elicitors on seed germination and seedling growth of B striata. The results showed that the fungal elicitor of No. 15 significantly shortened the germination time of the seed of B. striata， and the fresh weight growth of its seedlings was 5.4 times that of the control group， and the plant height was 3.7 times that of the control group. No. 15 fungus was identified as Trametes hirsuta.

Keywords： endophytic fungus; Trametes hirsuta; Bletilla striata; seed germination; plant growth

內(nèi)生真菌存在于植物體內(nèi)但不引起植物組織病變，能與植物互利共生[1]。同時，內(nèi)生真菌能幫助植物適應(yīng)極端環(huán)境，抵御干旱或者重金屬污染的非生物脅迫，例如在干旱環(huán)境時幫助植物吸收土壤水分和養(yǎng)分，增強其抗逆性等等生理功能[2-3]。然而與植物進行共培養(yǎng)時，生活的內(nèi)生真菌會與植物爭奪養(yǎng)分及次生代謝產(chǎn)物，造成植株幼苗被吞噬，引起植物的萎蔫、畸形和黃化，最終導致植物死亡[4]。研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生誘導植物細胞合成次生代謝產(chǎn)物的一類物質(zhì)，即真菌誘導子，真菌誘導子能夠啟動信號轉(zhuǎn)導途徑，激活基因轉(zhuǎn)錄及表達，一定程度提高了關(guān)鍵酶活性，從而促進某些次生代謝物的生物合成，增強植株自身抗性，這也是提高植物次生代謝物積累最有效的手段之一[5-6]。

白芨（Bletilla striata）作為中國傳統(tǒng)中藥被廣泛使用，一直被用來治療消化道粘膜損傷、潰瘍、瘀傷和燒傷[7]。前人在關(guān)于白芨的植物化學研究中，發(fā)現(xiàn)了多種次生代謝產(chǎn)物，如雙芐基、黃酮類化合物、酚類化合物等，這些提取物或分離物具有抗菌、抗氧化、抗炎和抗癌活性[8-9]。盧莉[10]篩選出一種內(nèi)生真菌并制成真菌誘導子，發(fā)現(xiàn)其對鐵皮石斛生長發(fā)育有顯著促進作用。陳金花等[11]篩選制成的真菌誘導子對石斛的鮮重增長量是對照的4倍以上。張晉彥[12]從野生國蘭根部分離出的被孢霉屬（Mortierella sp）真菌對春蘭品種‘宋梅組培苗進行接種，發(fā)現(xiàn)其鮮重增長率、新生葉片數(shù)、株高增長量與幼苗根長度與對照組存在顯著性差異。李尚真[13]從文心蘭的原球莖中分離得到膠膜菌科（Tulasnellaceae）1種真菌和杜鵑花類菌根真菌（Epacris pulchella root associated fungus），發(fā)現(xiàn)其對文心蘭原球莖生長和根系具有顯著促進作用。此外，真菌誘導子對龍眼[14]、懷地黃[15]、苦豆子[5， 16]、西蘭花[17]、白樺[18]等植物生長發(fā)育都有顯著促進效果。對于蘭科菌根真菌的分離，并在人工基質(zhì)上實現(xiàn)提純培養(yǎng)，為未來菌劑的大規(guī)模生產(chǎn)創(chuàng)造優(yōu)勢條件，更容易實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)[19]。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?試驗材料 ?植物材料：于2018年9月14日從福建三明地區(qū)采集野生寒蘭（Cymbidium kanran）的根，低溫保存。于2019年5月27日從云南采集白芨（Bletilla striata）成熟蒴果，低溫保存。

1.1.2 ?培養(yǎng)基 ?PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，1000?mL純水，葡萄糖20 g，瓊脂15 g;PDB培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，1000 mL純水，葡萄糖20 g;基礎(chǔ)培養(yǎng)基：1/2 MS+NAA 1.0 mg/L+6 BA 3.0?mg/L+AC 0.5 g/L+葡萄糖30 g/L+50 mL/L椰汁，pH 5.83（參照杜高峰[20]的配方并進行優(yōu)化）。

1.2 ?方法

1.2.1 ?真菌的分離和純化 ?將寒蘭的根切成約4～5 cm長（除去根尖），清水沖洗2 h，然后用75.0?%的乙醇處理30 s，再用0.2%的次氯酸鈉消毒3?min，最后用無菌水沖洗4～5遍。用無菌濾紙將根表水分吸干，在無菌培養(yǎng)皿中將根橫切厚為3～5?mm的組織塊，置于PDA培養(yǎng)基（加入氨芐青霉素）中，切面朝向培養(yǎng)基，每個培養(yǎng)皿放3塊組織塊，置于培養(yǎng)箱內(nèi)25?℃恒溫避光培養(yǎng)。經(jīng)過3～7 d菌絲從組織塊上長出形成一定大小菌落時（以組織塊為中心向周圍進行擴散生長的為分離目的菌種），從邊緣挑取菌絲到另一PDA平板，分離出不同種類的真菌轉(zhuǎn)接重復(fù)至純培養(yǎng)，斜面保存。

1.2.2 ?真菌的活化及培養(yǎng)基的制備 ?在預(yù)實驗中發(fā)現(xiàn)，真菌會將種子吞沒作為養(yǎng)分，因此以真菌誘導子的形式進行實驗。

將之前保存的真菌接入PDA培養(yǎng)基，在25?℃黑暗環(huán)境下活化。之后分別挑取部分菌絲接種到PDB培養(yǎng)基中，在25?℃、150 r/min搖床振蕩培養(yǎng)4 d，待菌絲體充滿整個培養(yǎng)基，將發(fā)酵液真空抽濾得到發(fā)酵液，121?℃高壓蒸汽滅活后，制成真菌誘導子分裝備用。

配好基礎(chǔ)培養(yǎng)基后分裝至錐形瓶，每瓶裝20?mL培養(yǎng)基，每種真菌誘導子添加20 μL，重復(fù)3瓶，對照處理不加真菌誘導子。

1.2.3 ?白芨種子處理、誘導和培養(yǎng) ?將未開裂的白芨蒴果先用洗衣粉在流水下緩慢沖洗30 min，依次用75.0 %的酒精浸泡消毒30 s、0.2 %的次氯酸鈉消毒20 min后，再用75.0%酒精浸泡30 s，最后用無菌水沖洗表面，再用滅過菌的濾紙吸干蒴果表面水分。以下操作均在無菌條件下進行，將蒴果放至無菌的接種鐵盤，用高壓滅菌后的手術(shù)刀沿著蒴果背縫線橫切，切開后用無菌鑷子夾取適量的種子抖落在液體培養(yǎng)基上，稍加搖動，使種子均勻散布在培養(yǎng)基上，用透氣封口膜封口，置于搖床（25?℃，150 r/min）進行暗培養(yǎng)。每日檢查種子萌發(fā)情況，20 d后記錄種子萌發(fā)率[萌發(fā)率=（萌發(fā)白芨種子總數(shù)/供試白芨種子總數(shù)）× 100%]，待種子萌發(fā)后轉(zhuǎn)至光照下培養(yǎng)。

1.2.4 ?白芨幼苗測量 ?種子接種52 d后，用200目透明紗布過濾液體培養(yǎng)基，小心洗凈幼苗表面液體培養(yǎng)基，然后用無菌濾紙吸干水分，測量幼苗的鮮重、株高和莖粗以及原球莖直徑，從中篩選出促進白芨種子萌發(fā)及幼苗生長效果好的真菌誘導子。

1.2.5 ?真菌的鑒定 ?內(nèi)生真菌分子鑒定采用天根生物公司DNA提取試劑盒對分離出來的內(nèi)生真菌進行DNA提取，對ITS DNA區(qū)域序列進行PCR擴增。PCR擴增反應(yīng)體系（20 μL）：1 μL目標真菌模板DNA，ITS1和ITS4引物（10 μmol/L）各1 μL，2×Taq PCR Master Mix 7 μL，ddH2O補至20 μL。PCR特異擴增采用 r DNA-ITS區(qū)段的通用反應(yīng)引物[21]：正向引物ITS1F：5-TCCGTAGGT GAACCTGCGG-3和反向引物ITS4R：5-TCCTC CGCTTATTGATATGC-3。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳合格后，將PCR原液送往廈門生工生物公司進行后續(xù)測序工作。用snapgene軟件去除疊峰等不合格的序列，進行序列拼接，登陸NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih. gov/）將整理好的各菌株ITS序列與GenBank中的已知序列進行比對，并利用軟件MEGA 7.0中的最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，同時進行形態(tài)鑒定，用0.05%臺盼藍溶液（0.2%臺盼藍∶85%乳酸∶甘油=1∶1∶1）對真菌進行染色[22]，確定菌株的具體信息。

1.3 ??數(shù)據(jù)處理

運用Microsoft Excel 2016和IBM SPSS Statistics 24軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析，單因素方差分析（One-Way ANOVA）和LSD多重比較，以及R軟件ggplot 2包進行圖片繪制，分別判斷差異顯著性。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?寒蘭根內(nèi)生真菌分離情況

采用組織塊分離法從新鮮且健康的寒蘭根中分離出23個菌株，不同菌落形態(tài)見圖1和表1。

2.2 ?真菌誘導子對白芨種子萌發(fā)的影響

23種真菌誘導子對白芨種子啟動萌發(fā)時間的影響不同。以種子膨大作為啟動萌發(fā)標準，其中15號真菌誘導子處理的種子最早啟動萌發(fā)，所需時間為8 d，而4、6、7、16、19和22號為11 d，3、5、9、10、12和14號為12 d，對照（0號）、1、8、11、13、18、20和21號為13 d，2號和23號為14 d。

由表2可知，不同真菌誘導子對白芨種子萌發(fā)表現(xiàn)出明顯差異，3、13、23號均對白芨種子萌發(fā)率無顯著影響，1、4、6、7、8、10、12、14、15、16、17、19、20、21、22號呈促進作用，2、5、9、11號對萌發(fā)率呈抑制作用。

2.3 ?真菌誘導子對白芨幼苗生長的影響

白芨種子在添加23種真菌誘導子的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)52 d后進行對比分析，鮮重、株高、莖粗組間差異明顯（圖3）。

（1）鮮重：各處理組的白芨鮮重增重量不同，除1、4、11和12號與對照組相比差異性不顯著外，其余各處理組鮮重均高于對照組，且差異顯著（P <0 .05）。其中15號處理組是對照組的6.4倍。

（2）株高：各處理組的白芨株高變化較大。5、6、10、15、19和23號與對照組相比株高變大。其中，15號處理組株高是對照組的2.7倍（P<0.01），但也存在株高比對照組低的情況，10號處理組株高只達到對照組的87.0%。

（3）原球莖：共計11組原球莖直徑的均值超過對照組，其中5號比對照組高31.5%，為2.46 mm，差異極顯著（P < 0.01）。但其他處理組與對照組相比，差異不顯著（P > 0.05）

（4）莖粗：15號達到差異極顯著（P<0.01），比對照組粗0.23 mm，為1.39 mm。1、2、3、11和22號的莖粗數(shù)值都比對照組低，只達到對照組莖粗的77.4%、61.9%、92.9%、62.3%和97.0%。

2.4 ?菌種鑒定

經(jīng)過對比，15號真菌具有顯著促生效果（圖4）。因此對15號真菌進行菌種鑒定，利用BLAST-2.9.0及MEGA 7.0進行比對分析，以最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5）。結(jié)果表明，菌株15號與多孔菌科（Polyporaceae）栓菌屬（Trametes）的毛栓菌（T. hirsuta）同源性最高，相似性達到100%，并且遺傳距離最近，相似率達到98.0%。將此序列上傳至Genbank （https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/），獲得登錄號MT079831。

結(jié)合形態(tài)觀察，其菌落為白色、絨毛狀，顯微結(jié)構(gòu)具有鎖狀聯(lián)合（圖6），可將該菌株鑒定其為毛栓菌。

3 ?討論

在真菌誘導子篩選方法上，本實驗結(jié)合杜高峰、劉生財?shù)萚20-25]的相關(guān)研究，采用直接添加滅活后的菌絲體粗提濾液的制備方法，與Famer[26]和文濤等[27]的方法相比更加簡單且容易實現(xiàn)，可進行大范圍推廣，為其他地生蘭的相關(guān)研究提供借鑒。

觀察23種真菌誘導子對白芨幼苗促生情況，15號真菌誘導子最有助于白芨的生長發(fā)育。2號、11號真菌誘導子對白芨幼苗的生長效果遠低于對照組，對白芨的莖粗、原球莖均起抑制影響。說明真菌誘導子對植物不一定都是促進作用，也存在一定的抑制作用。類似的，高媛等[28]也觀察到這一現(xiàn)象，內(nèi)生真菌的菌液濃縮物對苦豆子組培苗及愈傷組織的生長起抑制影響，說明真菌誘導子中對植株生長發(fā)育存在一定的活性抑制。

綜合生理結(jié)果，15號真菌促生作用最顯著，因此對其進行分子生物學鑒定，該真菌屬于多孔菌科（Polyporaceae）栓菌屬（Trametes）的毛栓菌（T. hirsuta），首次從蘭屬根部分離得到。前人研究顯示，可培養(yǎng)的蘭花內(nèi)生真菌多屬于角擔菌科（Ceratobasidiaceae）、膠膜菌科（Tulasnellaceae）、蠟殼耳目（Sebacinales）[29]。在培養(yǎng)基共生狀態(tài)下，可能由于該真菌能分解纖維素，供應(yīng)更多的碳水化合物也能使原球莖生長加快。田佩雯[30]篩選出菌株1-N2真菌誘導子，處理后的白芨鮮重增長量、鱗莖總酚、總多糖含量都有顯著提高，可有效促進白芨新芽和根系生長，但是并未闡明具體菌株鑒定方法及菌種名稱，本研究不僅篩選出真菌菌株并且進行了菌種鑒定。根據(jù)高中南等[31]、徐玲玲等[32]的研究結(jié)果，活菌能夠促進蘭科種子萌發(fā)，但在本實驗中活菌將種子吞沒當作養(yǎng)分，因此采用真菌誘導子的方法進行萌發(fā)實驗。內(nèi)生真菌誘導子的主要成分有低聚糖、糖蛋白、蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸等[33]。為進一步研究該內(nèi)生真菌誘導子的作用，可深入研究15號內(nèi)生真菌誘導子毛栓菌（T. hirsuta）的代謝產(chǎn)物，該代謝產(chǎn)物有可能為白芨種子萌發(fā)創(chuàng)造有利條件，這種萌發(fā)機制有待進一步研究。毛栓菌制作成真菌誘導子對白芨生長具有促進作用，王洪亮[34]也發(fā)現(xiàn)該真菌的代謝產(chǎn)物在抗癌、抗瘧疾等疾病藥物的開發(fā)中有巨大潛力。

4 ?結(jié)論

本研究從寒蘭根部分離出23個內(nèi)生真菌菌株，制作成真菌誘導子，對白芨種子及其幼苗進行促生生長試驗，結(jié)果表明，15號真菌誘導子有顯著性促生作用，經(jīng)鑒定為多孔菌科栓菌屬毛栓菌。該菌種可能對蘭屬植物有一定促生作用。

關(guān)于真菌誘導子的有效成分仍須進一步研究，對其有效成分進行分析，或在其中添加輔助成分有可能提高該誘導子的誘導效果。

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