于昕宇，胡 陽(yáng)，樊佳鵬，鄧小麗，王春仁，常巧呈

黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江大慶 163000

伯氏疏螺旋體隸屬于螺旋體目，螺旋體科，疏螺旋體屬，病原通常呈單細(xì)胞疏松盤(pán)繞的左旋螺旋結(jié)構(gòu)，是一類(lèi)可寄生于哺乳動(dòng)物各器官組織內(nèi)的革蘭氏陰性菌。其宿主動(dòng)物主要分兩大類(lèi)：一類(lèi)為小型的禽類(lèi)、獸類(lèi)及嚙齒類(lèi)動(dòng)物，最為常見(jiàn)的是各種鼠類(lèi)、兔子以及鳥(niǎo)類(lèi)，是幼蜱和若蜱的供血宿主和病原儲(chǔ)存宿主；另一類(lèi)為大型的鹿科動(dòng)物及家畜，常見(jiàn)的有鹿、馬、牛、羊、犬等，是成蜱的主要供血宿主。伯氏疏螺旋體引起的疾病為“萊姆病”，該病在世界各地流行，在我國(guó)主要分布東北地區(qū)，給人類(lèi)健康和畜牧業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失十分巨大。本實(shí)驗(yàn)對(duì)牡丹江海林市野生鹿血攜帶伯氏疏螺旋體病原的情況進(jìn)行分子流行病學(xué)調(diào)查，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2019年6月間，從我國(guó)牡丹江地區(qū)海林市采集20份野生鹿的血液樣本，所有樣本均為靜脈采血，分別收集到含有抗凝劑管中并標(biāo)記，置-20℃冰箱保存。

1.2 主要試劑

血液DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；DL-2 000 Marker、2×Tamaster Mix均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

1.3 dNA提取

將采集到的血液，按照血液DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取DNA，并置-20℃冰箱保存，備用。

1.4 伯氏疏螺旋體基因序列的擴(kuò)增

參考相關(guān)文獻(xiàn)中的引物序列擴(kuò)增鹿血液樣本中的伯氏疏螺旋體5S-23SrDNA基因片段[1]。擴(kuò)增目的片段的引物序列為：上游引物 5'-CGACCTTCTTCGCCTTAAAGC-3'和下游引物5'- TAAGCTGACTAATACTAATTACCC -3’。PCR擴(kuò)增體系（總體積25 μL）：2xTap Master Mix(Dye Plus) 12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，模板DNA1μL，dd H2O 10.5μL。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，62℃退火1 min（每循環(huán)下降0.5℃），72℃延伸1 min，共38個(gè)循環(huán)；72℃再延伸7min。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.5 伯氏疏螺旋體測(cè)序及進(jìn)化分析

將檢測(cè)出陽(yáng)性的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送往吉林庫(kù)美生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序成功的序列經(jīng)拼接后，使用CLC軟件對(duì)所得完整序列進(jìn)行分類(lèi)。隨后通過(guò)NCBI上的BLAST程序檢索參照序列,應(yīng)用MEGA6與相關(guān)病原進(jìn)行進(jìn)化性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 伯氏疏螺旋體5S-23SrDNA序列擴(kuò)增

瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示5S-23SrDNA部分序列大小為412 bp左右（圖1），與預(yù)期結(jié)果相符。

2.2 伯氏疏螺旋體5S-23SrDNA序列的進(jìn)化及分析

本實(shí)驗(yàn)所獲得的伯氏疏螺旋體測(cè)序結(jié)果比對(duì)分析可分為2個(gè)類(lèi)型，分別是B.afzelii和B.garinii，其中B.afzelii型與德國(guó)分離得到的B.afzelii型CP018262.1在同一進(jìn)化分支上，B.garinii型與法國(guó)分離到的B.garinii型 CP028861.1在同一進(jìn)化分支上（見(jiàn)圖2）。

圖2 伯氏疏螺旋體陽(yáng)性測(cè)定結(jié)果構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)

3 討論

研究表明通過(guò)擴(kuò)增伯氏疏螺旋體的核糖體5 S-23S基因之間的可變區(qū)，可以檢測(cè)并鑒定出目前已發(fā)現(xiàn)的幾乎所有伯氏疏螺旋體基因型。故本研究采用擴(kuò)增伯氏疏螺旋體的5S-23SrDNA基因片段進(jìn)行伯氏疏螺旋體的檢測(cè)，結(jié)果顯示在20份野生鹿血樣本中，7份檢出為伯氏疏螺旋體DNA片段，陽(yáng)性率為35%。該檢測(cè)結(jié)果提示牡丹江海林市地區(qū)存在較高的伯氏疏螺旋體的自然感染，為蜱傳病原相關(guān)疾病的潛在疫原地，可能會(huì)對(duì)人群和家畜的健康產(chǎn)生潛在危害。

源性分析發(fā)現(xiàn)，6條陽(yáng)性序列與法國(guó)分離到的B.garinii型CP028861.1在同一進(jìn)化分支上，有1條與德國(guó)分離得到的B.afzelii型CP018262.1在同一進(jìn)化分支上。由伯氏疏螺旋體引起的萊姆病于1975年在美國(guó)被首次描述和發(fā)現(xiàn)，伯氏疏螺旋體在我國(guó)主要分布在東北、華北和西北的林區(qū)，發(fā)病率高，臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，該病原是一種嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康和畜牧業(yè)發(fā)展的蜱傳疾病[2]。在全球范圍內(nèi)伯氏疏螺旋體至少有23個(gè)基因型[3]。在這些基因中已有研究發(fā)現(xiàn)至少有8種對(duì)人類(lèi)有致病型[4]，其中包括本研究中發(fā)現(xiàn)的B.garinii和B. afzelii，與在牡丹江地區(qū)的景區(qū)檢測(cè)到的基因型一致。而在被調(diào)查過(guò)的其他省份的景區(qū)中均未檢測(cè)到伯氏疏螺旋體[5]。這也更加充分的表明了牡丹江地區(qū)是伯氏疏螺旋體重要的自然疫原地。

本次調(diào)查是首次在該地野生區(qū)動(dòng)物鹿的血液中檢測(cè)到伯氏疏螺旋體，該地區(qū)萊姆病的防控具有重要意義。