張 亮，金紅梅

吉林省龍井市智新鎮(zhèn)綜合服務(wù)中心，吉林龍井 133400

黑熊是大型獸類，在我國有較大地區(qū)分布，在延邊地區(qū)是一項(xiàng)傳統(tǒng)的特種養(yǎng)殖項(xiàng)目。熊膽是東北的一種特產(chǎn)，有較高的商業(yè)價(jià)值，市場(chǎng)上有很多戒酒保肝產(chǎn)品都采自黑熊膽。

本實(shí)驗(yàn)正是從熊血液分離血清中得到的一些抗氧化指標(biāo)來進(jìn)行采膽熊組和原熊組之間的對(duì)比，分析和研究血清中膽紅素含量、超氧化物歧化酶活力等指標(biāo)對(duì)黑熊養(yǎng)殖的影響和意義。

1 材料

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

黑熊（延吉市白頭山熊場(chǎng)）未經(jīng)采膽手術(shù)的原熊，飼料中添加黃芪等中藥的采膽熊，未經(jīng)飼喂藥物的對(duì)照采膽熊。

1.2 受試物及試劑

黑熊血清（延吉市白頭山熊場(chǎng)），丙二醛、堿性磷酸酶等生理生化指標(biāo)測(cè)定試劑盒（由南京建成生物工程研究所）。

1.3 試驗(yàn)設(shè)備

EASY pureⅡ 純水儀、722S型分光光度計(jì)，電子天平、高速臺(tái)式離心機(jī)。

2 方法

2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

24只成年黑熊，年齡相近，飼喂的飼料情況相同，健康狀態(tài)相近，按采膽狀況分為A、B、C三組，其中A組是在飼養(yǎng)食物中添加了黃芪等中草藥的采膽熊，B組是未給藥物的對(duì)照組采膽熊，C組為未經(jīng)采膽手術(shù)過的原熊。分幾天對(duì)這24只黑熊進(jìn)行麻醉后采血。對(duì)采出的血液樣品進(jìn)行離心處理（2 500轉(zhuǎn)/min），分離出血清。對(duì)得到的每個(gè)血清樣本進(jìn)行各項(xiàng)生理生化指標(biāo)的測(cè)定，并對(duì)A,B,C三組的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行對(duì)比研究。

2.2 丙二醛（MDA）的測(cè)定

過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的丙二醛（MDA）可與硫代巴比妥酸（TBA）縮合，形成紅色產(chǎn)物，在532 nm處有最大吸收峰（因底物為硫代巴比妥酸，所以此法稱TBA法）。實(shí)驗(yàn)時(shí)設(shè)定四組測(cè)試管，分別為標(biāo)準(zhǔn)管、標(biāo)準(zhǔn)空白管、測(cè)定管、測(cè)定空白管。其中標(biāo)準(zhǔn)管中加入10 nmol/mL標(biāo)準(zhǔn)品0.06mL，測(cè)定管混合試劑2.4mL。標(biāo)準(zhǔn)空白管中加入0.06mL無水乙醇，測(cè)定管混合試劑2.4mL。測(cè)定管中加入0.06mL測(cè)試樣品，2.4mL測(cè)定管混合試劑。測(cè)定空白管中加0.06mL測(cè)試樣品，2.4mL對(duì)照管混合試劑。之后所有試管旋渦混勻器混勻，試管口用保鮮膜扎緊，用針頭刺一小孔，95℃水浴40min，取出后流水冷卻，532 nm處，1cm光徑，蒸餾水調(diào)零，測(cè)各管吸光度值。

2.3 總膽紅素的測(cè)定

重氮法。在強(qiáng)酸性介質(zhì)中，血清中的膽紅素可與工作液（由R1對(duì)氨基苯磺酸+鹽酸+十二烷基三甲基氯化銨；R2亞硝酸鈉；膽紅素組成）混合后生成的重氮鹽反應(yīng)，形成紅紫色的偶氮化合物。

實(shí)驗(yàn)時(shí)設(shè)定三組試管，即空白管、校準(zhǔn)管、樣品管。其中空白管中加入0.05mL生理鹽水、1mL工作液，校準(zhǔn)管中加入0.05mL校準(zhǔn)品、1mL工作液，樣品管中加入0.05mL樣品、1mL工作液。混勻，在溫度37℃保溫10min，波長546 nm，比色杯光徑1cm以空白管調(diào)零，分別讀取吸光度，計(jì)算樣品濃度。

理論計(jì)算公式：總膽紅素濃度=（A樣品/A標(biāo)準(zhǔn)）×C標(biāo)準(zhǔn)，標(biāo)準(zhǔn)濃度參考值為29.8g/L。

2.4 堿性磷酸酶（AKP）的測(cè)定

對(duì)硝基苯磷酸鹽與水在堿性磷酸酶的作用下可生成對(duì)硝基苯酚和磷酸鹽。

實(shí)驗(yàn)時(shí)首先制備工作液（由R1硝基苯磷酸鹽；R2 2-氨基-2-甲基-1丙醇緩沖液和氯化鎂組成）。設(shè)定兩組試管空白管、樣品管。其中空白管中加工作液1mL、蒸餾水0.02mL，樣品管中加工作液1mL、樣品0.02mL?；旌暇鶆?，在反應(yīng)溫度25℃、30℃、37℃保溫60 s，讀取初始吸光度，確定每分鐘吸光度變化△A。

計(jì)算AKP（U/L）=(△A樣品/分-△A空白/分)×F

F=Vt/（Vs×消化系數(shù)）×1000=2757，Vt=反應(yīng)總體積，Vs=樣品體積。

3 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)用x±s表示,用軟件EXCEL進(jìn)行分析，0.01＜T＜0.05或T＜0.01表示差異顯著及極顯著。

所測(cè)定的4項(xiàng)指標(biāo)，按生理作用可分為三組進(jìn)行對(duì)比研究，其中與肝功能血液有關(guān)的生理指標(biāo)有總膽紅素（TBIL）。與抗氧化性有關(guān)的血清指標(biāo)有丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶(SOD)和堿性磷酸酶(AKP)。

3.1 A組給藥采膽熊與B組對(duì)照采膽熊的對(duì)比結(jié)果

與抗氧化性和肝功能有關(guān)的血清指標(biāo)

3.2 B組對(duì)照采膽熊與C組原熊的對(duì)比結(jié)果

與抗氧化性和肝功能有關(guān)的血清指標(biāo)

3.3 A、B、C三組的對(duì)比結(jié)果

3.3.1 丙二醛MDA的對(duì)比情況：由表1和表2對(duì)比數(shù)據(jù)顯示，可知A、B間比較差異顯著。表2中B、C間比較，數(shù)據(jù)差異性不顯著。

3.3.2 超氧化物歧化酶SOD的對(duì)比情況：由表1和表2數(shù)據(jù)顯示，A、B間有顯著差異，B、C比較則不顯著。

3.3.3 堿性磷酸酶AKP的對(duì)比情況：由表1和表2對(duì)比數(shù)據(jù)顯示，A、B比較和B、C比較都沒有顯著差異。

3.3.4 總膽紅素TBIL的對(duì)比情況：由表1和表2對(duì)比數(shù)據(jù)顯示，A、B間差異不顯著和B、C比較都沒有顯著差異。

4 討論

動(dòng)物血液生化正常參考值為生物醫(yī)學(xué)研究的重要參考指標(biāo)，是臨床醫(yī)療和科學(xué)研究的重要依據(jù)，它不僅對(duì)動(dòng)物正常生理狀態(tài)和飼養(yǎng)管理具有指導(dǎo)意義，而且是病理學(xué)、毒理學(xué)研究以及探討發(fā)病機(jī)理等研究中動(dòng)物選擇的根據(jù)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)黑熊血清中各項(xiàng)生理生化指標(biāo)的測(cè)定為臨床研究和黑熊熊膽的采集生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)研究顯示，加入黃芪等中藥制劑的采膽熊與對(duì)照組比較，加入藥物對(duì)采膽熊的肝功能指標(biāo)沒有檢查出好的促進(jìn)作用，可能是當(dāng)時(shí)的采血時(shí)藥物的功效還未表現(xiàn)出來或藥物選擇不當(dāng)。

5 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究顯示，采膽熊與原熊血液生化指標(biāo)中丙二醛、超氧化物歧化酶呈顯著差異。采膽熊飼喂過程中應(yīng)慎重添加中草藥，為今后黑熊的健康養(yǎng)殖、疾病診斷和預(yù)測(cè)積累了資料。