羅明迪，王若秋，張文駒*

（1.華中科技大學(xué)，武漢 430074；2.復(fù)旦大學(xué)/生命科學(xué)學(xué)院/生物多樣性科學(xué)研究所/生物多樣性與生態(tài)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200438）

轉(zhuǎn)基因技術(shù)（Transgenic technology）問世以來，植物基因工程發(fā)展迅猛[1-2]。隨著1996年轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化，轉(zhuǎn)基因作物種類及種植面積不斷擴(kuò)大、在全球范圍內(nèi)已超過2億hm2。轉(zhuǎn)基因作物的商業(yè)化具有巨大的經(jīng)濟(jì)效益，許多國家對轉(zhuǎn)基因技術(shù)的開發(fā)利用在逐步加大。與此同時，轉(zhuǎn)基因技術(shù)自誕生以來就受到廣泛關(guān)注，其潛在的安全問題一直以來備受爭議[3-4]，尤其是轉(zhuǎn)基因食品的安全問題不容小覷。為了保障人類健康和動植物、微生物安全，保護(hù)生態(tài)環(huán)境，有效控制轉(zhuǎn)基因食品在我國范圍內(nèi)流通，農(nóng)業(yè)部于2001年實(shí)行了《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物進(jìn)口安全評價管理辦法》《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物進(jìn)口安全管理辦法》《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識管理辦法》。農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理辦公室于2017年10月7日修訂了《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例》，明確規(guī)定了在中國境內(nèi)流通的轉(zhuǎn)基因大豆（及其制品）必須標(biāo)明轉(zhuǎn)基因標(biāo)識。

轉(zhuǎn)基因大豆由于生產(chǎn)成本低、田間管理更簡便等特點(diǎn)而被國外廣泛種植。2002年3月20日起，《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識管理辦法》將轉(zhuǎn)基因大豆列入第一批實(shí)施標(biāo)識管理的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物。迄今為止，我國未批準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因大豆作為食品用途流向市場，進(jìn)口的轉(zhuǎn)基因大豆僅限于加工用途，且應(yīng)當(dāng)按照規(guī)定進(jìn)行標(biāo)識。上海作為中國重要的進(jìn)口貿(mào)易海運(yùn)港口，每年有大量進(jìn)口轉(zhuǎn)基因大豆經(jīng)由上海進(jìn)入我國。如果有未經(jīng)標(biāo)識的轉(zhuǎn)基因大豆種子被種植，一方面，將會對我國現(xiàn)有大豆種質(zhì)資源造成污染，甚至危及我國種子安全；另一方面，未經(jīng)標(biāo)識的轉(zhuǎn)基因大豆如果被制作成豆芽、豆腐等日常食品進(jìn)入市場，也會擾亂我國的大豆及豆制品的市場秩序，引起消費(fèi)者擔(dān)心和爭論。因此，有必要對市場進(jìn)行監(jiān)管。

社會及網(wǎng)絡(luò)等空間上流傳諸如依靠種子大小、能不能發(fā)芽等特征來識別轉(zhuǎn)基因大豆，顯然缺乏科學(xué)依據(jù)。PCR檢測轉(zhuǎn)基因成分具有成本低、操作簡便快速等諸多優(yōu)勢，目前已被廣泛運(yùn)用于作物轉(zhuǎn)基因檢測[5-6]。為評估上海市轉(zhuǎn)基因大豆及豆腐流通狀況，本次實(shí)驗(yàn)檢測了上海市場市售未進(jìn)行轉(zhuǎn)基因標(biāo)識的大豆（29份樣品）和豆腐（12份樣品）。鑒于目前世界上種植的轉(zhuǎn)基因大豆絕大部分為抗除草劑草甘膦的轉(zhuǎn)基因大豆，中國政府批準(zhǔn)進(jìn)口的轉(zhuǎn)基因大豆也只有抗除草劑草甘膦的轉(zhuǎn)基因大豆。因此，本研究通過檢測轉(zhuǎn)基因過程中導(dǎo)入大豆基因組的三種質(zhì)粒元件：花椰菜花葉病毒CaMV 35S-P啟動子、根癌農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶基因（NOS）終止子[7-9]、抗除草劑草甘膦基因CP4-EPSPS[10]，結(jié)合大豆內(nèi)源基因大豆凝集素（Lectin）作為內(nèi)標(biāo)基因參照，對上海市大豆及豆腐的轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行定性檢測。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果將為上海市消費(fèi)者的知情權(quán)和相關(guān)部門的監(jiān)管提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣品及試劑儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品 供試樣品共計(jì)42份，其中大豆樣品30份（包含29份栽培大豆和一份作為陰性對照的野生大豆，16號）（見圖1、表1），豆腐樣品12份（見表2）。30份供試大豆樣品如圖1，形態(tài)不一，大小各異。除16號野生大豆采摘于復(fù)旦大學(xué)江灣新校區(qū)，其余樣品均于2018年9月1日至2018年10月5日購于上海市各超市及農(nóng)貿(mào)市場。

表1 大豆樣品信息及發(fā)芽率

圖1 供試大豆樣品

每個樣品取40粒無明顯損傷和病蟲害的大豆種子用75%酒精浸泡30秒，再用無菌水沖洗3～5次。經(jīng)消毒處理后的大豆樣品浸泡24 h，置于濕潤濾紙上并放入培養(yǎng)皿中；蓋上一層紗布，防止水分蒸發(fā)過快。之后定時補(bǔ)充水分，5天后統(tǒng)計(jì)。如表1所示，共計(jì)9份大豆樣品發(fā)芽率為0%，2份樣品發(fā)芽率為100%，其余19份樣品發(fā)芽率為5%～95%。

1.1.2 主要試劑 DNA提取試劑：CTAB、EDTA、Tris、氯仿、乙醇、異丙醇等。

PCR擴(kuò)增及瓊脂糖凝膠電泳檢測試劑：Premier Taq、6×Loading Buffer購于大連寶生物技術(shù)有限公司；D2000 DNA Marker等購自天根生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 微量移液器、恒溫水浴鍋、臺式高速離心機(jī)、電泳儀等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA提取 使用改良的CTAB法提取大豆及豆腐基因組DNA，除氯仿/異戊醇（24/1）抽提蛋白操作重復(fù)一次之外，其余步驟不變。

提取的DNA樣品通過Thermo Scientific Nano?Drop 2000分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)量及濃度。

1.2.2 PCR擴(kuò)增反應(yīng) 三對外源基因花椰菜花葉病毒啟動子（CaMV 35S-P）、根癌農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶基因終止子（NOS-T）、抗除草劑草甘膦基因CP4-EPSPS。及內(nèi)源基因大豆凝集素（Lectin）的引物均由上海桑尼生物科技有限公司合成，詳細(xì)序列信息見表3?？瞻讓φ諡橛玫润w積的ddH2O替換模板DNA，陽性對照為含有35S強(qiáng)啟動子、終止子和EPSPS的質(zhì)粒載體作為模板DNA。

表3 引物序列信息

PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性10 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)30次，72℃再次延伸2 min，4℃保存。反應(yīng)體系為50 μL，各成分加入量如下：5 μL 10×擴(kuò)增緩沖液，8 μL dNTP混合物（2.5 mmol·L-1），3 μL正向引物（10 μmol·L-1），3 μL 反向引物（10 μmol·L-1），1.5 μL模板DNA （150 ng），0.6 μL Taq DNA聚合酶（5 U/μL），3.6 μL Mg2+（2.5 mmol·L-1），加ddH2O至終體積為50 μL。

取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL，于1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測（含溴化乙錠），以D2000 DNA Marker作參照，判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA提取結(jié)果

由于大豆及豆腐中蛋白質(zhì)含量較高，常規(guī)的CTAB法難以去除干凈，為降低殘留的蛋白對后續(xù)實(shí)驗(yàn)的影響，將氯仿/異戊醇（24/1）抽提蛋白步驟進(jìn)行了一次重復(fù)操作。豆腐在加工過程中由于經(jīng)過研磨、煮沸等步驟，難以避免地造成了基因組DNA的斷裂。本實(shí)驗(yàn)中用于檢測的基因引物預(yù)期擴(kuò)增片段較小，都在100～500 bp范圍內(nèi)，因此部分樣品基因組DNA的斷裂并不會對PCR檢測結(jié)果造成不利影響。提取出的DNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，列舉出的部分結(jié)果顯示，大豆（1～30號）基因組DNA條帶清晰且唯一，豆腐（A-L號）DNA條帶彌散（見圖2），均可以用于后續(xù)PCR檢測。

圖2 大豆及豆腐樣品基因組DNA電泳檢測結(jié)果

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

大豆Lectin編碼植物凝集素為植物特有內(nèi)源基因，目的片段長度為210 bp。對所有樣品提取的基因組DNA以Lectin引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，除空白對照外所有樣品都擴(kuò)增得到目標(biāo)產(chǎn)物條帶，與D2000分子標(biāo)記比較顯示目標(biāo)產(chǎn)物條帶約210 bp，表明42份樣品的基因組DNA質(zhì)量可以滿足本次實(shí)驗(yàn)PCR體系要求，可應(yīng)用該基因組DNA及PCR體系進(jìn)行后續(xù)檢測。

利用表3中的4對引物對30份大豆和12份豆腐DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后瓊脂糖凝膠電泳檢測的結(jié)果見圖3和圖4。參試樣品（包含16號野生大豆樣品作為陰性對照）與含有35S強(qiáng)啟動子、終止子和EPSPS的質(zhì)粒載體（陽性對照）在58℃退火溫度下，以花椰菜花葉病毒CaMV 35S啟動子、根癌農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶基因NOS終止子、大豆內(nèi)源基因Lectin、抗草甘膦基因CP4-EPSPS四對引物對42個供試樣品（1～30，A-L）及一個陰性對照、一個空白對照（0）和一個陽性對照（+）進(jìn)行擴(kuò)增。1～30代表大豆樣品順序，A-L代表豆腐樣品順序。除空白對照外，所有樣品均檢出內(nèi)源基因Lectin（210 bp）。除了陽性對照以CaMV 35S-P引物擴(kuò)增檢測出158 bp和483 bp條帶及以NOS-T引物擴(kuò)增出123 bp條帶外，其余位置（42份樣品樣品、陰性對照、空白對照）均未檢出目標(biāo)條帶。在被檢測的所有樣品中，檢測結(jié)果均為陰性（見圖3、圖4），均未檢出外源基因片段。空白對照未見條帶表明體系未受污染，結(jié)果可信。

圖3 大豆樣品PCR檢測的電泳圖譜

圖4 豆腐樣品PCR檢測的電泳圖譜

3 討論

本次實(shí)驗(yàn)采集了上海市農(nóng)貿(mào)市場及超市售賣的29份不同大豆樣品和12份豆腐樣品，實(shí)驗(yàn)樣品包含了大部分上海地區(qū)市場流通的食用大豆和豆腐。檢測結(jié)果能夠?yàn)槿嬖u估上海市市場流通的大豆及豆腐是否含有轉(zhuǎn)基因成分提供有效參考信息。實(shí)驗(yàn)所用的大豆樣品形狀，大小均有明顯差異（見圖1）。豆腐樣品包含了大部分市售品牌及三份散裝售賣的豆腐。因此，本研究所收集的樣品有很好的代表性，基本能反映上海大豆市場及豆制品市場的概況。

凝集素（Lectin）是廣泛存在于各種植物中的糖蛋白或結(jié)合糖的蛋白，大豆凝集素Lectin基因在本次實(shí)驗(yàn)中被用作內(nèi)參基因，檢驗(yàn)DNA的質(zhì)量和大豆種特異性。當(dāng)使用其他引物擴(kuò)增沒有獲得產(chǎn)物時，可以排除DNA的質(zhì)量問題。在樣品中單獨(dú)檢測到CaMV 35S-P或者NOS-T都不能直接判定樣品中含有轉(zhuǎn)基因成分。因?yàn)榛ㄒ嘶ㄈ~病毒容易侵染植物，造成假陽性。只有當(dāng)CaMV 35S-P、NOST和抗除草劑基因CP4-EPSPS同時被檢出時，即能確認(rèn)樣品中含有轉(zhuǎn)基因成分。本次實(shí)驗(yàn)中所試樣品均能擴(kuò)增出Lectin基因，同時所有樣品均以CaMV 35S-P、NOS-T和功能基因CP4-EPSPS為目的片段進(jìn)行了檢測，結(jié)論可靠。初步鑒定為所有樣品均未檢出轉(zhuǎn)基因成分。盡管本研究僅檢測抗除草劑草甘膦的轉(zhuǎn)基因，不能排除其他轉(zhuǎn)基因的可能，但目前大面積商業(yè)化種植的品種都是轉(zhuǎn)抗除草劑基因的品系，且中國政府批準(zhǔn)進(jìn)口的大豆產(chǎn)品也僅為抗除草劑草甘膦的轉(zhuǎn)基因大豆和少量抗蟲大豆。鑒于這一情況，其他轉(zhuǎn)基因大豆非法流入市場的可能性遠(yuǎn)低于轉(zhuǎn)抗除草劑草甘膦基因的大豆。因而，本實(shí)驗(yàn)依然有較大的現(xiàn)實(shí)意義。

孟山都公司第一個轉(zhuǎn)基因大豆產(chǎn)品“農(nóng)達(dá)”（Roundup）被轉(zhuǎn)入耐除草劑草甘膦基因。含有耐除草劑草甘膦基因的大豆可以實(shí)現(xiàn)農(nóng)民控制雜草的同時不影響大豆正常生長。這些大豆種子可以被收獲留種，到第二季繼續(xù)種植，農(nóng)民就可以省去一大筆購置種子的費(fèi)用。1998年，美國農(nóng)業(yè)部和岱字棉公司發(fā)明了一項(xiàng)“終結(jié)者技術(shù)”—在售出之前將轉(zhuǎn)基因作物種子浸泡在四環(huán)素溶液中。經(jīng)過四環(huán)素溶液浸泡處理之后的種子長出的植物再結(jié)的種子卻無法發(fā)芽。據(jù)此，市場上曾流行過一種說法“可以根據(jù)發(fā)芽實(shí)驗(yàn)辨別轉(zhuǎn)基因大豆”，本次實(shí)驗(yàn)中，30份大豆樣品發(fā)芽率有9份樣品不發(fā)芽，2份樣品發(fā)芽率為100%，大部分（19份）樣品發(fā)芽率為5%～95%，且所有樣品均未檢出轉(zhuǎn)基因成分。因此，可初步判定“不能用水泡發(fā)芽的大豆含有轉(zhuǎn)基因成分”的言論不符合實(shí)驗(yàn)結(jié)果。亦有媒體報道稱“轉(zhuǎn)基因大豆轉(zhuǎn)基因黃豆形狀基本呈正圓形；而非轉(zhuǎn)基因黃豆大多是橢圓形或者扁腎形”。本次實(shí)驗(yàn)中的30份大豆樣品既有正圓形又有橢圓形和扁腎形，所以這種說法也可以被此次實(shí)驗(yàn)證偽。

本實(shí)驗(yàn)收集了上海市各區(qū)超市及農(nóng)貿(mào)市場的29份大豆樣品和12份豆腐樣品，檢測結(jié)果均為陰性。此結(jié)果證實(shí)在我們檢測的所有供試樣品中均不含有轉(zhuǎn)抗除草劑草甘膦基因的成分。盡管使用大豆做原料的產(chǎn)品不止上述兩類，還有醬油、豆芽、豆?jié){等豆制品，因此，本研究不能得出結(jié)論說上海市場杜絕了轉(zhuǎn)基因大豆作為食品在市場的流通，但從上述兩類產(chǎn)品的情況看，上海市轉(zhuǎn)基因大豆的標(biāo)識和市場流通監(jiān)管工作認(rèn)真嚴(yán)格。

致謝：感謝羅新富先生和林榮興女士為本次試驗(yàn)準(zhǔn)備材料，感謝張成、楊匡騏、周煒健三位同學(xué)在試驗(yàn)中提供的幫助。