錢(qián)銳，劉輝，徐慧婷，馬長(zhǎng)文，陳浩，梁珺宇，葉建鋒*

（1.上海第二工業(yè)大學(xué)工學(xué)部，上海 201209；2.上海市環(huán)境科學(xué)研究院，上海 200233）

我國(guó)是豬肉消費(fèi)大國(guó)，豬肉需求的快速增長(zhǎng)促進(jìn)了集中式養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。據(jù)統(tǒng)計(jì)，很多地區(qū)的規(guī)?；B(yǎng)豬程度已經(jīng)超過(guò)90%[1]，這就意味著會(huì)集中產(chǎn)生大量的養(yǎng)豬廢水。養(yǎng)豬廢水中蘊(yùn)含大量的有機(jī)物和氮磷等元素，若不經(jīng)妥善處理，將會(huì)造成環(huán)境污染和水生生態(tài)惡化。雖然各規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)大多建立了厭氧產(chǎn)沼氣工程，但產(chǎn)生的發(fā)酵液的處理問(wèn)題依然嚴(yán)峻。另一方面，我國(guó)的蛋白飼料原料嚴(yán)重缺乏，種植業(yè)可提供的飼料蛋白質(zhì)缺口較大，種植所需氮磷肥料主要依賴(lài)工業(yè)生產(chǎn)和磷礦開(kāi)采，而后者存在枯竭風(fēng)險(xiǎn)[2]。因此，對(duì)于可持續(xù)的食品和飼料生產(chǎn)而言，廢水中的養(yǎng)分回收和再循環(huán)尤為重要，例如從養(yǎng)豬廢水中回收和循環(huán)利用氮磷等[3]。

微藻是一類(lèi)具有高光合效率的初級(jí)生產(chǎn)者，它們可以在高濃度廢水中生長(zhǎng)良好，對(duì)廢水中氮、磷等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的去除有很大的潛能。利用廢水培養(yǎng)微藻回收氮磷是目前的研究熱點(diǎn)之一，在節(jié)約微藻培養(yǎng)的成本上有明顯的優(yōu)勢(shì)[4]。近年來(lái)，將回收的微藻用于食物、飼料和生物燃料開(kāi)發(fā)的研究也受到了廣泛的關(guān)注[5?6]。目前用于微藻培養(yǎng)的廢水主要包括生活廢水、工業(yè)廢水以及農(nóng)業(yè)廢水等。LI 等[7]的研究發(fā)現(xiàn)，利用高壓滅菌后的生活廢水作為底物進(jìn)行微藻培養(yǎng)時(shí)，微藻最高生長(zhǎng)量為0.24 g·L?1·d?1，但是生活廢水氮磷含量低，且對(duì)廢水進(jìn)行高溫高壓滅菌預(yù)處理成本較高。CHENG 等[8]研究發(fā)現(xiàn)養(yǎng)豬廢水是微藻培養(yǎng)的理想來(lái)源，但底物中大分子的有機(jī)物難以被微生物利用，另一方面，高濃度的污染物會(huì)對(duì)微藻的生長(zhǎng)速率和生物量產(chǎn)生不利影響。

為了提高微藻的生長(zhǎng)量，NAM 等[9]的研究表明適當(dāng)稀釋的養(yǎng)豬廢水對(duì)微藻的生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用，稀釋8 倍的豬糞廢水可獲得0.25 g·L?1·d?1的小球藻。然而稀釋倍數(shù)較高會(huì)造成處理水量的增加。WANG等[10]將廢水先經(jīng)過(guò)高溫滅菌后再進(jìn)行微藻培養(yǎng)，但高壓滅菌加大了微藻培養(yǎng)的成本以及操作難度，不適合大規(guī)模推廣應(yīng)用。在自然界中，細(xì)菌和微藻的關(guān)系經(jīng)常被認(rèn)為是互惠共生。POSADAS 等[11]發(fā)現(xiàn)藻菌生物膜反應(yīng)器對(duì)有機(jī)物的去除率比普通細(xì)菌生物膜反應(yīng)器高1 倍，但是藻菌生物膜反應(yīng)器限制了微藻的生長(zhǎng)以及收獲。微藻在利用水體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)形成新的微藻細(xì)胞的同時(shí)，釋放出氧氣供菌群利用。而微生物菌群分解有機(jī)物產(chǎn)生的小分子物質(zhì)更易于被微藻利用，從而刺激微藻的生長(zhǎng)。但是過(guò)量微生物菌群的存在會(huì)與微藻爭(zhēng)奪營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，有些細(xì)菌可以通過(guò)釋放可溶性纖維素酶或細(xì)胞外物質(zhì)導(dǎo)致微藻死亡[12]。因此，如何通過(guò)藻菌共生系統(tǒng)和藻菌的協(xié)同作用，在降低廢水有機(jī)污染物的同時(shí)，最大化促進(jìn)微藻的產(chǎn)量和氮磷的轉(zhuǎn)化是未來(lái)研究的重點(diǎn)。

本研究針對(duì)養(yǎng)豬廢水資源化利用率低以及微藻純培養(yǎng)產(chǎn)率較低的問(wèn)題，開(kāi)展養(yǎng)豬廢水消化液經(jīng)藻菌共生系統(tǒng)轉(zhuǎn)化為以收獲微藻為主體的資源化利用研究。以養(yǎng)豬廢水消化液作為底物，首先對(duì)藻菌共生體系的藻菌比例進(jìn)行優(yōu)化，構(gòu)建互惠共生的藻菌體系；然后對(duì)微藻接種濃度和光照周期等關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行探究；最后在優(yōu)化的工藝條件下運(yùn)行藻菌共生反應(yīng)器，深入分析其運(yùn)行特性和機(jī)制，為其應(yīng)用于養(yǎng)豬廢水的資源化處理提供支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究以小球藻（Chlorella）[13]為研究藻種，在TAP[14]培養(yǎng)基中大量培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，采用蒸餾水多次清洗，離心重新懸浮后備用。以上海市某污水處理廠的活性污泥作為菌種來(lái)源，在4 ℃下靜置24 h 濃縮后作為接種污泥使用，濃縮后污泥的混合液懸浮固體濃度（Mixed liquid suspended solids，MLSS）和混合液揮發(fā)性懸浮固體（Mixed liquid volatile suspended solids，MLVSS）分別為7.56 g·L?1和3.70 g·L?1。本研究所用廢水底物為養(yǎng)豬場(chǎng)的厭氧消化出水，取自上海市金山區(qū)某養(yǎng)豬廠厭氧消化池，其溶解性化學(xué)需氧量（SCOD）、溶解性總氮（TDN）、溶解性總磷（TDP）、氨 氮（?N）和硝態(tài)氮（?N）濃度分別為（1 585.0±37.5）、（1 204.5±1.5）、（61.6±1.1）、（1 065.0±15.0）mg·L?1和（0.6±0.2）mg·L?1，濁度為（104.5±0.2）NTU。

1.2 實(shí)驗(yàn)裝置

1.2.1 批次實(shí)驗(yàn)裝置

批次實(shí)驗(yàn)裝置主要用于藻菌共生系統(tǒng)關(guān)鍵工藝參數(shù)（包括藻菌比例、微藻接種濃度和光照周期）的優(yōu)化。主體為玻璃錐形瓶，其有效體積為250 mL。實(shí)驗(yàn)時(shí)將底物和藻（或藻菌）在玻璃錐形瓶中混合，放置在恒溫光照搖床上，溫度控制在25～27 ℃，光源為L(zhǎng)ED燈，光強(qiáng)為92.27μmol·m?2·s?1。

1.2.2 反應(yīng)器設(shè)置

反應(yīng)器的運(yùn)行實(shí)驗(yàn)在兩個(gè)透明有機(jī)玻璃制成的圓柱體反應(yīng)器中進(jìn)行，反應(yīng)器高70 cm，內(nèi)徑為7 cm，有效工作容積為9.2 L。外部左右兩側(cè)設(shè)置LED 燈架，用于提供微藻生長(zhǎng)必需的光源。反應(yīng)器底部均設(shè)置攪拌器以保持體系的均一性。同時(shí)在反應(yīng)器內(nèi)的中部安裝了自動(dòng)加熱裝置使反應(yīng)器運(yùn)行溫度恒定在（26±1）℃，實(shí)驗(yàn)裝置如圖1所示。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

本研究以養(yǎng)豬廢水厭氧發(fā)酵液為底物進(jìn)行微藻培養(yǎng)，分成兩部分進(jìn)行。

首先在批次實(shí)驗(yàn)中探究了添加不同比例的污泥對(duì)廢水中氮磷去除和微藻生長(zhǎng)量的影響，共設(shè)置5 個(gè)藻菌比[微藻∶污泥（以MLSS 計(jì)），質(zhì)量比，下同]分別為1∶0、1∶0.2、1∶0.5、1∶1和1∶5，設(shè)置微藻初始接種濃度為0.2 g·L?1，并提供持續(xù)光照。然后在上述適宜的藻菌比條件下，對(duì)微藻初始接種濃度進(jìn)一步優(yōu)化，微藻初始接種濃度分別設(shè)定為0.05、0.1 g·L?1和0.2 g·L?1，并提供持續(xù)光照。最后，選取優(yōu)化的藻菌比和微藻接種濃度，設(shè)定3 個(gè)不同光照周期，分別為8 h 光∶16 h暗（8L∶16D）、12 h光∶12 h暗（12L∶12D）、24 h光∶0 h暗（24L∶0D）。

在批次實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取優(yōu)化后的工藝參數(shù)，構(gòu)建和運(yùn)行微藻純培養(yǎng)反應(yīng)器R1和藻菌共生反應(yīng)器R2。進(jìn)一步對(duì)比反應(yīng)器中微藻生物量產(chǎn)出以及氮磷資源化的差異。反應(yīng)器中微藻初始濃度均為0.2 g·L?1，光照周期為12L∶12D。微藻純培養(yǎng)反應(yīng)器中藻菌比為1∶0，藻菌共生反應(yīng)器中藻菌比為1∶0.2。

批次實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)器取3 個(gè)平行樣進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定，結(jié)果表達(dá)為均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

1.4 采樣分析方法

實(shí)驗(yàn)期間每日采集反應(yīng)器中的混合溶液，進(jìn)行微藻生物量和總生物量的測(cè)定。樣品上清液通過(guò)0.45μm的濾膜過(guò)濾后進(jìn)行水質(zhì)指標(biāo)分析。分析指標(biāo)包括SCOD、?N、TDN、TDP、?N、MLSS、MLVSS，均采用標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定[15]。溶解氧（DO）濃度采用便攜式溶解氧儀測(cè)定，pH 值使用便攜式pH 儀測(cè)定，濁度使用濁度儀測(cè)定。微藻濃度由葉綠素濃度計(jì)算而得，葉綠素濃度的提取和測(cè)定參考相關(guān)文獻(xiàn)[16]。

1.5 數(shù)據(jù)處理方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2019 和SPSS 24 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素ANOVA 檢驗(yàn)以LSD 法及Waller?Duncan 法分析不同藻菌比下SCOD、TDN、TDP 和?N 之間的差異顯著性。使用Origin 2018作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 藻菌共生系統(tǒng)關(guān)鍵工藝參數(shù)對(duì)微藻生物量的影響

微藻在不同工藝參數(shù)下的生長(zhǎng)情況如圖2 所示。結(jié)果表明，微藻純培養(yǎng)系統(tǒng)中微藻的生長(zhǎng)量都低于藻菌共生系統(tǒng)。不同藻菌比下微藻最高產(chǎn)量分別為0.58、0.83、0.82、0.75 g·L?1和0.61 g·L?1。微生物可以分解復(fù)雜的有機(jī)底物，產(chǎn)生易于被微藻利用的小分子有機(jī)酸[17]。但是過(guò)多的污泥會(huì)與微藻爭(zhēng)奪環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[18]，并且隨著活性污泥的添加，系統(tǒng)中的濁度從最初的104 NTU 增加到了653 NTU，導(dǎo)致系統(tǒng)透光性差，微藻光合作用速率下降，限制了微藻的生長(zhǎng)。因此，投入過(guò)量的污泥會(huì)使得微藻因失去競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)而走向衰亡。由此可見(jiàn)，加入適量的污泥構(gòu)成的藻菌共生系統(tǒng)，即當(dāng)藻菌比例為1∶0.2時(shí)，能夠形成良好的藻菌互惠共生關(guān)系。

微藻的初始接種濃度影響微藻在廢水中的適應(yīng)性和生長(zhǎng)速率。固定藻菌比例為1：0.2 的條件下，當(dāng)微藻初始接種濃度為0.05、0.1 g·L?1和0.2 g·L?1時(shí)，微藻的最大增長(zhǎng)量分別為0.41、0.52 g·L?1和0.68 g·L?1。在不同光照周期系統(tǒng)中，微藻均能正常生長(zhǎng)。如圖2C 所示，相比于其他兩個(gè)系統(tǒng)，在12L∶12D 系統(tǒng)中，微藻達(dá)到了最高的生長(zhǎng)速率和生長(zhǎng)量，分別為0.2 g·L?1·d?1和0.81 g·L?1，24L∶0D系統(tǒng)次之，8L∶16D系統(tǒng)最小。這一結(jié)果與其他研究中光照周期對(duì)微藻生長(zhǎng)的影響趨勢(shì)一致[19?20]。從微藻生物質(zhì)的變化趨勢(shì)來(lái)看，微藻的光合作用存在一定的飽和時(shí)間[21]，在此范圍內(nèi)，光照時(shí)間越長(zhǎng)，微藻積累量越大。因此，在微藻培養(yǎng)過(guò)程中，需要選用適宜的光照周期。

綜上所述，在利用養(yǎng)豬廢水厭氧發(fā)酵液培養(yǎng)微藻時(shí)，加入適量的活性污泥構(gòu)建藻菌共生體系，有助于微藻的生長(zhǎng)繁殖。并且采用藻菌比1∶0.2、微藻接種濃度0.2 g·L?1、光照周期12L∶12D 時(shí)，能夠獲得最優(yōu)的微藻生長(zhǎng)量。

2.2 藻菌共生體系關(guān)鍵工藝參數(shù)對(duì)污染物去除率的影響

微藻純培養(yǎng)系統(tǒng)中SCOD 的去除率為85%，而藻菌比1∶5 系統(tǒng)中SCOD 的去除率達(dá)90%（圖3A）。從氮的去除上來(lái)看，在藻菌比1∶0條件下，TDN和?N的去除率最低，分別為25.7%和13.2%，藻菌比1∶0.2條件下TDN 和?N 的去除率最大，分別為32.7%和21.3%。分析認(rèn)為，藻菌共生系統(tǒng)中的微生物將有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨，有利于藻類(lèi)同化[22]，并且在藻菌比1∶0.2 條件下生物量最高（0.83 g·L?1），提高了氮的同化量。但是，在藻菌比1∶5 時(shí)，大量細(xì)菌的呼吸作用導(dǎo)致系統(tǒng)中溶解氧濃度不足1 mg·L?1，生成的?N 不能有效地轉(zhuǎn)化成?N及?N，使得系統(tǒng)中仍有較高濃度的?N。體系中TDP 的去除與微藻的同化和微生物的活動(dòng)有關(guān)[23]。有研究表明，1 g 藻類(lèi)細(xì)胞的生長(zhǎng)需要0.009 g磷[24]，但是在本實(shí)驗(yàn)中收獲最少生物量的微藻純培養(yǎng)系統(tǒng)中，TDP 的去除率最高達(dá)76%，表明除了藻類(lèi)的同化作用，還存在其他的去除途徑。通過(guò)對(duì)體系pH 的監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，微藻純培養(yǎng)系統(tǒng)中pH 值高于藻菌共生系統(tǒng)，達(dá)到9.4，適宜磷酸鹽的析出[25]，這可能是其去除率較高的原因。

圖3B、圖3C 顯示了不同微藻接種濃度和光照周期條件下污染物的去除率。污染物的去除率與微藻生物量的變化趨勢(shì)一致。其中，TDP的去除率受光照周期的影響較大。隨著光照時(shí)間的增加，TDP的去除率從12%增加至61%后下降到41%，這與微藻光合作用產(chǎn)氧造成體系內(nèi)厭氧/好氧環(huán)境的交替有關(guān)。聚磷菌只有在厭氧/好氧交替的環(huán)境下才能完成釋磷?吸磷機(jī)制[26]。持續(xù)的光照使得體系一直處于好氧狀態(tài)，聚磷菌無(wú)法在厭氧狀態(tài)下有效釋磷并儲(chǔ)存胞內(nèi)能源物質(zhì)[27?28]，導(dǎo)致其不能從環(huán)境中吸收溶解態(tài)的正磷酸鹽，TDP 的去除率反而變低。綜上所述，在微藻接種濃度0.2 g·L?1、藻菌比1∶0.2、光照周期12L∶12D時(shí)，能夠獲得較大的微藻生物量，同時(shí)能夠有效去除養(yǎng)豬廢水消化液中的有機(jī)物和營(yíng)養(yǎng)元素。

2.3 反應(yīng)器運(yùn)行機(jī)制及藻菌共生體系特性

2.3.1 反應(yīng)器中微藻生物量變化分析

微生物菌群的投加提高了微藻的生長(zhǎng)上限，藻菌共生體系具有更高的微藻產(chǎn)出。微藻純培養(yǎng)反應(yīng)器R1 和藻菌共生反應(yīng)器R2 中微藻生長(zhǎng)情況如圖4A 所示。R1、R2反應(yīng)器中微藻濃度在運(yùn)行第5 d分別達(dá)到了0.52 g·L?1和0.66 g·L?1。從第6 d開(kāi)始R2中微藻開(kāi)始二次生長(zhǎng)，達(dá)到1.37 g·L?1。微藻的生長(zhǎng)受多種因素的影響，反應(yīng)器中的溶解氧濃度、pH 值、碳源等均是微藻增殖的重要限制因素[29?31]。R1和R2中污泥和微藻的混合濃度（以MLSS 表示，圖4B）在前5 d 保持一致。微藻在進(jìn)行光合作用的過(guò)程中，吸收CO2、釋放OH?和O2，從而提高反應(yīng)器中pH 和DO 的水平[32]。R1 在運(yùn)行全過(guò)程中pH 值和溶解氧濃度隨著反應(yīng)時(shí)間的推移而不斷增加，如圖4C、圖4D 所示。由于藻類(lèi)對(duì)營(yíng)養(yǎng)物的親和力較高，能在培養(yǎng)基中存在高濃度有機(jī)物的情況下抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)[21]，因此在反應(yīng)前期，R2中微藻占據(jù)競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。在反應(yīng)中期，微藻生長(zhǎng)趨于穩(wěn)定，產(chǎn)生氧氣供好氧細(xì)菌繁殖積累，進(jìn)而降低了反應(yīng)器中溶解氧的濃度以及pH 值，微藻利用CO2等碳源完成自身增殖[33]，呈現(xiàn)二次增長(zhǎng)，形成良好的互惠共生關(guān)系，最終獲得了更高的微藻產(chǎn)量，證明了該類(lèi)型反應(yīng)器的資源化優(yōu)勢(shì)。

2.3.2 反應(yīng)器中污染物去除效果分析

微藻純培養(yǎng)反應(yīng)器R1 和藻菌共生反應(yīng)器R2 處理養(yǎng)豬廢水厭氧消化液的運(yùn)行過(guò)程中反應(yīng)器內(nèi)污染物指標(biāo)的變化情況如圖5 所示。由于13 d 后微藻有明顯的衰亡現(xiàn)象，因此實(shí)驗(yàn)全過(guò)程監(jiān)測(cè)時(shí)間為13 d。R1 和R2 對(duì)SCOD 的去除效果相差較大，R1 中SCOD有明顯的積累現(xiàn)象，最終去除率僅為24.4%。而R2中SCOD 最終去除率達(dá)到81.0%。并且R2 對(duì)TDN、?N 和TDP 的去除體現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì)。R2 中TDN、?N 的去除率在前6 d 與R1 反應(yīng)器相似，之后隨著微藻的二次生長(zhǎng)，R2中氮的含量迅速減少，TDN和?N去除率最終達(dá)47.5%和78.7%。R2 中TDP的去除率可達(dá)72.1%。投加微生物菌群構(gòu)建的藻菌共生反應(yīng)器，能在提高微藻生物量的同時(shí)強(qiáng)化對(duì)氮磷等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的回收與利用，更好地實(shí)現(xiàn)養(yǎng)豬廢水厭氧消化液的資源化回收利用。

對(duì)反應(yīng)器中微藻平均生長(zhǎng)速率進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，微藻純培養(yǎng)反應(yīng)器中在第4 d 時(shí)最大（0.09 g·L?1·d?1），而藻菌共生反應(yīng)器中在第2 d 時(shí)最大（0.16 g·L?1·d?1）。因此，為了高效地收獲微藻，運(yùn)用藻菌共生反應(yīng)器可以提高微藻的生長(zhǎng)速率和生長(zhǎng)上限，收獲周期可設(shè)定為2 d?？紤]到污染物的高效去除，可以設(shè)置HRT 為12 d，此時(shí)SCOD、TDN、TDP 和?N 的去除率分別為85.0%、50.2%、72.1%和78.7%。

3 結(jié)論

（1）相對(duì)于微藻純培養(yǎng)，投加適宜比例的菌群，構(gòu)建互惠共生的藻菌共生體系，有利于提高微藻產(chǎn)量。

（2）在優(yōu)化的工藝條件下運(yùn)行微藻純培養(yǎng)反應(yīng)器與藻菌共生反應(yīng)器，發(fā)現(xiàn)藻菌共生體系有利于提供微藻生長(zhǎng)所需的無(wú)機(jī)碳源和有機(jī)小分子碳源，維持反應(yīng)器酸堿環(huán)境，進(jìn)而提高微藻生長(zhǎng)速率和產(chǎn)量上限，微藻最高生長(zhǎng)量比微藻純培養(yǎng)系統(tǒng)中提高了1 倍，達(dá)

1.4 g·L?1。

（3）藻菌共生反應(yīng)器對(duì)溶解性化學(xué)需氧量、氮和磷的去除效果優(yōu)于微藻純培養(yǎng)反應(yīng)器。