嚴 俊，王紅娟，陳志燕，陳 歡，周 蕓，羅彥波，范 忠，付亞寧，鄧賓玲，劉 彤，韋入丹，黃世杰，韓書磊*

（1．廣西中煙工業(yè)有限責任公司，廣西 南寧 530001；2．國家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，河南 鄭州 450001）

電子煙通過內(nèi)置霧化器將煙液霧化供人吸食，一般由霧化器、電池、煙液、傳感器等部分組成［1－3］。電子煙煙液一般含有霧化劑（如1，2-丙二醇、丙三醇）、各種調(diào)味添加劑、煙堿（尼古丁）等［4－7］。煙堿是電子煙煙液的重要物質(zhì)和標簽，含量一般為0～36 mg/g［4，8］，是人們消費電子煙的重要原因之一，國外多個電子煙法規(guī)或標準均限定了電子煙煙液中的煙堿含量［9－12］。電子煙煙液中的煙堿一般來源于煙草提取，而降煙堿、假木賊堿、新煙草堿、麥斯明、β-二烯煙堿、可替寧、2，3’-聯(lián)吡啶等是煙草中的主要次要生物堿，均與煙堿具有類似的結(jié)構和化學特性，在煙堿的提取和純化過程中往往難以完全去除，是影響煙堿感官及生理效應的重要因素，并可能作為判別煙堿來源的“指紋圖譜”［7－8］。因此，電子煙煙液中生物堿的檢測具有重要意義。

目前，電子煙煙液中生物堿的分析報道相對較少，測定方法主要有氣相色譜法（GC/FID）［4，13］、氣相色譜－質(zhì)譜法（GC－MS）［14］、液相色譜法（HPLC/UV）［7，15］、液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC－MS/MS）［16］等。由于電子煙煙液基質(zhì)復雜，可能含有多種添加劑和香味物質(zhì)［17］，GC/FID和HPLC/UV僅使用保留時間定性，易出現(xiàn)假陽性結(jié)果，GC－MS雖快速、靈敏度高，但其抗基質(zhì)干擾能力有限，而HPLC－MS/MS儀器昂貴，普及率相對較低?；诖?，本文建立了一種液－液萃取/氣相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法（LLE/GC－MS/MS）測定電子煙煙液中10種生物堿含量的分析方法，方法具有分析速度快、靈敏度高、選擇性好等優(yōu)點。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

氣相色譜－三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（2010－plus氣相色譜儀，配TQ 8030三重四極桿質(zhì)譜儀，日本島津公司）；AE163電子天平（感量：0．000 1 g，瑞士Mettler公司）；Talboys數(shù)顯型多管式旋渦混合器；電子煙煙液為市售樣品。

降煙堿（純度98%，美國Alfa Aesar公司）；煙堿、N-甲基假木賊堿、麥斯明、假木賊堿、β-二烯煙堿、新煙草堿、2，3’-聯(lián)吡啶、β-二烯降煙堿、可替寧（純度>97%，加拿大Toronto Research Chemicals公司）；內(nèi)標物：喹啉（純度98%，美國Alfa Aesar公司），降煙堿-2，4，5，6-D4（降煙堿-D4，純度98%，加拿大CDN Isotopes公司），2，2’-聯(lián)吡啶-D8（純度98%，加拿大CDN Isotopes）；甲醇、正己烷、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷（色譜純，韓國Duksan公司）；氫氧化鈉、無水硫酸鎂（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）。實驗用水為Milli-Q系統(tǒng)（Milford，MA，USA）制備的超純水。

1.2 標準工作溶液配制

內(nèi)標儲備液的配制：用甲醇配制喹啉、降煙堿-D4、2，2’-聯(lián)吡啶-D8質(zhì)量濃度分別為50、1．0、1．0 mg/mL的內(nèi)標儲備液。

標準儲備液的配制：用甲醇分別配制煙堿、降煙堿和其他8種次要生物堿質(zhì)量濃度分別為50、2．0、2．0 mg/mL的標準儲備液。

標準工作溶液的配制：用二氯甲烷將標準儲備液逐級稀釋，配制煙堿質(zhì)量濃度分別為0．025、0．05、0．10、0．50、1．0 mg/mL的標準工作溶液，內(nèi)標（喹啉）質(zhì)量濃度為0．25 mg/mL，配制其他9種次要生物堿質(zhì)量濃度分別為0．002 5、0．01、0．05、0．25、1．0、5．0、20．0μg/mL的標準工作溶液，內(nèi)標（降煙堿-D4和2，2’-聯(lián)吡啶-D8）質(zhì)量濃度為5．0μg/mL，其中，喹啉為煙堿內(nèi)標，降煙堿-D4為降煙堿內(nèi)標，2，2’-聯(lián)吡啶-D8為其他8種次要生物堿內(nèi)標。

1.3 樣品前處理

準確稱取0．3 g電子煙煙液樣品于15 mL塑料離心管中，再分別加入50μL內(nèi)標溶液和2．0 mL 2%NaOH水溶液，混勻靜置10 min后，加入10 mL二氯甲烷－甲醇溶液（體積比4∶1），加蓋密封后置于渦旋振蕩器中以2 000 r/min渦旋振蕩提取30 min。室溫靜置1 h后，取下層有機相以無水硫酸鎂干燥除水，轉(zhuǎn)移至色譜分析瓶中，待GC－MS/MS分析。

1.4 色譜－質(zhì)譜條件

1.4.1 色譜條件 DB－35MS毛細管色譜柱（30 m×0．25 mm×0．25μm）；進樣口溫度：250℃；進樣量：1μL；載氣：氦氣（純度≥99．999%），恒流模式，流速：1．0 mL/min；升溫程序：初始溫度80℃，保持1 min，以20℃/min升至200℃，再以50℃/min升至300℃，保持5 min；煙堿和9種次要生物堿采用兩次進樣，其中，煙堿分流比為100∶1，9種次要生物堿分流比為10∶1，煙堿溶劑延遲為5 min，其他次要生物堿溶劑延遲為7 min。

1.4.2 質(zhì)譜條件 電離方式：電子轟擊源（EI）；電離能量：70 eV；傳輸線溫度：280℃；離子源溫度：250℃；碰撞氣：氬氣，碰撞氣壓力200 kPa；質(zhì)譜掃描方式：多反應監(jiān)測模式（MRM），監(jiān)測參數(shù)見表1。

表1 目標物和內(nèi)標的保留時間和MRM參數(shù)Table 1 Retention time and parameters of MRM mode for target analytes and intemal standards

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜－質(zhì)譜條件優(yōu)化

采用中等極性的DB－35MS毛細管色譜柱為分析柱，在全掃描（Full scan）模式下，通過優(yōu)化升溫程序，在15 min內(nèi)實現(xiàn)了10種目標物和3種內(nèi)標物的基線分離，并通過單標溶液對目標化合物進行確認。將一定質(zhì)量濃度的混合標準工作溶液進行一級質(zhì)譜全掃描，選擇特征明顯、質(zhì)量數(shù)高、重現(xiàn)性好的離子作為目標物和內(nèi)標物的母離子，然后采用產(chǎn)物離子掃描模式優(yōu)化碰撞能量及產(chǎn)物子離子，對每組母離子/子離子分別選擇碰撞能量為1～50 eV進行掃描，間隔3 eV，選擇離子對響應最強的碰撞能量，最終確定目標物和內(nèi)標物的母離子、子離子、碰撞能量、定量/定性離子豐度比等參數(shù)，并以豐度最高的子離子進行定量分析，豐度次高的離子對進行定性分析，目標物和內(nèi)標的MRM參數(shù)優(yōu)化結(jié)果如表1所示，優(yōu)化條件下10種目標物和3種內(nèi)標物的色譜圖見圖1。

圖1 多反應監(jiān)測模式下標準工作溶液中目標物色譜圖Fig．1 Chromatograms of target analytes in standard solution under multiple monitor mode（MRM）the peak numbers（1-10 and IS）were the same as those in Table 1

2.2 萃取溶劑的選擇

電子煙煙液一般為弱酸性或弱堿性［18］，生物堿是一種含氮雜環(huán)有機堿性物質(zhì)，在酸性條件下具有水溶性，而在堿性條件下為脂溶性，因此，氣相色譜分析時需加入適量堿性水溶液將生物堿游離出來，再加入有機溶劑進行液－液萃取。以加入有生物堿混合標準溶液的1，2-丙二醇和丙三醇混合溶劑（質(zhì)量比為1∶1）為研究對象，參考文獻報道的常用生物堿萃取溶劑［19－22］，比較了正己烷、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷5種溶劑的萃取效率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正己烷對大部分次要生物堿的萃取效率均較低，甲基叔丁基醚對β-二烯煙堿及可替寧的萃取效率較低，乙酸乙酯對可替寧的萃取效率不高，三氯甲烷對降煙堿、假木賊堿及新煙草堿的萃取效率均很低，可能是目標化合物發(fā)生了分解或反應生成其他物質(zhì)，二氯甲烷對所有目標化合物的綜合萃取效率最高（92．0%～100%）。根據(jù)文獻報道［22－23］，由于甲醇在水及二氯甲烷中均具有一定溶解度，向二氯甲烷中加入適量甲醇可提高對生物堿的萃取效率，因此比較了不同比例二氯甲烷－甲醇（體積比1∶0、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1）對生物堿萃取效率的影響，發(fā)現(xiàn)當加入甲醇后，二氯甲烷的萃取效率略有提高，當二氯甲烷與甲醇體積比為4∶1時對生物堿的綜合萃取效率最高（96．9%～100%），所以最終選擇二氯甲烷-甲醇（體積比4∶1）為萃取溶劑。

2.3 NaOH含量的選擇

由于需加入一定量堿性溶劑才能夠?qū)㈦娮訜煙熞褐薪Y(jié)合態(tài)的生物堿游離出來，從而提高萃取效率，已有文獻報道煙草及卷煙主流煙氣中生物堿測定多采用1%～8%的氫氧化鈉（NaOH）溶液［20，23－25］。因此實驗考察了添加2．0 mL不同含量（0．5%、1%、2%、5%、10%）NaOH對回收率的影響。結(jié)果顯示，不同含量NaOH溶液對回收率（82．3%～100%）的影響不明顯，2%～10%的NaOH萃取效率略高于0．5%和1%，因此最終選擇2%的NaOH溶液（回收率為91．0%～98．7%），既可滿足回收率的要求，又可避免高濃度NaOH可能導致的乳化現(xiàn)象。

2.4 提取方式及萃取時間的選擇

實驗考察了超聲提取、機械振蕩、渦旋振蕩3種提取方式對回收率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，超聲振蕩的效果略差，而機械振蕩提取和渦旋振蕩提取的回收率差異不明顯，考慮到前處理過程的便捷性，最終選擇渦旋振蕩提取，并對渦旋振蕩時間（10、20、30、40、50、60 min）進行了考察，發(fā)現(xiàn)渦旋30 min后目標物已基本萃取完全，因此最終選擇渦旋振蕩萃取30 min。

2.5 目標物在萃取溶液中的穩(wěn)定性

萃取溶液中的生物堿可能在光、熱等作用下發(fā)生氧化反應而影響測試結(jié)果的準確性［26］。為考察目標物在萃取溶液中的穩(wěn)定性，將萃取溶液裝入色譜瓶中，考察在室溫（約20℃）下放置（0～120 h）對測定結(jié)果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著放置時間的延長，萃取溶液中的目標化合物含量未發(fā)生明顯變化，表明目標化合物在萃取溶液中具有較好的穩(wěn)定性。

2.6 GC－MS/MS與GC－MS方法的比較

電子煙煙液可能存在數(shù)百種添加劑和香味物質(zhì)，這些物質(zhì)可能對次要生物堿等痕量化合物的測定造成干擾［27］。相比GC－MS，GC－MS/MS儀器價格相對較高，普及率相對較低，但測定準確性更好。因此，在相同樣品前處理條件下，對比了GC－MS/MS與GC－MS兩種儀器分析方法的測試結(jié)果。結(jié)果顯示：①兩種方法測試結(jié)果的相對標準偏差不高于12%（表2），表明兩種方法的一致性良好；②GCMS在分析部分水果口味樣品時部分次要生物堿（如假木賊堿）和內(nèi)標（降煙堿-D4）均存在明顯的基質(zhì)干擾現(xiàn)象，嚴重影響了目標物的定性定量分析，而GC－MS/MS因采用二級離子定性定量，解決了雜質(zhì)碎片離子的干擾問題，提高了分析的準確性；③在靈敏度方面，與GC－MS相比，除個別目標物外（如降煙堿、假木賊堿），GC－MS/MS方法的檢出限均低于或顯著低于GC－MS（表2），顯示了更高的靈敏度。綜上所述，與GC－MS相比，GC－MS/MS更適合電子煙煙液中生物堿的測定。

表2 GC－MS/MS與GC－MS方法的比較Table 2 Comparison of GC－MS/MS and GC－MS

2.7 方法學評價

在優(yōu)化條件下，對10種目標物的系列標準工作溶液進行分析，內(nèi)標法定量，以各目標物與內(nèi)標物定量離子峰面積的比值（y）為縱坐標，對應目標物質(zhì)量濃度（x）為橫坐標，繪制標準曲線。并取陰性空白樣品為基質(zhì)進行低、中、高3個水平的加標回收實驗，每個加標水平重復測定5次，以3倍信噪比（S/N=3）計算方法的檢出限。結(jié)果顯示：煙堿及9種次要生物堿分別在25～1 000μg/mL及0．002 5～20μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性，相關系數(shù)（r2）不低于0．997 1，檢出限（LOD）為0．0040～0．10 mg/kg，定量下限（LOQ，S/N=10）為0．013～0．33 mg/kg，10種化合物在3個加標水平下的回收率為87．9%～109%，日內(nèi)及日間相對標準偏差（RSD）分別不大于6．8%和7．9%。

表3 10種生物堿的線性范圍、相關系數(shù)、回收率、精密度、檢出限及定量下限Table 3 Linear ranges，correlation coeffinients（r2），spiked recoveries，RSDs，LODs and LOQs of target analytes

2.8 實際樣品分析

利用本方法對23種品牌共計171種型號電子煙煙液中的10種生物堿進行了測定（典型樣品色譜圖如圖2所示）。結(jié)果顯示，電子煙煙液中煙堿含量為2．16～23．73 mg/g，與文獻報道的范圍相一致［4，7］。電子煙煙液中9種次要生物堿的檢出率為64．91%～99．42%，含量中位值為0．06～7．35 mg/kg，遠低于傳統(tǒng)煙草［21］，這是由于電子煙煙液中的煙堿來源于煙草，在提取和純化過程中次要生物堿會被逐級去除。此外，有9種電子煙煙液樣品的總次要生物堿含量與煙堿含量比例大于1．0%，最高可達4．3%，超出了美國等國家或地區(qū)對藥典級煙堿純度的限量要求（1．0%）［12］，表明應對電子煙煙液中煙堿純度作進一步規(guī)范。

圖2 多反應監(jiān)測模式下樣品溶液中目標物色譜圖Fig．2 Chromatograms of target analytes in sample solution under multiple monitor mode（MRM）the peak number（1-10 and IS）as those in Table 1

3 結(jié) 論

本研究通過優(yōu)化色譜－質(zhì)譜條件及樣品前處理條件，以2%NaOH溶液為堿性溶液，以10 mL二氯甲烷－甲醇溶液（體積比4∶1）為萃取溶液，建立了一種液-液萃取/氣相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測定電子煙煙液中的10種生物堿含量的分析方法，方法靈敏度高，抗干擾能力強，適合電子煙煙液樣品中10種生物堿含量的測定。