彭國(guó)穎，盧 山，黃 超，楊 坤，胡 亮，黃長(zhǎng)干,*

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)，南昌市植物資源化學(xué)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330045；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)校友辦，江西 南昌 330045）

鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）具有良好的保健功能和藥用價(jià)值，被譽(yù)為“九大仙草之首”。鐵皮石斛中含有多糖、甘露糖、生物堿、蛋白質(zhì)等化學(xué)成分[1-2]，在抗腫瘤[3-5]、降血糖血壓[6]、抗衰老[7]、抗疲勞[8]、退熱止痛[9]、心血管系統(tǒng)[10]及胃腸道[11]抑制等方面具有重要的作用。

多糖、甘露糖、生物堿和蛋白質(zhì)含量是評(píng)價(jià)鐵皮石斛品質(zhì)的重要指標(biāo)。鐵皮石斛的藥效與多糖含量有著密切的聯(lián)系[12]。甘露糖是唯一在臨床上使用的糖質(zhì)營(yíng)養(yǎng)素，許多疾病正是由于缺乏甘露糖糖化作用中的酵素而導(dǎo)致的[13]。生物堿是中草藥中重要的有效成分之一，大多數(shù)生物堿具有復(fù)雜的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，具有顯著的生物活性。蛋白質(zhì)在參與機(jī)體防御功能，在催化代謝反應(yīng)、調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝和生理活動(dòng)等方面具有重要的作用。重金屬超標(biāo)日益成為影響中草藥品質(zhì)和食用安全性的重要因素[14-15]。與其他重金屬相比，砷和鎘的遷移能力強(qiáng)，極易在中草藥體內(nèi)累積[16-17]。

野生鐵皮石斛對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求非常苛刻，且由于人工長(zhǎng)期采挖和自然環(huán)境的破壞，使得鐵皮石斛成為瀕危藥用植物，被列入中國(guó)植物紅皮書[18]。鐵皮石斛在種植3年后會(huì)有成熟的標(biāo)志“封頂”，即莖桿頂端不再生長(zhǎng)，整個(gè)植株顏色加深。莖是鐵皮石斛的傳統(tǒng)食用部位，葉常常被拋棄，若對(duì)鐵皮石斛的葉加以研究和開(kāi)發(fā)，可以大大提高鐵皮石斛資源的利用率。

龍虎山地區(qū)氣候生態(tài)環(huán)境適合鐵皮石斛生長(zhǎng)，是我國(guó)野生鐵皮石斛主要分布地區(qū)之一。目前針對(duì)龍虎山鐵皮石斛資源的系統(tǒng)研究還未有報(bào)道。本文選取10種通過(guò)DNA條形碼技術(shù)鑒定的龍虎山鐵皮石斛[19]，從而避免了重復(fù)測(cè)定同一品種，其中4種為野生品種經(jīng)過(guò)人工種植1～3年的鐵皮石斛，6種為成熟的野生鐵皮石斛（因無(wú)法判斷野生鐵皮石斛的生長(zhǎng)年限，所以只采摘成熟的野生鐵皮石斛），對(duì)鐵皮石斛莖和葉的4類主要有效成分（多糖、甘露糖、生物堿和蛋白質(zhì)）含量和2種微量重金屬元素（砷和鎘）含量進(jìn)行測(cè)定，并運(yùn)用SPSS25軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，為鐵皮石斛資源的綜合利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料

DNA條形碼技術(shù)鑒定了10種龍虎山鐵皮石斛，其中6種為成熟的龍虎山野生鐵皮石斛，其編號(hào)分別 為：DOKM-4、DOKM-5、DOKM-12、DOKM-13、DOKM-19、DOKM-21；4種為種植1～3年的龍虎山鐵皮石斛，品種分別為：矮紅、米斛、青黑節(jié)、龍虎1號(hào)，其中種植3年的已成熟。

1.1.2 儀器與設(shè)備

AFS-8220型原子熒光光譜儀，北京吉天儀器有限公司；Agilent 1100型高效液相色譜儀，杭州賽析科技有限公司；7230型紫外分光光度計(jì)，上海渡揚(yáng)精密儀器有限公司；OLB9830型自動(dòng)凱氏定氮儀，濟(jì)南歐萊博科學(xué)儀器有限公司；GGX-6A原子吸收分光光度計(jì)，北京海光儀器有限公司；WFX-220A原子吸收分光光度計(jì)，北京瑞利分析儀器公司。

1.2 方法

1.2.1 營(yíng)養(yǎng)成分及微量元素測(cè)定

多糖含量：采用苯酚-硫酸法[20]測(cè)定；甘露糖含量：采用高效液相內(nèi)標(biāo)法[21]測(cè)定；生物堿含量：采用酸性染料比色法[22]測(cè)定；蛋白質(zhì)含量：采用凱氏定氮法[23]測(cè)定；砷含量：采用原子熒光光譜法[24]測(cè)定；鎘含量：采用原子吸收分光光度法[25]測(cè)定。

1.2.2 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)重復(fù)測(cè)定3次，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。采用SPSS25.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，均值間比較采用Duncan’s法。

2 結(jié)果與分析

2.1 營(yíng)養(yǎng)成分分析

2.1.1 成熟鐵皮石斛的營(yíng)養(yǎng)成分分析

成熟的野生和人工種植鐵皮石斛的營(yíng)養(yǎng)成分如物堿含量最高的分別是矮紅和龍虎1號(hào)。人工種植鐵皮石斛的生物堿含量高于野生鐵皮石斛，這是由于人工種植的鐵皮石斛在栽培過(guò)程中會(huì)施加氮肥，豐富的氮素營(yíng)養(yǎng)會(huì)促進(jìn)含氮次生代謝產(chǎn)物生物堿的合成[27]。成熟的種植鐵皮石斛莖的蛋白質(zhì)含量為2.72%～4.38%，含量最高的是龍虎1號(hào)，但龍虎1號(hào)與其他3種鐵皮石斛之間沒(méi)有顯著性差異；葉中蛋白質(zhì)含量高于莖，為12.73%～18.38%，含量最高的是龍虎1號(hào)，與其他鐵皮石斛之間具有顯著性差異（P＜0.05）。表1所示。在成熟鐵皮石斛莖中，多糖是其主要營(yíng)養(yǎng)成分，成熟的野生與人工種植鐵皮石斛莖中多糖含量為35.09%～49.59%，達(dá)到了《中華人民共和國(guó)藥典》（一部）的規(guī)定要求[26]（＞25.00%），葉中多糖含量為6.88%～14.05%，莖與葉部位多糖含量最高的都是米斛；莖中甘露糖含量為16.19%～25.12%，葉中甘露糖含量為11.10%～16.88%，莖、葉中甘露糖含量最高的分別是米斛和龍虎1號(hào)；莖中生物堿含量為0.158‰～0.251‰，葉中生物堿含量很低，為0.022‰～0.053‰，莖、葉中生

表1 成熟鐵皮石斛的營(yíng)養(yǎng)成分Table 1 Nutrients of mature Dendrobium officinale

2.1.2 不同種植年限鐵皮石斛的營(yíng)養(yǎng)成分分析

人工種植鐵皮石斛1～3年的營(yíng)養(yǎng)成分含量見(jiàn)表2。鐵皮石斛莖的多糖含量隨種植年限的增加而顯著增加（P＜0.05），而葉中多糖含量在不同年限中則無(wú)顯著性差異，這是由于多糖在葉中通過(guò)光合作用生成，運(yùn)輸并存儲(chǔ)至莖中。由于甘露糖是多種多糖的組成成分，因此莖中甘露糖含量變化規(guī)律與多糖相似，葉中甘露糖含量在第2年最高（P＜0.05）。莖中生物堿含量隨種植年限的增加而顯著增加（P＜0.05），葉中生物堿含量在第2年最高（P＜0.05）。莖和葉的蛋白質(zhì)含量都隨種植年限的增加而升高，且都具有顯著性差異（P＜0.05）。

表2 鐵皮石斛在不同種植年限的營(yíng)養(yǎng)成分Table 2 Nutritional compositions of Dendrobium officinale in different plantingyears

2.1.3 鐵皮石斛的砷、鎘含量分析

砷和鎘是植物非必需重金屬元素，《中華人民共和國(guó)藥典》（四部）中藥材砷和鎘的殘留限量指標(biāo)為：As≤2.0 mg/kg，Cd≤1 mg/kg[28]。鐵皮石斛中砷和鎘殘留超標(biāo)，會(huì)使其在食用和藥用時(shí)對(duì)人體產(chǎn)生一定危害。因此，測(cè)定鐵皮石斛的砷、鎘含量對(duì)鐵皮石斛的食用安全性具有一定實(shí)際意義。

野生鐵皮石斛和人工種植1～3年鐵皮石斛的砷、鎘成分含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果顯示：鐵皮石斛莖、葉中砷含量范圍分別為0.283～1.691 mg/kg、0.321～1.892 mg/kg；莖、葉中鎘含量范圍分別為0.021～0.234 mg/kg、0.013～0.165 mg/kg，10種鐵皮石斛的莖葉中砷、鎘含量均無(wú)超標(biāo)。人工種植鐵皮石斛的莖、葉中砷、鎘含量逐年顯著增加（P＜0.05），這是由于人工種植鐵皮石斛在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)使用化肥和農(nóng)藥，而化肥和農(nóng)藥含有微量的重金屬元素。野生鐵皮石斛的莖葉中砷、鎘含量與種植1年以上的鐵皮石斛相比顯著偏低（P＜0.05），總體上與種植1年的鐵皮石斛相差不大，這是由于野生鐵皮石斛的生長(zhǎng)環(huán)境一般在深山老林中，人為的重金屬污染來(lái)源較少。

表3 鐵皮石斛的砷、鎘含量Table3 Arsenic and cadmiumcontents of Dendrobium officinale 單位：mg/kg

2.2 鐵皮石斛莖樣品中6種成分的主成分分析

2.2.1 主成分篩選及貢獻(xiàn)率

由于鐵皮石斛莖樣品中各成分含量在量綱上存在較大差異，為了保障分析結(jié)果的客觀準(zhǔn)確性，利用SPSS25.0對(duì)原始試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后，再進(jìn)行主成分分析，得到主成分特征值及貢獻(xiàn)率，如表4所示。提取到2個(gè)主成分因子（特征值＞1），λ1=3.941，λ2=1.965，累積方差貢獻(xiàn)率98.443%，既包含了大部分成分信息，充分說(shuō)明這兩個(gè)主成分能夠代表鐵皮石斛6種成分含量的水平。

表4 主成分特征值與方差貢獻(xiàn)率Table 4 Principal components eigenvalues and variance contribution rates

以2個(gè)主成分為坐標(biāo)軸構(gòu)建主成分平面，將樣本的變量通過(guò)降維的方式投影在二維平面上，以觀察鐵皮石斛樣本的整體成分分布情況和各變量對(duì)樣本分布的貢獻(xiàn)大小，結(jié)果見(jiàn)表5。多糖、甘露糖和生物堿在第1主成分上有較高載荷，相關(guān)性強(qiáng)，主成分1集中反映了鐵皮石斛的藥用營(yíng)養(yǎng)成分含量的水平；蛋白質(zhì)、砷和鎘在主成分2上有較高載荷，相關(guān)性強(qiáng)，第2主成分反映了蛋白質(zhì)與重金屬含量的水平。

表5 主成分因子載荷矩陣Table 5 Principal componentsfactor matrix

2.2.2 主成分得分及綜合評(píng)分

用主成分因子矩陣的數(shù)據(jù)乘以相應(yīng)的方差的算術(shù)平方根，得到兩組主成分的特征向量，將特征向量與各成分標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)相乘，可得到鐵皮石斛的各主成分得分，各主成分解析表達(dá)式為：H1=0.477V1+0.488V2+0.482V3-0.387V4+0.200V5+0.335V6，H2=-0.220V1+0.141V2-0.195V3+0.450V4+0.646V5+0.523V6。其中：H1、H2分別是第1、2主成分得分；V1～V6分別為多糖、甘露糖、生物堿、蛋白質(zhì)、砷和鎘的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)。

以每個(gè)主成分所對(duì)應(yīng)的方差貢獻(xiàn)率為所占總主成分方差貢獻(xiàn)率的比值為權(quán)重，得到鐵皮石斛樣品的綜合評(píng)分表達(dá)式為：H0=0.667H1+0.333H2。主成分和排名結(jié)果見(jiàn)表6，10種鐵皮石斛樣品中以米斛的綜合得分最高，DOKM-5的綜合得分最低。

表6 主成分分析綜合得分及排序Table 6 Comprehensive scores and ranking of principal components analysis

2.3 聚類分析

為了更深層次研究不同品種鐵皮石斛成分之間的關(guān)系，以多糖、甘露糖、生物堿、蛋白質(zhì)、砷、鎘6種成分的含量為變量，利用SPSS25.0軟件對(duì)10種成熟鐵皮石斛的莖進(jìn)行聚類分析，圖1為鐵皮石斛莖的成分聚類分析。從聚類分析圖可以看出，當(dāng)平方歐氏距離為10時(shí)，10種鐵皮石斛被分為2大類，第I大類包括6種野生鐵皮石斛，第II大類包括4種植鐵皮石斛，說(shuō)明鐵皮石斛的成分含量差異與生長(zhǎng)環(huán)境有著密切的關(guān)系；當(dāng)平方歐氏距離為5時(shí)，10種鐵皮石斛則被分為3大類，第I大類依然是6種野生鐵皮石斛，第II大類包括米斛和龍虎1號(hào)，第III大類包括矮紅和青黑節(jié)，說(shuō)明在生長(zhǎng)環(huán)境相同時(shí)，鐵皮石斛各品種之間的成分含量也具有一定的差異。聚類分析將組分含量相近的鐵皮石斛聚到一類，可以更清楚地看出鐵皮石斛品種間的成分異同，從而方便對(duì)鐵皮石斛的某一成分實(shí)現(xiàn)針對(duì)性提取與利用。

圖1 鐵皮石斛的聚類分析Fig.1 Cluster analysis of Dendrobium of ficinale

3 結(jié)論

10種鐵皮石斛在莖和葉中的營(yíng)養(yǎng)成分及重金屬含量都存在明顯差異，其中莖和葉中多糖含量最高的都是米斛，甘露糖含量最高的是米斛和龍虎1號(hào)，生物堿含量最高的是矮紅和龍虎1號(hào)，蛋白質(zhì)含量最高的都是龍虎1號(hào)，成熟的野生鐵皮石斛的莖和葉中的砷、鎘含量均低于人工種植3年的鐵皮石斛。

從測(cè)定結(jié)果來(lái)看，成熟的人工種植鐵皮石斛莖和葉中各營(yíng)養(yǎng)成分含量均高于野生鐵皮石斛，說(shuō)明人工種植環(huán)境與野生環(huán)境對(duì)鐵皮石斛的營(yíng)養(yǎng)成分影響較大。這是由于野生鐵皮石斛的生長(zhǎng)環(huán)境惡劣，養(yǎng)分相對(duì)貧乏，而人工種植采用栽培基質(zhì)，環(huán)境適宜且養(yǎng)分及陽(yáng)光充足，有利于有機(jī)物質(zhì)的合成及積累。作為鐵皮石斛傳統(tǒng)食用部位的莖，其多糖、甘露糖、生物堿等營(yíng)養(yǎng)成分含量豐富；鐵皮石斛的葉往往沒(méi)有得到有效的利用，雖然鐵皮石斛葉中多糖、甘露糖、生物堿含量低于莖，但其葉中也含有豐富的多糖和甘露糖，且葉中蛋白質(zhì)含量高于莖，表明鐵皮石斛的葉也具有藥用價(jià)值和食用價(jià)值，若對(duì)鐵皮石斛的葉加以開(kāi)發(fā)和利用，可以提高鐵皮石斛資源的利用率。

主成分分析顯示2個(gè)主成分因子包含了10種鐵皮石斛莖中的6種成分含量水平，并根據(jù)主成分因子計(jì)算出各鐵皮石斛的綜合得分，綜合得分最高的是米斛，最低的是DOKM-5。聚類分析結(jié)果顯示，平方歐式距離為10時(shí)，野生與種植鐵皮石斛各被分為一類，說(shuō)明自然環(huán)境與種植環(huán)境的差異對(duì)鐵皮石斛的影響比較大；平方歐式距離為5時(shí)，野生鐵皮石斛被聚為一類，種植鐵皮石斛被聚為兩類，說(shuō)明鐵皮石斛品種之間成分含量上存在著一定的差異。本研究基于野生和種植鐵皮石斛成分的測(cè)定，并對(duì)主成分進(jìn)行主成分分析和聚類分析，有利于對(duì)鐵皮石斛的某一成分進(jìn)行特定研究，從而為龍虎山的鐵皮石斛資源的藥用價(jià)值、食用安全性和開(kāi)發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。