董萍萍，張加余，魏永利，兀 琦，徐 靜，李華健，代 龍*，王少平*

1.濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東 煙臺 264003

2.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟南 250300

3.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟南 250300

土鱉蟲，又稱土元，為鱉蠊科昆蟲地鱉Eupolyphaga sinensisWalker 或冀地鱉Steleophaga plancyi(Boleny)的雌蟲干燥體，主要用于治療跌打骨折、血瘀密閉等癥，中醫(yī)臨床定義其為破血逐瘀、續(xù)筋接骨之要藥[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，土鱉蟲具有抗血栓、調(diào)血脂、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等作用[2-5]。鑒于土鱉蟲傳統(tǒng)的口服給藥特點及人體消化道對蛋白質(zhì)藥物的消化吸收原理，本課題組前期采用胃蛋白酶和胰蛋白酶復(fù)合酶系對土鱉蟲進行仿生酶解，經(jīng)過除鹽、超濾、納濾、DA201-C 型大孔吸附樹脂、葡聚糖凝膠G-25 色譜、反相高效液相色譜以及半制備液相色譜等技術(shù)分離純化后，獲得纖溶活力最強的土鱉蟲活性肽組分F2，且F2 具有改善急性血瘀模型大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)、調(diào)節(jié)血脂和血液因子水平的作用[2,6]。

藥動學(xué)是反映藥物在機體內(nèi)吸收、分布、代謝、排泄全過程，并運用數(shù)理知識和方法論闡述血藥濃度變化的綜合知識體系[7]。隨著現(xiàn)代分析設(shè)備的普及與測試方法的更新，蛋白或活性肽類藥物在機體內(nèi)的變化也能夠被反映出來，如人體信使因子谷胱甘肽在體內(nèi)的分布和衰老的研究，可以借助123I、2H、13C 等放射性同位素標(biāo)記示蹤其活動規(guī)律[8-11]；藻酸雙酯鈉等多糖類藥物的多羥基酚酸類結(jié)構(gòu)體征，可以采用羅丹明、異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）和溴酚藍(lán)等有色極性溶劑進行絡(luò)合標(biāo)記[12]，進而基于絡(luò)合物發(fā)色光轉(zhuǎn)移的原理運用紫外分光光度法、熒光分析方法進行分析，得出其藥動學(xué)變化規(guī)律。因此，采用標(biāo)記示蹤技術(shù)可以實現(xiàn)蛋白或活性肽類藥物的體內(nèi)分析[13]。

本課題組前期研究表明，土鱉蟲活性肽F2 組分具有調(diào)血脂活性，但其所含單體活性肽序列以及體內(nèi)藥理作用尚未明確。本研究采用基質(zhì)輔助激光解析電離串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜（MADIL-TOF/TOF- MS）對前期純化得到的土鱉蟲單體活性肽進行肽序鑒定，對其中含量最高的活性肽LL8 用FITC 標(biāo)記后進行藥動學(xué)研究，并進行LL8的調(diào)血脂作用研究。

1 材料

1.1 動物

SPF 級雄性SD 大鼠，6 周齡，體質(zhì)量（200±10）g，購自山東省朋悅實驗動物繁育中心，動物許可證號SCXK（魯）20190003。動物飼養(yǎng)于SPF 級實驗動物中心，溫度22～26 ℃、相對濕度（50±2）%。動物實驗經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號SDUTCM20190515001）。

1.2 藥材

土鱉蟲（批號20190107）購自山東省長清土元養(yǎng)殖場，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)代龍教授鑒定為鱉蠊科冀地鱉S.plancyi(Boleny)的雌蟲干燥體。

1.3 藥品與試劑

去離子水購自浙江娃哈哈純凈水公司；辛伐他汀（批號J20180007）購自德國Merck 公司；乙醚（批號10009318）、無水乙醇（批號20181111）購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；水合氯醛（批號2018103001）購自成都市科隆化學(xué)品有限公司；總膽固醇（total cholesterol，TC）測定試劑盒（批號20190811）、三酰甘油（triglycerides，TG）測定試劑盒（批號20190709）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）測定試劑盒（批號20190529）購自南京建成生物工程研究所有限公司。

1.4 儀器

BPH-9082 型精密恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；HH-601 型超級恒溫水浴鍋（鎮(zhèn)江瑞祥儀器有限公司）；MS104 型十萬分一天平、MS105 型萬分之一天平（梅特勒-托利多國際貿(mào)易上海有限公司）；EnSpire 多模式微孔板檢測系統(tǒng)（珀金埃爾默企業(yè)管理上海有限公司，由山東省科學(xué)院分析測試中心提供）；TG20W 型臺式高速冷凍式離心機（博科精密儀器有限公司）；KQ2200DV 型超聲振蕩儀（杭州法蘭特超聲波科技有限公司）；Aμtoflex II 型MADIL-TOF/TOF-MS（德國布魯克工公司）；電子顯微鏡（日本尼康公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 LL8 氨基酸序列分析與結(jié)構(gòu)預(yù)測

采用MADIL-TOF/TOF-MS 對本課題組前期經(jīng)分離純化得到的土鱉蟲活性肽組分F2[9]進行氨基酸序列分析。LL8 二級質(zhì)譜圖見圖1，經(jīng)解析，其肽序為LAPAPGTL，即亮氨酸-丙氨酸-脯氨酸-丙氨酸-脯氨酸-甘氨酸-蘇氨酸-亮氨酸，命名為LL8。

圖1 LL8 二級質(zhì)譜圖Fig.1 Secondary mass spectrum of LL8

采用pepdraw（http://pepdraw.com/）、PEP- FOLD3 （ https://bioserv.rpbs.univ-paris-diderot.fr/ services/PEP-FOLD3/）在線對LL8 進行分子結(jié)構(gòu)和構(gòu)型預(yù)測（圖2），等電點為5.58，親水指數(shù)為33.806 72 kJ/moL，水溶性較好；空間結(jié)構(gòu)存在5個α 折疊。

圖2 LL8 氨基酸序列 (A) 及空間結(jié)構(gòu)預(yù)測 (B)Fig.2 Prediction of amino acid sequence (A) and spatial structure (B) of LL8

2.2 固相合成與熒光標(biāo)記

將分析出的肽段序列委托上海吉爾生物科技有限公司進行固相合成，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.5%。將合成的LL8活性肽委托上海摩爾生物科技有限公司采用FITC 對LL8 活性肽進行N段修飾，修飾后多肽序列為 FITC-{acp}-Leu-Ala-Pro-Ala-Pro-Gly-Thr- Leu，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞95%，其色譜圖見圖3。

圖3 FITC-LL8 純度檢測Fig.3 Purity test of FITC-LL8

2.3 LL8 在正常大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)研究

2.3.1 血漿樣品的制備 SD 大鼠乙醚麻醉后，眼眶取血置肝素鈉抗凝管中，2 次/d，每次2 mL，10 000 r/min 離心10 min，取上層血漿并合并，加入等體積十二烷基硫酸鈉溶液（0.1 mol/L）增敏，作為空白血漿溶液備用。

2.3.2 方法學(xué)考察

（1）線性考察：精密稱取FITC-LL8 10 mg，采用空白血漿溶解，制備成一系列不同質(zhì)量濃度的FITC-LL8 血漿溶液，以490 nm 為激發(fā)波長，525 nm為發(fā)射波長，采用酶標(biāo)儀測定吸光度（A）值。以空白血漿溶液A值作為空白，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），A為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為Y＝2 760.9X＋464.63，R2＝0.999 1。FITC-LL8 在0.195 3～50.000 0 μg/mL 具有良好的線性關(guān)系，定量限為0.195 3 μg/mL。

（2）日間、日內(nèi)精密度考察：精密稱取FITC-LL8 適量，用空白血漿溶解，分別配制成質(zhì)量濃度為50.0、25.0、12.5 μg/mL 的溶液，標(biāo)記為LL8高、中、低3 個質(zhì)量濃度。采用酶標(biāo)儀測定A值，各質(zhì)量濃度樣本平行測定6 次并連續(xù)測定5 d，計算3 個質(zhì)量濃度的日內(nèi)精密度及日間精密度。結(jié)果顯示，LL8 3 個質(zhì)量濃度的日內(nèi)精密度RSD 值分別為0.28%、0.74%、1.08%，日間精密度RSD 值為1.99%、1.21%、1.87%。

（3）準(zhǔn)確度考察：精密稱取FITC-LL8 適量，以空白血漿溶解，分別配制成質(zhì)量濃度為50.0、25.0、12.5 μg/mL 的溶液，標(biāo)記為LL8 高、中、低3 個質(zhì)量濃度。采用酶標(biāo)儀測定A值，平行測定3次，計算各溶液的回收率。結(jié)果顯示，LL8 3 個質(zhì)量濃度的回收率分別為100.23%、99.03%、101.23%，RSD 值分別為1.03%、0.34%、0.57%。

（4）穩(wěn)定性試驗：精密稱取FITC-LL8，加入空白血漿配制成質(zhì)量濃度為50 μg/mL 的溶液。采用酶標(biāo)儀在0、60、180、240、600、720 min 對溶液進行測定，記錄各時間點下樣品的A值，計算RSD值為0.199%，表明血漿穩(wěn)定性良好。

（5）加樣回收率試驗：取FITC-LL8，加入1 mL大鼠新鮮血液，配制6 份質(zhì)量濃度為50 μg/mL 的溶液。充分混勻后，按“2.3.1”項下方法處理，采用酶標(biāo)儀測定A值。結(jié)果顯示，加樣回收率為97.63%～100.15%，平均加樣回收率為99.29%，RSD值為0.88%。

（6）反復(fù)凍融條件下的含量變化：取FITC-LL8，溶于5 mL 空白血漿，配制成質(zhì)量濃度為25 μg/mL 的溶液，測定A值；于 ?80 ℃超低溫冰箱存放15 d 后，測定A值；再于 ?80 ℃超低溫冰箱放置15 d 后，測定A值。結(jié)果顯示，經(jīng)過2 次凍融后，第15 天和第30 天3 次測定結(jié)果的RSD 值分別為0.08%、0.21%，表明FITC-LL8 不會在反復(fù)凍融下發(fā)生熒光減弱現(xiàn)象。

2.3.3 藥動學(xué)研究 12 只SD 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，實驗前禁食 12 h，自由飲水。大鼠隨機分成FITC-LL8 高、低劑量（10、5 mg/kg）組，每組6只；各給藥組im 相應(yīng)藥物，于不同時間點采集血液，按“2.3.1”項方法處理，采用酶標(biāo)儀測定A值。以時間為橫坐標(biāo)（X），血藥濃度為縱坐標(biāo)（Y），繪制血藥濃度-時間曲線。采用DAS 2.0 軟件結(jié)合最小偏二乘法計算藥動學(xué)參數(shù)，以非房室模型分析法進行數(shù)據(jù)分析；采用SPSS 26.0 軟件對藥動學(xué)結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析；Graphpad Prism 8.0.2 軟件繪制曲線圖。FITC-LL8 血藥濃度-時間曲線見圖4，主要藥動學(xué)參數(shù)見表1。

圖4 正常大鼠im FITC-LL8 的藥-時曲線 ( ± s , n=6)Fig.4 Drug-time curve of im FITC-LL8 in normal rats ( ± s , n=6)

表 1 FITC-LL8 在正常大鼠體內(nèi)的主要藥動學(xué)參數(shù) ( ± s , n=6)Table 1 Main pharmacokinetic parameters of FITC-LL8 in normal rats ( ± s , n=6)

表 1 FITC-LL8 在正常大鼠體內(nèi)的主要藥動學(xué)參數(shù) ( ± s , n=6)Table 1 Main pharmacokinetic parameters of FITC-LL8 in normal rats ( ± s , n=6)

參數(shù) 單位 FITC-LL8 10 mg·kg?1 5 mg·kg?1 37.89±1.49 34.97±3.11 t1/2 min AUC0～∞ μg·mL?1·min?1 4 082.60±34.83 2 007.30±19.06 MRT0～∞ min 79.15±4.31 72.60±3.43 CL/F mL·min?1·kg?1 3.65±0.33 4.26±0.19 V/F mL·kg?1 316.34±5.29 307.28±3.11 Cmax μg·kg?1 78.86±0.23 40.24±0.35 tmax min 30.00 30.00

2.4 LL8 對高脂血癥大鼠的調(diào)脂作用研究

2.4.1 高脂血癥模型的制備 48 只SD 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，隨機分為對照組、模型組、辛伐他?。?00 mg/kg）組、土鱉蟲（3 g/kg）組和LL8 高、低劑量（50、25 mg/kg）組，每組8 只。對照組大鼠給予普通飼料，其余各組給予高脂飼料。第45 天于20: 00時禁食，第46 天8: 00 時各組大鼠眼眶取血1 mL，測定血漿中TC 和TG 水平，若模型組與對照組之間 有顯著性差異，則確定高血脂癥大鼠模型制備成功。

2.4.2 給藥 辛伐他汀溶于0.9%氯化鈉溶液，配制成質(zhì)量濃度為4 mg/mL 的溶液；土鱉蟲溶于0.9%氯化鈉溶液，配制成質(zhì)量濃度為0.6 g/mL 的溶液；LL8 溶于0.9%氯化鈉溶液，分別配制成質(zhì)量濃度為10、5 mg/mL 的溶液。造模成功后，各給藥組ig 2 mL相應(yīng)藥物，對照組和模型組ig 等體積0.9%氯化鈉溶液，1 次/d，連續(xù)3 周。

2.4.3 LL8 對高脂血癥大鼠血漿中TC、TG 和LDL-C 水平的影響 給藥結(jié)束后，大鼠禁食12 h，不禁水，ip 10%水合氯醛麻醉，腹主動脈取血，置肝素鈉抗凝試管中，3500 r/min 離心10 min，取上層血漿，按試劑盒說明書檢測大鼠血漿中TC、TG和LDL-C 水平。如圖5 所示，與對照組比較，模型組大鼠血漿中TC、TG 和LDL-C 水平均顯著升高（P＜0.05、0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠血漿中TC 和TG 水平均顯著降低（P＜0.05），LL8各劑量組大鼠血漿中LDL-C 水平顯著降低（P＜0.05）。

圖5 LL8 對高脂血癥大鼠血漿中TC、TG 和LDL-C 水平的影響 ( ± s , n=8)Fig.5 Effect of LL8 on levels of TC, TG and LDL-C in plasma of hyperlipidemia rats ( ± s , n=8)

2.4.4 LL8 對高脂血癥大鼠肝臟組織中TC 和TG水平的影響 大鼠脫頸椎處死，取肝臟組織，加入甲醇-氯仿（2∶1）混合溶劑制成5%的勻漿液，按試劑盒說明書檢測大鼠肝臟組織中TC 和TG 水平。如圖6 所示，與對照組比較，模型組大鼠肝臟TC和TG 水平明顯升高（P＜0.05、0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠肝臟TC 和TG 水平均顯著降低（P＜0.05、0.01）。

圖6 LL8 對高脂血癥大鼠肝臟TC 和TG 含量的影響 ( ± s , n=8)Fig.6 Effect of LL8 on levels of TC and TG in liver of hyperlipidemia rats ( ± s , n=8)

2.4.5 LL8 對高脂血癥大鼠肝臟組織病理變化的影響 取各組大鼠肝臟組織，于4%多聚甲醛溶液中固定，梯度乙醇脫水后包埋并切片，進行蘇木素-伊紅（HE）染色，于顯微鏡下觀察肝臟組織中脂肪變性情況[14-16]。如圖7 所示，對照組大鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)正常，染色均勻分布，細(xì)胞排列整齊清晰，質(zhì) 核均勻，肝竇清晰，偶有極細(xì)微脂肪顆粒；模型組大鼠肝臟組織發(fā)生脂肪變性，細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞核被擠壓于細(xì)胞一側(cè)，細(xì)胞間隙與細(xì)胞質(zhì)之間具有較多脂肪滴，出現(xiàn)了脂質(zhì)沉積，且有大小不等的脂肪空泡；與模型組大鼠相比，辛伐他汀組與LL8 高劑量大鼠肝細(xì)胞排列明顯改善，肝竇結(jié)構(gòu)清晰，無明顯脂滴，肝細(xì)胞受損情況顯著改善；LL8 低劑量組肝細(xì)胞的結(jié)構(gòu)中脂滴數(shù)量顯著減少，細(xì)胞排列明顯改善，但仍見脂質(zhì)空泡；土鱉蟲組大鼠肝細(xì)胞腫脹程度較模型組輕，仍見脂質(zhì)空泡，脂滴多分布于細(xì)胞間隙，細(xì)胞質(zhì)中脂滴顯著減少。

圖7 LL8 對高脂血癥大鼠肝臟病理變化的影響 (HE, ×100)Fig.7 Effect of LL8 on pathological changes of liver in hyperlipidemia rats (HE, × 100)

3 討論

目前阿加曲班[17]、利拉魯肽[18]等活性肽類藥物的主要給藥方式為iv，活性肽類藥物在胃腸道內(nèi)易被消化酶酶解再次形成小分子肽，導(dǎo)致活性肽結(jié)構(gòu)破壞而失去藥效。因此，本研究通過im 土鱉蟲活性肽LL8，從而減少腸道未知因素帶來的實驗誤差。高脂飲食是誘發(fā)高脂血癥的主要因素，本研究采用喂食高脂飼料成功誘導(dǎo)了高脂血模型大鼠，結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組大鼠血漿中TC、TG 和LDL-C 水平明顯升高，同時高脂飼料的長期攝入導(dǎo)致進入大鼠肝臟的脂質(zhì)物質(zhì)過多，超過肝臟代謝能力，導(dǎo)致肝臟脂類代謝失衡，造成肝臟內(nèi)TC 和TG水平升高；LL8 能夠降低高血脂癥大鼠血漿中TC、TG 和LDL-C 水平以及肝臟中TC 和TG 水平；LL8能夠顯著改善肝組織脂肪變性與肝臟病變，減少肝臟脂滴與脂質(zhì)空泡，表明LL8 可以改善高脂血癥大鼠血脂紊亂情況，且具有較強的肝臟保護作用。

本研究采用熒光素標(biāo)記示蹤方法對LL8進行藥動學(xué)研究，結(jié)果顯示，高、低劑量LL8 在正常大鼠體內(nèi)的半衰期相近，屬于快速代謝型藥物?；钚噪乃幬飅v 時半衰期短的原因主要為：①體內(nèi)多組合蛋白酶對活性肽藥物進行急速水解，導(dǎo)致血藥濃度驟降；②基于“相似相容”原理，活性肽類藥物因與機體成分相似，較其他植物性成分代謝速度快，引起半衰期短[19-20]。目前主要通過末端修飾、形成環(huán)肽及螺旋結(jié)構(gòu)修飾、物理包裹等[21-22]方法，從而解決活性肽類藥物不能長期留存體內(nèi)的問題。

與植物活性成分藥動學(xué)研究方法不同，活性肽類藥物沒有特定的結(jié)構(gòu)母核，在目前的常規(guī)檢測手段下很難被正常計算出來，借助于發(fā)色熒光物質(zhì)的標(biāo)記，并采用先進儀器分析是主流方法[23-24]。但隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的普及，借助于納流液相色譜儀Easy LC II 串聯(lián)高分辨質(zhì)譜（Nano Easy LC Ⅱ-HRMS）對血液中全肽段進行痕量分析，可以明確iv 時活性肽藥物的吸收、分布、代謝等情況。

與尿激酶等大分子蛋白類藥物相比，LL8 的藥物平均滯留時間短[25]，通過藥動學(xué)實驗結(jié)果，結(jié)合藥物相對分子質(zhì)量大小，后期需對LL8 進行結(jié)構(gòu)修飾，在保證藥效與安全的用藥基礎(chǔ)上增加藥物在體內(nèi)保留時間和藥物半衰期。為闡明LL8 在大鼠體內(nèi)的代謝、排泄與組織分布情況，課題組后期將對LL8在正常SD 大鼠體內(nèi)的排泄、代謝及其分布進行系統(tǒng)研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突