王 銳,李婭蘭,李建月,楊 婧
1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),黑龍江 哈爾濱 150040
2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150040
乙型病毒性肝炎是由乙肝病毒誘發(fā)的以肝臟病變?yōu)橹鞯膫魅拘约膊 S墒澜缧l(wèi)生組織統(tǒng)計報道全球慢性乙肝病毒患者約有2.57 億,且88.7 萬人因感染乙肝病毒而死亡,中國乙肝病毒患者約9300 萬例,其中慢性乙型肝炎病患約2000 萬例[1-2]。小干擾RNA(siRNA)技術(shù)廣泛應(yīng)用于乙肝病毒的治療。但裸siRNA 生物半衰期短,容易被胞漿、血液和組織中的酶類降解,生物利用度低。細(xì)胞膜表面帶有負(fù)電荷,且siRNA 是帶有負(fù)電荷的親水性物質(zhì),因此,siRNA 進(jìn)入細(xì)胞需要載體介導(dǎo)。北五味子具備護(hù)肝的功能,目前對于木脂素的研究較為廣泛,對于北五味子油的研究較少,牛莉萍[3]研究發(fā)現(xiàn)北五味子油可通過增加HepG2 細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)含量而達(dá)到使HepG2 細(xì)胞凋亡的功能。脂質(zhì)體作為一種非病毒載體具有無傳染性、無載體容量制約、化學(xué)結(jié)構(gòu)可操控,無致瘤危險和抗原性[4-7]。siRNA 為水溶性物質(zhì),利用陽離子脂質(zhì)體可同時裝載水溶性物質(zhì)和脂溶性物質(zhì)的特點,選取具有保肝作用的北五味子提取物五味子油[8-9],將兩者同時裝載于陽離子脂質(zhì)體內(nèi),探究五味子油是否可協(xié)同乙型肝炎型小干擾RNA(HBx-siRNA),以達(dá)到更好的抑制乙肝病毒的功效。
OSB-2200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,日本EYELA 株式會社;超聲細(xì)胞破碎儀,美國SONICS公司;SYNERGY H1酶聯(lián)免疫檢測儀,美國伯騰儀器有限公司;JEM-2100 透射電子顯微鏡(TEM),日本電子株式會社;U-CTR30-2 熒光倒置顯微鏡,德國徠卡公司;粒徑電位儀,北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;CFX ConnectTM熒光定量PCRA 儀,美國BIO-RAD 公司;DW-86L386 ?80 ℃低溫冰箱,美國Thermo 公司;生物分光光度計、離心機(jī),Eppendorf 公司;渦旋振蕩儀,海門市其林貝爾儀器制造有限公司。
五味子油,江西森海植物油有限公司,批號20181022,檢測報告:橙黃色透明油狀液體,氣清香,相對密度0.972 0~0.992 0,折光率1.492 0~1.568 0,酸值≤20 mg KOH/g,砷鹽≤0.2 μg/kg,重金屬≤0.001 mg/kg,亞油酸≥10%,五味子甲素≥2.0%。(2,3-二油氧基-丙基)三甲基氯乙銨(N-[1-(2,3- dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium chloride,DOTAP),上海斯信生物有限公司,批號RD-01173;氯仿、異丙醇、無水乙醇,天津市永大化學(xué)試劑有限公司;膽固醇,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號20130618;透明質(zhì)酸(批號H02N8J47121)、魚精蛋白(批號Z31O8H47046)、二硬脂?;字R掖及?聚乙二醇 2000(DSPE-PEG2000,批號P31M8S32960),上海源葉生物科技有限公司;siRNA(序列見表1)、熒光標(biāo)記的siRNA(FAM- siRNA),蘇州吉瑪基因股份有限公司;經(jīng)焦碳酸二乙酯處理過的高溫消毒的水(DEPC),北京博奧拓達(dá)科技有限公司,批號PM11649;二甲基亞砜,上海索萊寶生物科技有限公司,批號D8418;MEM培養(yǎng)基,HyClone 公司,批號AE27142269;胰酶細(xì)胞消化液,碧云天生物技術(shù)有限公司,批號C0201;無菌PBS,北京博奧拓達(dá)科技有限公司,批號180523;胎牛血清,賽澳美細(xì)胞技術(shù)有限公司,批號20180522;雙抗,美國Gibco 公司,批號J150038;MTT,賽國生物科技有限公司,批號EZ3455C328。
表1 siRNA 序列Table 1 siRNA sequence
1.3.1 細(xì)胞株 HepG2.2.15 表達(dá)HBV 病毒的人肝細(xì)胞,購于上海中喬新舟生物科技有限公司。
1.3.2 培養(yǎng)基 α-MEM+10% FBS+1%雙抗+1%丙酮酸鈉,在37 ℃,5% CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)。
稱量DOTAP 和膽固醇放置到圓底燒瓶內(nèi),量取適量的CHCl3溶解。置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上除去CHCl3,待燒瓶內(nèi)壁形成一層脂質(zhì)體薄膜即可。加入適量的0.1% DEPC 水溶液洗下薄膜。超聲處理30 min,加入五味子油,細(xì)胞破碎儀下超聲60 s,再緩慢多次通過0.45 μm 濾膜,即得五味子油陽離子脂質(zhì)體[10]。
量取處方量0.1% DEPC 水溶液,充分震搖使HBx-siRNA 溶解均勻。將siRAN 溶液與等體積的透明質(zhì)酸混合,震蕩均勻,加入適量的魚精蛋白,充分混合配制好的載五味子油的陽離子脂質(zhì)體,加入適量的DSPE-PEG2000,即制成共載HBx-siRNA與五味子油陽離子脂質(zhì)體納米粒。
2.2.1 膜材比對包封率的影響 膜材比為陽離子脂質(zhì)體的成膜成分DOTAP 與膽固醇的質(zhì)量比,選擇藥脂比1∶5、超聲時間50 min、旋蒸溫度30 ℃,使得膜材比為5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1,按照“2.1”項下方法制備五味子油陽離子脂質(zhì)體,考察包封率的變化,結(jié)果包封率分別為(64.45±0.28)%、(73.42±0.65)%、(79.54±0.44)%、(75.40±0.34)%、(70.38±0.46)%(n=3)。膜材比為4∶1、3∶1、2∶1 時脂質(zhì)體的包封率較高,故選取4∶1、3∶1、2∶1 為膜材比的3 個水平,進(jìn)行后續(xù)考察。
2.2.2 藥脂比對包封率的影響 選擇膜材比3∶1、超聲時間50 min、旋蒸溫度30 ℃,制備五味子油與脂質(zhì)體的質(zhì)量比為1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7 時,按照“2.1”項下方法制備五味子油陽離子脂質(zhì)體,考察脂質(zhì)體包封率的變化,結(jié)果包封率分別為(69.54±0.32)%、(75.32±0.45)%、(89.56± 0.44)%、(91.12±0.43)%、(93.32±0.28)% (n=3)。脂質(zhì)體與五味子油的質(zhì)量比越大,五味子油陽離子脂質(zhì)體的包封率越大;反之,質(zhì)量比越小,包封率越小。綜合考慮載藥量以及包封率,選擇1∶4、1∶5、1∶6 為藥脂比的3 個水平。
2.2.3 超聲時間對包封率的影響 選擇膜材比3∶1、藥脂比1∶5、旋蒸溫度30 ℃,改變超聲時間分別為40、50、60、70、80 min,按照“2.1”項下方法制備五味子油陽離子脂質(zhì)體,結(jié)果包封率分別為(75.82±0.48)%、(80.93±0.25)%、(86.44±0.44)%、(83.72±0.56)%、(81.22±0.37)%(n=3)。超聲時間為50、60、70 min 時脂質(zhì)體的包封率較高,故選擇50、60、70 min 為超聲時間3 水平。
2.2.4 旋蒸溫度對包封率的影響 固定膜材比3∶1、藥脂比1∶5、超聲時間50 min,改變旋蒸溫度分別為20、30、40、50、60 ℃,按照“2.1”項下方法制備五味子油陽離子脂質(zhì)體,結(jié)果包封率分別為(81.32±0.47)%、(83.66±0.48)%、(83.12±0.72)%、(82.52±0.32)%、(80.47±0.43)% (n=3)。旋蒸溫度為20、30、40 ℃時包封率較高,在30 ℃時包封率最高,因此,選取30 ℃為最優(yōu)溫度(相比于其他單因素條件,旋蒸溫度影響包封率的范圍很小,故不必進(jìn)一步優(yōu)化)。
2.3.1 實驗設(shè)計與結(jié)果 根據(jù)單因素實驗分析得出,改變旋蒸溫度,得到的相鄰包封率差值較小,故旋蒸溫度對五味子油陽離子脂質(zhì)體的包封率影響不大,因此,以單因素考察實驗為依據(jù),設(shè)定膜材比(X1)、藥脂比(X2)、超聲時間(X3)為考察因素,以五味子油包封率(Y)為評價指標(biāo),每個因素設(shè)置5 水平。分別用代碼?α、?1、0、+1、+α 表示,對于3 因素的星點設(shè)計,α=1.682。實驗因素與水平安排及結(jié)果見表2。
2.3.2 模型擬合 通過Design Expert 8.0 軟件分別對各因素的各水平進(jìn)行二次多項式方程擬合。并根據(jù)方程通過Design Expert 8.0 軟件繪出三維效應(yīng)面和二維等高線,選取較優(yōu)組合。二次多項式方程擬合結(jié)果為Y=?597.656 36+51.565 46X1+59.731 83X2+12.217 04X3-3.058 24X1X2+0.440 88X1X3+0.787 36X2X3-11.404 24X12-10.239 24X22- 0.121 49X32,P<0.05,R2=0.876 5,回歸方程關(guān)系顯著,符合要求。方差結(jié)果分析見表3。
結(jié)果分析,Y模型項P<0.05,證明所得回歸方程效果顯著。在Y模型方程中,X3、X2X3、X12、X22、X32都是顯著項,是Y的顯著影響因素。使用Statistica 6.0 軟件處理后得到二維等高線及三維效應(yīng)面圖,確定最優(yōu)方案為膜材比為3∶1,藥脂比為1∶5,超聲時間為70 min。結(jié)果見圖1。
2.3.3 最佳工藝 采用薄膜分散法,稱取DOTAP和膽固醇的質(zhì)量比為3∶1,圓底燒瓶中加入適量的三氯甲烷,30 ℃旋蒸成薄膜,真空干燥2 h 后超聲處理30 min,稱取五味子油與脂質(zhì)體的比為1∶5,超聲70 min,取凍存的HBx-siRAN,4000 r/min 離心1 min,加入0.1% DEPC 溶解。取含有25 μg H B x-s i R A N 的溶液加入等質(zhì)量的透明質(zhì)酸(hyaluronic acid,HA)溶液混合形成HA-siRNA。
以HA-siRNA 與PRTM 的質(zhì)量比為1∶1 進(jìn)行均勻混合,得到HA-siRNA-PRTM 復(fù)合物。在該復(fù)合物中加入50 μL 的載五味子油脂質(zhì)體,10 min 后加入50 μL DSPE-PEG2000,在50 ℃水浴鍋中靜置10 min。共載HBx-siRAN 與五味子油陽離子脂質(zhì)體納米粒制備完成。
表2 星點設(shè)計-效應(yīng)面法實驗因素水平安排及結(jié)果Table 2 Horizontal arrangement and result of experimental factors in star point design-response surface method
表3 方差分析結(jié)果Table 3 Results of variance analysis
圖1 膜材比 (X1)、藥脂比 (X2)、超聲時間 (X3) 對包封率的三維效應(yīng)面和二維等高線圖Fig.1 Three-dimensional effect surface and two-dimensional contour map of membrane material ratio (X1), drug-lipid ratio (X2) and ultrasonic time (X3) on entrapment efficiency
2.3.4 最佳工藝驗證 按照星點設(shè)計-效應(yīng)面法篩選出最佳的載五味子油脂質(zhì)體的制備工藝,按照最佳工藝制備測定包封率,并把實測值與預(yù)測值對比,計算兩數(shù)值之間的誤差,如表4,載五味子油陽離子脂質(zhì)體包封率的預(yù)測值與實測值的相對偏差小于5%,證明該工藝準(zhǔn)確可靠,重復(fù)性良好,星點設(shè)計實驗所建立的數(shù)學(xué)模型預(yù)測性良好。課題組前期研究表明,HA-siRNA 與魚精蛋白最佳質(zhì)量比為1.0∶1.0 時,復(fù)合物為帶有負(fù)電荷的較小微粒。復(fù)合物HBx-siRNA 的載藥量為25 μg 時,加入包和五味子油陽離子脂質(zhì)體為50 μL 時,制備工藝最佳。
表4 實測值與預(yù)測值比較Table 4 Comparison of measured and predicted values
2.4.1 電位、粒徑及形態(tài)的測定 按照“2.3.3”最佳工藝制備共載HBx-siRNA 與五味子油陽離子脂質(zhì)體納米粒樣品,分別取適量樣品加到比色皿和樣品池內(nèi),用電位粒徑儀檢測粒徑和Zeta 電位[11-12]。測得共載HBx-siRNA 與五味子油陽離子脂質(zhì)體納米粒的粒徑為(134.000±0.035)nm,多分散指數(shù)(PDI)為0.320±0.022,Zeta 電位為(44.000± 0.027)mV。
2.4.2 透射電鏡觀察脂質(zhì)體外觀 按照“2.3.3”項下最佳工藝制備共載HBx-siRNA 與五味子油陽離子脂質(zhì)體納米粒樣品,取5 μL 滴加在銅網(wǎng)上,室溫靜置至干燥,將銅網(wǎng)置于TEM 下觀察脂質(zhì)體的形態(tài)。并用TEM 觀察觀察脂質(zhì)體形態(tài),結(jié)果見圖2,共載HBx-siRNA 與五味子油陽離子脂質(zhì)體納米粒呈不規(guī)則的類圓形。
圖2 脂質(zhì)體TEM 圖Fig.2 TEM of liposome
2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 將熒光標(biāo)記的HBx-siRNA (FAM-HBx-siRAN)溶解在適量的0.1% DEPC 水中制備成FAM-siRNA 儲備溶液。取0.1% DEPC 水將儲備液分別稀釋成0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 μg/μL 質(zhì)量濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。492 nm 波長下,通過酶標(biāo)儀測定每組吸光度(A)值。得到方程Y=1 005.4X+119.21,R2=0.997 4。由方程可知,A值與FAM-HBx-siRNA 質(zhì)量濃度在0.05~0.30 μg/μL 具有良好的線性關(guān)系。
2.5.2 包封率和載藥量的測定 按照最佳工藝制備共載FAM-HBx-siRNA 與五味子油陽離子脂質(zhì)體納米粒。取適量的溶液進(jìn)行離心(4000 r/min),取上清液,在492 nm 條件下,采用多功能酶標(biāo)儀測定A值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出游離FAM-HBx-siRNA質(zhì)量濃度(C),計算包封率和載藥量。
檢測結(jié)果見表5,共載FAM-HBx-siRNA 與五味子油脂質(zhì)體納米粒的包封率為(81.37±0.08)%,載藥量為(16.25±0.06)%,證明HBx-siRNA 和五味子油在脂質(zhì)體中具有較好的包封率和載藥量。
表5 載HBx siRNA 與五味子油陽離子脂質(zhì)體納米粒包封率和載藥量Table 5 Encapsulation rate and drug loading of cationic liposome nanoparticles loaded with HBx siRNA and SCF oil
2.6.1 MTT 檢測細(xì)胞增殖抑制實驗 將HepG 2.2.15 細(xì)胞接種于96 孔板內(nèi),并使每孔含有細(xì)胞懸液100 μL。將96 孔板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)放置24 h,至HepG2.2.15 細(xì)胞單層平鋪孔底,棄去原培養(yǎng)基。加入制備好的濃度為20、40、60、80、100 nmol/L的共載HBx-siRNA 與五味子油的陽離子脂質(zhì)體納米粒,選取0 nmol/L 濃度作為對照組,每組設(shè)3 個復(fù)孔。放入條件為37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi),放置24、48 h。
同上分別加入載五味子油、載HBx-siRNA、共載HBx-siRNA 與五味子油的陽離子脂質(zhì)體納米粒α-MEM 基本培養(yǎng)基100 μL。以100 μL 空白陽離子脂質(zhì)體α-MEM 基本培養(yǎng)基作為對照組,每一組設(shè)置3 個復(fù)孔。放入條件為37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi),放置24、48 h。使用酶標(biāo)儀,檢測各孔A值,并記下各組數(shù)據(jù)。
如表6 所示,在給藥24 h 后,20、40、60、80、100 nmol/L 濃度的共載HBx-siRNA 與五味子油脂質(zhì)體納米粒對 HepG2.2.15 細(xì)胞抑制率分別是7.97%、20.10%、37.98%、45.73%、54.63%。在給藥48 h 后,20、40、60、80、100 nmol/L 濃度的共載 HBx-siRNA 與五味子油脂質(zhì)體納米粒對HepG2.2.15 細(xì)胞抑制率分別是17.84%、33.33%、56.47%、68.87%、74.38%。說明共載HBx-siRNA與五味子油脂質(zhì)體納米粒對HepG2.2.15 細(xì)胞增殖的抑制具有劑量相關(guān)性。通過細(xì)胞增殖抑制率計算公式(抑制率=1-A加藥/A對照),計算得共載HBx- siRNA 與五味子油脂質(zhì)體納米粒在24、48 h 抑制HepG2.2.15 細(xì)胞增殖50%時的藥物濃度(IC50)分別為53.5、107.4 nmol/L。因此,在后續(xù)各實驗時共載脂質(zhì)體納米粒的濃度選定為100 nmol/L。
表6 不同濃度陽離子脂質(zhì)體納米粒對HepG2.2.15 細(xì)胞增殖的抑制作用 ( ± s, n = 3)Table 6 Inhibition of HepG2.2.15 cell proliferation by cationic liposome nanoparticles with different concentrations ( ± s,n = 3)
表6 不同濃度陽離子脂質(zhì)體納米粒對HepG2.2.15 細(xì)胞增殖的抑制作用 ( ± s, n = 3)Table 6 Inhibition of HepG2.2.15 cell proliferation by cationic liposome nanoparticles with different concentrations ( ± s,n = 3)
與對照組比較:*P<0.05,表7~9 同*P < 0.05 vs negative control group, same as table 7—9
濃度/ 24 h 48 h 組別 (nmol·L?1) A 值 抑制率/% A 值 抑制率/% 對照 ? 1.393±0.025 ? 1.452±0.022 ? 共載HBx-siRNA 與 20 1.282±0.031* 7.97 1.193±0.035* 17.84 五味子油陽離子 40 1.113±0.048* 20.10 0.968±0.045* 33.33 脂質(zhì)體納米粒 60 0.864±0.034* 37.98 0.632±0.027* 56.47 80 0.756±0.051* 45.73 0.452±0.023* 68.87 100 0.632±0.025* 54.63 0.372±0.031* 74.38
如表7 所示,在給藥后24 h 時,載五味子油陽離子脂質(zhì)體組的抑制率為20.22%,載HBx-siRNA組的抑制率為42.82%,共載HBx-siRNA 與五味子油陽離子脂質(zhì)體組的抑制率為52.78%。在給藥后48 h 時,各組的抑制率明顯增加,載五味子油陽離子脂質(zhì)體組的抑制率為25.10%,載HBx-siRNA 組的抑制率為59.26%,共載HBx-siRNA 與五味子油陽離子脂質(zhì)體組的抑制率為73.59%。與陰性對照組
表7 陽離子脂質(zhì)體納米粒對HepG2.2.15 細(xì)胞增殖的抑制作用 ( ± s, n = 3)Table 7 Inhibition of cationic liposome nanoparticles on the proliferation of HepG2.2.15 cells ( ± s, n = 3)
表7 陽離子脂質(zhì)體納米粒對HepG2.2.15 細(xì)胞增殖的抑制作用 ( ± s, n = 3)Table 7 Inhibition of cationic liposome nanoparticles on the proliferation of HepG2.2.15 cells ( ± s, n = 3)
組別 24 h 48 h A 值 抑制率/% A 值 抑制率/% 對照 1.385±0.022 ? 1.458±0.032 ? 載五味子油陽離子脂質(zhì)體 1.105±0.037* 20.22 1.092±0.043* 25.10 載HBx-siRNA 0.794±0.026* 42.82 0.594±0.027* 59.26 共載HBx-siRNA 與五味子油陽離子脂質(zhì)體 0.654±0.018* 52.78 0.385±0.028* 73.59
(空白陽離子脂質(zhì)體組)進(jìn)行對比,各組都具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。由實驗數(shù)據(jù)可知,在相同的給藥時間內(nèi),共載HBx-siRNA 與五味子油陽離子脂質(zhì)體組的抑制率大于載HBx-siRNA 組大于載五味子油陽離子脂質(zhì)體組大于陰性對照組。共載HBx- siRNA 與五味子油陽離子脂質(zhì)體納米粒對HepG 2.2.15 細(xì)胞的增殖具有較好的抑制作用。
2.6.2 劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移能力 給藥組分別加入載五味子油陽離子脂質(zhì)體、載HBx-siRNA、共載HBx-siRNA 與五味子油陽離子脂質(zhì)體納米粒含1% FBS 的α-MEM 培養(yǎng)基2 mL。用含有1% FBS 的α-MEM 培養(yǎng)基作為對照。放置到37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)12、24 h 后觀察細(xì)胞劃痕,測量劃痕寬度,計算劃痕愈合率。
結(jié)果如圖3 和表8 所示,在12 h 時,陰性對照組、載五味子油陽離子脂質(zhì)體組、載HBx-siRNA 陽離子脂質(zhì)體組、共載HBx-siRNA 與五味子油陽離子脂質(zhì)體組的劃痕愈合率分別為(48.5±1.5)%、(17.0±1.8)%、(9.2±2.1)%、(3.6±1.8)%,在24 h 后,陰性對照組的劃痕基本愈合,而其他3 組雖有愈合,但是愈合速度明顯減慢,由以上數(shù)據(jù)可知,共載HBx- siRNA 與五味子油陽離子脂質(zhì)體組對HepG2.2.15 細(xì)胞遷移能力的抑制作用大于載HBx-siRNA 組大于載五味子油陽離子脂質(zhì)體組大于陰性對照組。共載HBx-siRNA 與五味子油組陽離子脂質(zhì)體納米粒具有較好的抑制HepG2.2.15 細(xì)胞遷移的能力。
圖3 細(xì)胞劃痕實驗Fig.3 Cell scratch experiment
表8 陽離子脂質(zhì)體納米粒對HepG2.2.15 細(xì)胞遷移能力抑制作用 ( ± s, n = 3)Table 8 Inhibition of cationic liposome nanoparticle on migration of HepG2.2.15 cells ( ± s, n = 3)
表8 陽離子脂質(zhì)體納米粒對HepG2.2.15 細(xì)胞遷移能力抑制作用 ( ± s, n = 3)Table 8 Inhibition of cationic liposome nanoparticle on migration of HepG2.2.15 cells ( ± s, n = 3)
組別 劃痕愈合率/% 12 h 24 h 對照 48.5±1.5 73.2±2.2 載五味子油陽離子脂質(zhì)體 17.0±1.8* 26.9±1.9* 載HBx-siRNA 陽離子脂質(zhì)體 9.2±2.1* 19.5±2.1* 共載HBx-siRNA 與五味子 油陽離子脂質(zhì)體 3.6±1.8* 15.2±1.8*
2.6.3 細(xì)胞攝取實驗 將HepG2.2.15 細(xì)胞接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板上,將加入α-MEM 完全培養(yǎng)液作為對照組,給藥組加入載FAM-HBx-siRNA 的陽離子脂質(zhì)體納米粒的α-MEM 完全培養(yǎng)基。12、24 h 后棄去培養(yǎng)液,加入2 mL 無菌PBS 重復(fù)洗滌2 次。熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的攝取效果。
結(jié)果如圖4 所示,將載FAM-HBx-siRNA 陽離子脂質(zhì)體納米粒處理過的HepG2.2.15 細(xì)胞,經(jīng)給藥12、24 h 后,將細(xì)胞貼壁面向上,放置在熒光倒置顯微鏡下觀察攝取效果,發(fā)現(xiàn)綠色熒光即為攝取了FAM-HBx-siRNA 的細(xì)胞。將載FAM-HBx-siRNA組與陰性對照組經(jīng)處理后,放置顯微鏡下觀察,載FAM-HBx-siRNA 組在給藥12 h 后,出現(xiàn)部分綠色熒光,而對照組無此現(xiàn)象。在給藥24 h 后,載FAM-HBx-siRNA 組綠色熒光數(shù)量進(jìn)一步增加,而陰性對照組仍無此現(xiàn)象。觀察結(jié)果顯示,HepG2.2.15細(xì)胞對載FAM-HBx-siRNA 陽離子脂質(zhì)體納米粒的攝取效果顯著。
圖4 HepG2.2.15 細(xì)胞攝取FAM-siRNA 陽離子脂質(zhì)體納米粒效果Fig.4 Uptake effect of FAM-siRNA cationic liposome nanoparticles by HepG2.2.15 cells
2.6.4 ELISA 法檢測HepG2.2.15 細(xì)胞上清液中乙肝表面抗原(HBsAg)和乙肝核心抗原(HBeAg)的水平 將HepG2.2.15細(xì)胞接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板 上,分別加入載五味子油、載HBx-siRNA、共載HBx-siRNA 與五味子油陽離子脂質(zhì)體納米粒α-MEM 培養(yǎng)基2 mL。以加入2 mL α-MEM 基本培養(yǎng)基作為對照組,每組設(shè)3 個復(fù)孔;放置到培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi),放置48 h;48 h 后收取各組細(xì)胞上清液至滅菌后的離心管中,2500 r/min 離心20 min,收集上清。實驗過程參照酶聯(lián)生物公司HBeAg 及HBsAg 試劑盒說明書。
結(jié)果如表9 所示,在給藥48 h 后,載五味子油陽離子脂質(zhì)體組、載HBx-siRNA 組、共載HBx-siRNA 與五味子油陽離子脂質(zhì)體組分別與陰性對照組相比細(xì)胞上清液中的HBsAg 和HBeAg 的水平均有下降,并且對于抑制HepG2.2.15 細(xì)胞分泌HBsAg和HBeAg 的水平共載HBx-siRNA 與五味子油陽離子脂質(zhì)體組大于載HBx-siRNA 組大于載五味子油陽離子脂質(zhì)體組大于陰性對照組,與陰性對照組對比,各組都具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。由數(shù)據(jù)可知,共載HBx-siRNA 與五味子油陽離子脂質(zhì)體納米粒具有較好的抑制HepG2.2.15 細(xì)胞分泌HBsAg和HBeAg 的作用。
表9 陽離子脂質(zhì)體對 HBsAg 和 HBeAg 水平的影響 ( ± s, n = 3)Table 9 Effects of cationic liposomes on HBsAg and HBeAg levels ( ± s, n = 3)
表9 陽離子脂質(zhì)體對 HBsAg 和 HBeAg 水平的影響 ( ± s, n = 3)Table 9 Effects of cationic liposomes on HBsAg and HBeAg levels ( ± s, n = 3)
組別 A 值 HBsAg HBeAg 對照 2.358±0.148 1.832±0.058 載五味子油陽離子脂質(zhì)體 2.015±0.132* 1.694±0.055* 載HBx-siRNA 1.325±0.125* 1.028±0.053* 共載HBx-siRNA 與五味子 油陽離子脂質(zhì)體 0.645±0.108* 0.452±0.051*
慢性乙型肝炎是危害全球人民健康的嚴(yán)峻問題,每年有好幾十萬人都因為感染HBV 導(dǎo)致肝功能衰竭、肝硬化和肝癌而死亡[13-14]。陽離子脂質(zhì)體目前在醫(yī)藥界基因療法研發(fā)中較為常用,與細(xì)胞膜在電荷效應(yīng)下具有較強(qiáng)的親和力,利于其進(jìn)到細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行藥物運輸[15-16]。薄膜分散法是常用的制備脂質(zhì)體的工藝,此方法不僅制備工藝簡單,還可以得到較高的包封率[17]。但是薄膜分散法所得到的脂質(zhì)體粒徑較大且不穩(wěn)定,本實驗通過適當(dāng)增加超聲時間使脂質(zhì)體粒徑變小且均勻穩(wěn)定,通過單因素考察和星點設(shè)計-效應(yīng)面法,優(yōu)化五味子油陽離子脂質(zhì)體的制備工藝條件,由數(shù)據(jù)可知,經(jīng)過工藝優(yōu)化制出的共載HBx-siRNA 與五味子油陽離子脂質(zhì)體納米粒具有較好的包封率、粒徑和Zeta 電位,并且形狀良好。
MTT 作用機(jī)制是可使活細(xì)胞線粒體內(nèi)的琥珀酸脫氫酶還原成不溶于水的藍(lán)色結(jié)晶-甲臜,死細(xì)胞不能發(fā)生此反應(yīng),而DMSO 可以溶解甲臜,經(jīng)酶標(biāo)儀測定的A值可以體現(xiàn)出活細(xì)胞的多少[18-19]。本實驗表明,共載HBx-siRNA 與五味子油組抑制HepG 2.2.15 細(xì)胞增殖的效果最強(qiáng),具有較好的抑制 HepG2.2.15 細(xì)胞增殖的作用。
通過細(xì)胞劃痕實驗可以考察出藥物對細(xì)胞遷移能力的影響[20]。本研究發(fā)現(xiàn)共載HBx-siRNA 與五味子油組具有較好的抑制 HepG2.2.15 細(xì)胞遷移能力。HepG2.2.15 細(xì)胞對共載HBx-siRNA 與五味子油陽離子脂質(zhì)體的攝取是產(chǎn)生其抑制乙型肝炎效果的重要指標(biāo),實驗表明,HepG2.2.15 細(xì)胞對載FAM-HBx-siRNA 的陽離子脂質(zhì)體納米粒的攝取效果顯著。
HBeAg 與HBsAg 的含量是檢測是否感染乙型肝炎的重要指標(biāo),目前慣用的測定HBeAg和HBsAg的方法是ELISA 實驗。常用雙抗原夾心法可簡單、方便、敏感度較高的快速檢測到HepG2.2.15 細(xì)胞上清液中分泌的HBeAg 和HBsAg[21-22]。本研究發(fā)現(xiàn),共載HBx-siRNA 與五味子油陽離子脂質(zhì)體納米粒有較好的抑制HepG 2.2.15 細(xì)胞分泌HBeAg 和HBsAg 的作用。綜上所述,五味子油協(xié)同HBx- siRNA 具有較好的抑制乙型肝炎的效果。
利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突