王 銳，李婭蘭，李建月，楊 婧

1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040

2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040

乙型病毒性肝炎是由乙肝病毒誘發(fā)的以肝臟病變?yōu)橹鞯膫魅拘约膊　Ｓ墒澜缧l(wèi)生組織統(tǒng)計報道全球慢性乙肝病毒患者約有2.57 億，且88.7 萬人因感染乙肝病毒而死亡，中國乙肝病毒患者約9300 萬例，其中慢性乙型肝炎病患約2000 萬例[1-2]。小干擾RNA（siRNA）技術(shù)廣泛應(yīng)用于乙肝病毒的治療。但裸siRNA 生物半衰期短，容易被胞漿、血液和組織中的酶類降解，生物利用度低。細(xì)胞膜表面帶有負(fù)電荷，且siRNA 是帶有負(fù)電荷的親水性物質(zhì)，因此，siRNA 進(jìn)入細(xì)胞需要載體介導(dǎo)。北五味子具備護(hù)肝的功能，目前對于木脂素的研究較為廣泛，對于北五味子油的研究較少，牛莉萍[3]研究發(fā)現(xiàn)北五味子油可通過增加HepG2 細(xì)胞內(nèi)活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）含量而達(dá)到使HepG2 細(xì)胞凋亡的功能。脂質(zhì)體作為一種非病毒載體具有無傳染性、無載體容量制約、化學(xué)結(jié)構(gòu)可操控，無致瘤危險和抗原性[4-7]。siRNA 為水溶性物質(zhì)，利用陽離子脂質(zhì)體可同時裝載水溶性物質(zhì)和脂溶性物質(zhì)的特點，選取具有保肝作用的北五味子提取物五味子油[8-9]，將兩者同時裝載于陽離子脂質(zhì)體內(nèi)，探究五味子油是否可協(xié)同乙型肝炎型小干擾RNA（HBx-siRNA），以達(dá)到更好的抑制乙肝病毒的功效。

1 儀器與材料

1.1 儀器與設(shè)備

OSB-2200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，日本EYELA 株式會社；超聲細(xì)胞破碎儀，美國SONICS公司；SYNERGY H1酶聯(lián)免疫檢測儀，美國伯騰儀器有限公司；JEM-2100 透射電子顯微鏡（TEM），日本電子株式會社；U-CTR30-2 熒光倒置顯微鏡，德國徠卡公司；粒徑電位儀，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；CFX ConnectTM熒光定量PCRA 儀，美國BIO-RAD 公司；DW-86L386 ?80 ℃低溫冰箱，美國Thermo 公司；生物分光光度計、離心機(jī)，Eppendorf 公司；渦旋振蕩儀，海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.2 藥品與試劑

五味子油，江西森海植物油有限公司，批號20181022，檢測報告：橙黃色透明油狀液體，氣清香，相對密度0.972 0～0.992 0，折光率1.492 0～1.568 0，酸值≤20 mg KOH/g，砷鹽≤0.2 μg/kg，重金屬≤0.001 mg/kg，亞油酸≥10%，五味子甲素≥2.0%。(2,3-二油氧基-丙基)三甲基氯乙銨（N-[1-(2,3- dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium chloride，DOTAP），上海斯信生物有限公司，批號RD-01173；氯仿、異丙醇、無水乙醇，天津市永大化學(xué)試劑有限公司；膽固醇，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號20130618；透明質(zhì)酸（批號H02N8J47121）、魚精蛋白（批號Z31O8H47046）、二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇 2000（DSPE-PEG2000，批號P31M8S32960），上海源葉生物科技有限公司；siRNA（序列見表1）、熒光標(biāo)記的siRNA（FAM- siRNA），蘇州吉瑪基因股份有限公司；經(jīng)焦碳酸二乙酯處理過的高溫消毒的水（DEPC），北京博奧拓達(dá)科技有限公司，批號PM11649；二甲基亞砜，上海索萊寶生物科技有限公司，批號D8418；MEM培養(yǎng)基，HyClone 公司，批號AE27142269；胰酶細(xì)胞消化液，碧云天生物技術(shù)有限公司，批號C0201；無菌PBS，北京博奧拓達(dá)科技有限公司，批號180523；胎牛血清，賽澳美細(xì)胞技術(shù)有限公司，批號20180522；雙抗，美國Gibco 公司，批號J150038；MTT，賽國生物科技有限公司，批號EZ3455C328。

表1 siRNA 序列Table 1 siRNA sequence

1.3 細(xì)胞株與培養(yǎng)基

1.3.1 細(xì)胞株 HepG2.2.15 表達(dá)HBV 病毒的人肝細(xì)胞，購于上海中喬新舟生物科技有限公司。

1.3.2 培養(yǎng)基 α-MEM＋10% FBS＋1%雙抗＋1%丙酮酸鈉，在37 ℃，5% CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

2 方法與結(jié)果

2.1 共載HBx-siRNA 和五味子油陽離子脂質(zhì)體納米粒的制備

稱量DOTAP 和膽固醇放置到圓底燒瓶內(nèi)，量取適量的CHCl3溶解。置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上除去CHCl3，待燒瓶內(nèi)壁形成一層脂質(zhì)體薄膜即可。加入適量的0.1% DEPC 水溶液洗下薄膜。超聲處理30 min，加入五味子油，細(xì)胞破碎儀下超聲60 s，再緩慢多次通過0.45 μm 濾膜，即得五味子油陽離子脂質(zhì)體[10]。

量取處方量0.1% DEPC 水溶液，充分震搖使HBx-siRNA 溶解均勻。將siRAN 溶液與等體積的透明質(zhì)酸混合，震蕩均勻，加入適量的魚精蛋白，充分混合配制好的載五味子油的陽離子脂質(zhì)體，加入適量的DSPE-PEG2000，即制成共載HBx-siRNA與五味子油陽離子脂質(zhì)體納米粒。

2.2 單因素實驗優(yōu)化脂質(zhì)體納米粒制備工藝

2.2.1 膜材比對包封率的影響 膜材比為陽離子脂質(zhì)體的成膜成分DOTAP 與膽固醇的質(zhì)量比，選擇藥脂比1∶5、超聲時間50 min、旋蒸溫度30 ℃，使得膜材比為5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1，按照“2.1”項下方法制備五味子油陽離子脂質(zhì)體，考察包封率的變化，結(jié)果包封率分別為（64.45±0.28）%、（73.42±0.65）%、（79.54±0.44）%、（75.40±0.34）%、（70.38±0.46）%（n＝3）。膜材比為4∶1、3∶1、2∶1 時脂質(zhì)體的包封率較高，故選取4∶1、3∶1、2∶1 為膜材比的3 個水平，進(jìn)行后續(xù)考察。

2.2.2 藥脂比對包封率的影響 選擇膜材比3∶1、超聲時間50 min、旋蒸溫度30 ℃，制備五味子油與脂質(zhì)體的質(zhì)量比為1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7 時，按照“2.1”項下方法制備五味子油陽離子脂質(zhì)體，考察脂質(zhì)體包封率的變化，結(jié)果包封率分別為（69.54±0.32）%、（75.32±0.45）%、（89.56± 0.44）%、（91.12±0.43）%、（93.32±0.28）% （n＝3）。脂質(zhì)體與五味子油的質(zhì)量比越大，五味子油陽離子脂質(zhì)體的包封率越大；反之，質(zhì)量比越小，包封率越小。綜合考慮載藥量以及包封率，選擇1∶4、1∶5、1∶6 為藥脂比的3 個水平。

2.2.3 超聲時間對包封率的影響 選擇膜材比3∶1、藥脂比1∶5、旋蒸溫度30 ℃，改變超聲時間分別為40、50、60、70、80 min，按照“2.1”項下方法制備五味子油陽離子脂質(zhì)體，結(jié)果包封率分別為（75.82±0.48）%、（80.93±0.25）%、（86.44±0.44）%、（83.72±0.56）%、（81.22±0.37）%（n＝3）。超聲時間為50、60、70 min 時脂質(zhì)體的包封率較高，故選擇50、60、70 min 為超聲時間3 水平。

2.2.4 旋蒸溫度對包封率的影響 固定膜材比3∶1、藥脂比1∶5、超聲時間50 min，改變旋蒸溫度分別為20、30、40、50、60 ℃，按照“2.1”項下方法制備五味子油陽離子脂質(zhì)體，結(jié)果包封率分別為（81.32±0.47）%、（83.66±0.48）%、（83.12±0.72）%、（82.52±0.32）%、（80.47±0.43）% （n＝3）。旋蒸溫度為20、30、40 ℃時包封率較高，在30 ℃時包封率最高，因此，選取30 ℃為最優(yōu)溫度（相比于其他單因素條件，旋蒸溫度影響包封率的范圍很小，故不必進(jìn)一步優(yōu)化）。

2.3 星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化五味子油陽離子脂質(zhì)體處方工藝

2.3.1 實驗設(shè)計與結(jié)果 根據(jù)單因素實驗分析得出，改變旋蒸溫度，得到的相鄰包封率差值較小，故旋蒸溫度對五味子油陽離子脂質(zhì)體的包封率影響不大，因此，以單因素考察實驗為依據(jù)，設(shè)定膜材比（X1）、藥脂比（X2）、超聲時間（X3）為考察因素，以五味子油包封率（Y）為評價指標(biāo)，每個因素設(shè)置5 水平。分別用代碼?α、?1、0、+1、+α 表示，對于3 因素的星點設(shè)計，α＝1.682。實驗因素與水平安排及結(jié)果見表2。

2.3.2 模型擬合 通過Design Expert 8.0 軟件分別對各因素的各水平進(jìn)行二次多項式方程擬合。并根據(jù)方程通過Design Expert 8.0 軟件繪出三維效應(yīng)面和二維等高線，選取較優(yōu)組合。二次多項式方程擬合結(jié)果為Y＝?597.656 36＋51.565 46X1＋59.731 83X2＋12.217 04X3－3.058 24X1X2＋0.440 88X1X3＋0.787 36X2X3－11.404 24X12－10.239 24X22－ 0.121 49X32，P＜0.05，R2＝0.876 5，回歸方程關(guān)系顯著，符合要求。方差結(jié)果分析見表3。

結(jié)果分析，Y模型項P＜0.05，證明所得回歸方程效果顯著。在Y模型方程中，X3、X2X3、X12、X22、X32都是顯著項，是Y的顯著影響因素。使用Statistica 6.0 軟件處理后得到二維等高線及三維效應(yīng)面圖，確定最優(yōu)方案為膜材比為3∶1，藥脂比為1∶5，超聲時間為70 min。結(jié)果見圖1。

2.3.3 最佳工藝 采用薄膜分散法，稱取DOTAP和膽固醇的質(zhì)量比為3∶1，圓底燒瓶中加入適量的三氯甲烷，30 ℃旋蒸成薄膜，真空干燥2 h 后超聲處理30 min，稱取五味子油與脂質(zhì)體的比為1∶5，超聲70 min，取凍存的HBx-siRAN，4000 r/min 離心1 min，加入0.1% DEPC 溶解。取含有25 μg H B x-s i R A N 的溶液加入等質(zhì)量的透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）溶液混合形成HA-siRNA。

以HA-siRNA 與PRTM 的質(zhì)量比為1∶1 進(jìn)行均勻混合，得到HA-siRNA-PRTM 復(fù)合物。在該復(fù)合物中加入50 μL 的載五味子油脂質(zhì)體，10 min 后加入50 μL DSPE-PEG2000，在50 ℃水浴鍋中靜置10 min。共載HBx-siRAN 與五味子油陽離子脂質(zhì)體納米粒制備完成。

表2 星點設(shè)計-效應(yīng)面法實驗因素水平安排及結(jié)果Table 2 Horizontal arrangement and result of experimental factors in star point design-response surface method

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Results of variance analysis

圖1 膜材比 (X1)、藥脂比 (X2)、超聲時間 (X3) 對包封率的三維效應(yīng)面和二維等高線圖Fig.1 Three-dimensional effect surface and two-dimensional contour map of membrane material ratio (X1), drug-lipid ratio (X2) and ultrasonic time (X3) on entrapment efficiency

2.3.4 最佳工藝驗證 按照星點設(shè)計-效應(yīng)面法篩選出最佳的載五味子油脂質(zhì)體的制備工藝，按照最佳工藝制備測定包封率，并把實測值與預(yù)測值對比，計算兩數(shù)值之間的誤差，如表4，載五味子油陽離子脂質(zhì)體包封率的預(yù)測值與實測值的相對偏差小于5%，證明該工藝準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性良好，星點設(shè)計實驗所建立的數(shù)學(xué)模型預(yù)測性良好。課題組前期研究表明，HA-siRNA 與魚精蛋白最佳質(zhì)量比為1.0∶1.0 時，復(fù)合物為帶有負(fù)電荷的較小微粒。復(fù)合物HBx-siRNA 的載藥量為25 μg 時，加入包和五味子油陽離子脂質(zhì)體為50 μL 時，制備工藝最佳。

表4 實測值與預(yù)測值比較Table 4 Comparison of measured and predicted values

2.4 脂質(zhì)體納米粒的表征

2.4.1 電位、粒徑及形態(tài)的測定 按照“2.3.3”最佳工藝制備共載HBx-siRNA 與五味子油陽離子脂質(zhì)體納米粒樣品，分別取適量樣品加到比色皿和樣品池內(nèi)，用電位粒徑儀檢測粒徑和Zeta 電位[11-12]。測得共載HBx-siRNA 與五味子油陽離子脂質(zhì)體納米粒的粒徑為（134.000±0.035）nm，多分散指數(shù)（PDI）為0.320±0.022，Zeta 電位為（44.000± 0.027）mV。

2.4.2 透射電鏡觀察脂質(zhì)體外觀 按照“2.3.3”項下最佳工藝制備共載HBx-siRNA 與五味子油陽離子脂質(zhì)體納米粒樣品，取5 μL 滴加在銅網(wǎng)上，室溫靜置至干燥，將銅網(wǎng)置于TEM 下觀察脂質(zhì)體的形態(tài)。并用TEM 觀察觀察脂質(zhì)體形態(tài)，結(jié)果見圖2，共載HBx-siRNA 與五味子油陽離子脂質(zhì)體納米粒呈不規(guī)則的類圓形。

圖2 脂質(zhì)體TEM 圖Fig.2 TEM of liposome

2.5 脂質(zhì)體納米粒包封率的測定

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 將熒光標(biāo)記的HBx-siRNA （FAM-HBx-siRAN）溶解在適量的0.1% DEPC 水中制備成FAM-siRNA 儲備溶液。取0.1% DEPC 水將儲備液分別稀釋成0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 μg/μL 質(zhì)量濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。492 nm 波長下，通過酶標(biāo)儀測定每組吸光度（A）值。得到方程Y＝1 005.4X+119.21，R2＝0.997 4。由方程可知，A值與FAM-HBx-siRNA 質(zhì)量濃度在0.05～0.30 μg/μL 具有良好的線性關(guān)系。

2.5.2 包封率和載藥量的測定 按照最佳工藝制備共載FAM-HBx-siRNA 與五味子油陽離子脂質(zhì)體納米粒。取適量的溶液進(jìn)行離心（4000 r/min），取上清液，在492 nm 條件下，采用多功能酶標(biāo)儀測定A值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出游離FAM-HBx-siRNA質(zhì)量濃度（C），計算包封率和載藥量。

檢測結(jié)果見表5，共載FAM-HBx-siRNA 與五味子油脂質(zhì)體納米粒的包封率為（81.37±0.08）%，載藥量為（16.25±0.06）%，證明HBx-siRNA 和五味子油在脂質(zhì)體中具有較好的包封率和載藥量。

表5 載HBx siRNA 與五味子油陽離子脂質(zhì)體納米粒包封率和載藥量Table 5 Encapsulation rate and drug loading of cationic liposome nanoparticles loaded with HBx siRNA and SCF oil

2.6 共載脂質(zhì)體納米粒對乙型肝炎病毒體外藥效學(xué)研究

2.6.1 MTT 檢測細(xì)胞增殖抑制實驗 將HepG 2.2.15 細(xì)胞接種于96 孔板內(nèi)，并使每孔含有細(xì)胞懸液100 μL。將96 孔板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)放置24 h，至HepG2.2.15 細(xì)胞單層平鋪孔底，棄去原培養(yǎng)基。加入制備好的濃度為20、40、60、80、100 nmol/L的共載HBx-siRNA 與五味子油的陽離子脂質(zhì)體納米粒，選取0 nmol/L 濃度作為對照組，每組設(shè)3 個復(fù)孔。放入條件為37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，放置24、48 h。

同上分別加入載五味子油、載HBx-siRNA、共載HBx-siRNA 與五味子油的陽離子脂質(zhì)體納米粒α-MEM 基本培養(yǎng)基100 μL。以100 μL 空白陽離子脂質(zhì)體α-MEM 基本培養(yǎng)基作為對照組，每一組設(shè)置3 個復(fù)孔。放入條件為37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，放置24、48 h。使用酶標(biāo)儀，檢測各孔A值，并記下各組數(shù)據(jù)。

如表6 所示，在給藥24 h 后，20、40、60、80、100 nmol/L 濃度的共載HBx-siRNA 與五味子油脂質(zhì)體納米粒對 HepG2.2.15 細(xì)胞抑制率分別是7.97%、20.10%、37.98%、45.73%、54.63%。在給藥48 h 后，20、40、60、80、100 nmol/L 濃度的共載 HBx-siRNA 與五味子油脂質(zhì)體納米粒對HepG2.2.15 細(xì)胞抑制率分別是17.84%、33.33%、56.47%、68.87%、74.38%。說明共載HBx-siRNA與五味子油脂質(zhì)體納米粒對HepG2.2.15 細(xì)胞增殖的抑制具有劑量相關(guān)性。通過細(xì)胞增殖抑制率計算公式（抑制率＝1－A加藥/A對照），計算得共載HBx- siRNA 與五味子油脂質(zhì)體納米粒在24、48 h 抑制HepG2.2.15 細(xì)胞增殖50%時的藥物濃度（IC50）分別為53.5、107.4 nmol/L。因此，在后續(xù)各實驗時共載脂質(zhì)體納米粒的濃度選定為100 nmol/L。

表6 不同濃度陽離子脂質(zhì)體納米粒對HepG2.2.15 細(xì)胞增殖的抑制作用 ( ± s, n = 3)Table 6 Inhibition of HepG2.2.15 cell proliferation by cationic liposome nanoparticles with different concentrations ( ± s,n = 3)

表6 不同濃度陽離子脂質(zhì)體納米粒對HepG2.2.15 細(xì)胞增殖的抑制作用 ( ± s, n = 3)Table 6 Inhibition of HepG2.2.15 cell proliferation by cationic liposome nanoparticles with different concentrations ( ± s,n = 3)

與對照組比較：*P＜0.05，表7～9 同*P ＜ 0.05 vs negative control group, same as table 7—9

濃度/ 24 h 48 h 組別 (nmol·L?1) A 值 抑制率/% A 值 抑制率/% 對照 ? 1.393±0.025 ? 1.452±0.022 ? 共載HBx-siRNA 與 20 1.282±0.031* 7.97 1.193±0.035* 17.84 五味子油陽離子 40 1.113±0.048* 20.10 0.968±0.045* 33.33 脂質(zhì)體納米粒 60 0.864±0.034* 37.98 0.632±0.027* 56.47 80 0.756±0.051* 45.73 0.452±0.023* 68.87 100 0.632±0.025* 54.63 0.372±0.031* 74.38

如表7 所示，在給藥后24 h 時，載五味子油陽離子脂質(zhì)體組的抑制率為20.22%，載HBx-siRNA組的抑制率為42.82%，共載HBx-siRNA 與五味子油陽離子脂質(zhì)體組的抑制率為52.78%。在給藥后48 h 時，各組的抑制率明顯增加，載五味子油陽離子脂質(zhì)體組的抑制率為25.10%，載HBx-siRNA 組的抑制率為59.26%，共載HBx-siRNA 與五味子油陽離子脂質(zhì)體組的抑制率為73.59%。與陰性對照組

表7 陽離子脂質(zhì)體納米粒對HepG2.2.15 細(xì)胞增殖的抑制作用 ( ± s, n = 3)Table 7 Inhibition of cationic liposome nanoparticles on the proliferation of HepG2.2.15 cells ( ± s, n = 3)

表7 陽離子脂質(zhì)體納米粒對HepG2.2.15 細(xì)胞增殖的抑制作用 ( ± s, n = 3)Table 7 Inhibition of cationic liposome nanoparticles on the proliferation of HepG2.2.15 cells ( ± s, n = 3)

組別 24 h 48 h A 值 抑制率/% A 值 抑制率/% 對照 1.385±0.022 ? 1.458±0.032 ? 載五味子油陽離子脂質(zhì)體 1.105±0.037* 20.22 1.092±0.043* 25.10 載HBx-siRNA 0.794±0.026* 42.82 0.594±0.027* 59.26 共載HBx-siRNA 與五味子油陽離子脂質(zhì)體 0.654±0.018* 52.78 0.385±0.028* 73.59

（空白陽離子脂質(zhì)體組）進(jìn)行對比，各組都具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。由實驗數(shù)據(jù)可知，在相同的給藥時間內(nèi)，共載HBx-siRNA 與五味子油陽離子脂質(zhì)體組的抑制率大于載HBx-siRNA 組大于載五味子油陽離子脂質(zhì)體組大于陰性對照組。共載HBx- siRNA 與五味子油陽離子脂質(zhì)體納米粒對HepG 2.2.15 細(xì)胞的增殖具有較好的抑制作用。

2.6.2 劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移能力 給藥組分別加入載五味子油陽離子脂質(zhì)體、載HBx-siRNA、共載HBx-siRNA 與五味子油陽離子脂質(zhì)體納米粒含1% FBS 的α-MEM 培養(yǎng)基2 mL。用含有1% FBS 的α-MEM 培養(yǎng)基作為對照。放置到37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)12、24 h 后觀察細(xì)胞劃痕，測量劃痕寬度，計算劃痕愈合率。

結(jié)果如圖3 和表8 所示，在12 h 時，陰性對照組、載五味子油陽離子脂質(zhì)體組、載HBx-siRNA 陽離子脂質(zhì)體組、共載HBx-siRNA 與五味子油陽離子脂質(zhì)體組的劃痕愈合率分別為（48.5±1.5）%、（17.0±1.8）%、（9.2±2.1）%、（3.6±1.8）%，在24 h 后，陰性對照組的劃痕基本愈合，而其他3 組雖有愈合，但是愈合速度明顯減慢，由以上數(shù)據(jù)可知，共載HBx- siRNA 與五味子油陽離子脂質(zhì)體組對HepG2.2.15 細(xì)胞遷移能力的抑制作用大于載HBx-siRNA 組大于載五味子油陽離子脂質(zhì)體組大于陰性對照組。共載HBx-siRNA 與五味子油組陽離子脂質(zhì)體納米粒具有較好的抑制HepG2.2.15 細(xì)胞遷移的能力。

圖3 細(xì)胞劃痕實驗Fig.3 Cell scratch experiment

表8 陽離子脂質(zhì)體納米粒對HepG2.2.15 細(xì)胞遷移能力抑制作用 ( ± s, n = 3)Table 8 Inhibition of cationic liposome nanoparticle on migration of HepG2.2.15 cells ( ± s, n = 3)

表8 陽離子脂質(zhì)體納米粒對HepG2.2.15 細(xì)胞遷移能力抑制作用 ( ± s, n = 3)Table 8 Inhibition of cationic liposome nanoparticle on migration of HepG2.2.15 cells ( ± s, n = 3)

組別 劃痕愈合率/% 12 h 24 h 對照 48.5±1.5 73.2±2.2 載五味子油陽離子脂質(zhì)體 17.0±1.8* 26.9±1.9* 載HBx-siRNA 陽離子脂質(zhì)體 9.2±2.1* 19.5±2.1* 共載HBx-siRNA 與五味子 油陽離子脂質(zhì)體 3.6±1.8* 15.2±1.8*

2.6.3 細(xì)胞攝取實驗 將HepG2.2.15 細(xì)胞接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，將加入α-MEM 完全培養(yǎng)液作為對照組，給藥組加入載FAM-HBx-siRNA 的陽離子脂質(zhì)體納米粒的α-MEM 完全培養(yǎng)基。12、24 h 后棄去培養(yǎng)液，加入2 mL 無菌PBS 重復(fù)洗滌2 次。熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的攝取效果。

結(jié)果如圖4 所示，將載FAM-HBx-siRNA 陽離子脂質(zhì)體納米粒處理過的HepG2.2.15 細(xì)胞，經(jīng)給藥12、24 h 后，將細(xì)胞貼壁面向上，放置在熒光倒置顯微鏡下觀察攝取效果，發(fā)現(xiàn)綠色熒光即為攝取了FAM-HBx-siRNA 的細(xì)胞。將載FAM-HBx-siRNA組與陰性對照組經(jīng)處理后，放置顯微鏡下觀察，載FAM-HBx-siRNA 組在給藥12 h 后，出現(xiàn)部分綠色熒光，而對照組無此現(xiàn)象。在給藥24 h 后，載FAM-HBx-siRNA 組綠色熒光數(shù)量進(jìn)一步增加，而陰性對照組仍無此現(xiàn)象。觀察結(jié)果顯示，HepG2.2.15細(xì)胞對載FAM-HBx-siRNA 陽離子脂質(zhì)體納米粒的攝取效果顯著。

圖4 HepG2.2.15 細(xì)胞攝取FAM-siRNA 陽離子脂質(zhì)體納米粒效果Fig.4 Uptake effect of FAM-siRNA cationic liposome nanoparticles by HepG2.2.15 cells

2.6.4 ELISA 法檢測HepG2.2.15 細(xì)胞上清液中乙肝表面抗原（HBsAg）和乙肝核心抗原（HBeAg）的水平 將HepG2.2.15細(xì)胞接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板 上，分別加入載五味子油、載HBx-siRNA、共載HBx-siRNA 與五味子油陽離子脂質(zhì)體納米粒α-MEM 培養(yǎng)基2 mL。以加入2 mL α-MEM 基本培養(yǎng)基作為對照組，每組設(shè)3 個復(fù)孔；放置到培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，放置48 h；48 h 后收取各組細(xì)胞上清液至滅菌后的離心管中，2500 r/min 離心20 min，收集上清。實驗過程參照酶聯(lián)生物公司HBeAg 及HBsAg 試劑盒說明書。

結(jié)果如表9 所示，在給藥48 h 后，載五味子油陽離子脂質(zhì)體組、載HBx-siRNA 組、共載HBx-siRNA 與五味子油陽離子脂質(zhì)體組分別與陰性對照組相比細(xì)胞上清液中的HBsAg 和HBeAg 的水平均有下降，并且對于抑制HepG2.2.15 細(xì)胞分泌HBsAg和HBeAg 的水平共載HBx-siRNA 與五味子油陽離子脂質(zhì)體組大于載HBx-siRNA 組大于載五味子油陽離子脂質(zhì)體組大于陰性對照組，與陰性對照組對比，各組都具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。由數(shù)據(jù)可知，共載HBx-siRNA 與五味子油陽離子脂質(zhì)體納米粒具有較好的抑制HepG2.2.15 細(xì)胞分泌HBsAg和HBeAg 的作用。

表9 陽離子脂質(zhì)體對 HBsAg 和 HBeAg 水平的影響 ( ± s, n = 3)Table 9 Effects of cationic liposomes on HBsAg and HBeAg levels ( ± s, n = 3)

表9 陽離子脂質(zhì)體對 HBsAg 和 HBeAg 水平的影響 ( ± s, n = 3)Table 9 Effects of cationic liposomes on HBsAg and HBeAg levels ( ± s, n = 3)

組別 A 值 HBsAg HBeAg 對照 2.358±0.148 1.832±0.058 載五味子油陽離子脂質(zhì)體 2.015±0.132* 1.694±0.055* 載HBx-siRNA 1.325±0.125* 1.028±0.053* 共載HBx-siRNA 與五味子 油陽離子脂質(zhì)體 0.645±0.108* 0.452±0.051*

3 討論

慢性乙型肝炎是危害全球人民健康的嚴(yán)峻問題，每年有好幾十萬人都因為感染HBV 導(dǎo)致肝功能衰竭、肝硬化和肝癌而死亡[13-14]。陽離子脂質(zhì)體目前在醫(yī)藥界基因療法研發(fā)中較為常用，與細(xì)胞膜在電荷效應(yīng)下具有較強(qiáng)的親和力，利于其進(jìn)到細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行藥物運輸[15-16]。薄膜分散法是常用的制備脂質(zhì)體的工藝，此方法不僅制備工藝簡單，還可以得到較高的包封率[17]。但是薄膜分散法所得到的脂質(zhì)體粒徑較大且不穩(wěn)定，本實驗通過適當(dāng)增加超聲時間使脂質(zhì)體粒徑變小且均勻穩(wěn)定，通過單因素考察和星點設(shè)計-效應(yīng)面法，優(yōu)化五味子油陽離子脂質(zhì)體的制備工藝條件，由數(shù)據(jù)可知，經(jīng)過工藝優(yōu)化制出的共載HBx-siRNA 與五味子油陽離子脂質(zhì)體納米粒具有較好的包封率、粒徑和Zeta 電位，并且形狀良好。

MTT 作用機(jī)制是可使活細(xì)胞線粒體內(nèi)的琥珀酸脫氫酶還原成不溶于水的藍(lán)色結(jié)晶-甲臜，死細(xì)胞不能發(fā)生此反應(yīng)，而DMSO 可以溶解甲臜，經(jīng)酶標(biāo)儀測定的A值可以體現(xiàn)出活細(xì)胞的多少[18-19]。本實驗表明，共載HBx-siRNA 與五味子油組抑制HepG 2.2.15 細(xì)胞增殖的效果最強(qiáng)，具有較好的抑制 HepG2.2.15 細(xì)胞增殖的作用。

通過細(xì)胞劃痕實驗可以考察出藥物對細(xì)胞遷移能力的影響[20]。本研究發(fā)現(xiàn)共載HBx-siRNA 與五味子油組具有較好的抑制 HepG2.2.15 細(xì)胞遷移能力。HepG2.2.15 細(xì)胞對共載HBx-siRNA 與五味子油陽離子脂質(zhì)體的攝取是產(chǎn)生其抑制乙型肝炎效果的重要指標(biāo)，實驗表明，HepG2.2.15 細(xì)胞對載FAM-HBx-siRNA 的陽離子脂質(zhì)體納米粒的攝取效果顯著。

HBeAg 與HBsAg 的含量是檢測是否感染乙型肝炎的重要指標(biāo)，目前慣用的測定HBeAg和HBsAg的方法是ELISA 實驗。常用雙抗原夾心法可簡單、方便、敏感度較高的快速檢測到HepG2.2.15 細(xì)胞上清液中分泌的HBeAg 和HBsAg[21-22]。本研究發(fā)現(xiàn)，共載HBx-siRNA 與五味子油陽離子脂質(zhì)體納米粒有較好的抑制HepG 2.2.15 細(xì)胞分泌HBeAg 和HBsAg 的作用。綜上所述，五味子油協(xié)同HBx- siRNA 具有較好的抑制乙型肝炎的效果。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突