許金國，夏金鑫，梅 茜，趙曉莉，張科衛(wèi)，毛 靖，高紅寧，李 鵬，毛春芹*，陸兔林*

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023

2.南京海陵中藥制藥工藝技術(shù)研究有限公司，江蘇 南京 210023

經(jīng)典名方來源于古代醫(yī)療記載，是歷代醫(yī)藥學(xué)家的經(jīng)驗總結(jié)，是我國醫(yī)學(xué)寶庫的重要組成部分。為了推動經(jīng)典名方的開發(fā)研究，國家藥品監(jiān)督管理局于2019年3月發(fā)布了《古代經(jīng)典名方中藥復(fù)方制劑及其物質(zhì)基準(zhǔn)的申報資料要求（征求意見稿）》（以下簡稱《申報資料要求》）[1]，加強(qiáng)對經(jīng)典名方的質(zhì)量管理。

當(dāng)歸四逆湯（Danggui Sini Decoction，DSD）出自東漢張仲景《傷寒論》[2]，原方由當(dāng)歸、桂枝、白芍、細(xì)辛、甘草、木通、大棗7 味藥組成，具有溫經(jīng)散寒、養(yǎng)血通脈等功效，主治血虛寒厥證。現(xiàn)代臨床主要用于治療痛經(jīng)、糖尿病周圍神經(jīng)病變、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病[3-6]。DSD 的相關(guān)研究主要集中于臨床應(yīng)用方面，對質(zhì)量控制方面的研究相對較少。本課題按照《申報資料要求》對經(jīng)典名方DSD進(jìn)行指紋圖譜研究，并借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建DSD“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)，綜合預(yù)測分析其潛在的功效關(guān)聯(lián)物質(zhì)。為全面控制和評價經(jīng)典名方DSD 的質(zhì)量提供依據(jù)，為經(jīng)典名方復(fù)方制劑的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters e 2695 型高效液相色譜儀，包括四元泵、柱溫箱、自動進(jìn)樣器、PDA 檢測器和Empower 工作站，美國Waters 公司；ZYX0071 型超純水系統(tǒng)，南京漢隆實驗器材有限公司；MS-105DU 型十萬分之一電子分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司；MG- H21S011 多功能電陶爐，廣東美的生活電器制造有限公司；TD5001C 型電子天平，天津天馬衡基儀器有限公司；H1650-W 型臺式高速離心機(jī)，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；KQ-500B 型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；砂鍋，江西舒雅陶瓷有限公司。

1.2 試藥

對照品阿魏酸（批號110773-201915，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.4%）、桂皮醛（批號110710-201217，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.5%）、肉桂酸（批號110786-201604，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.8%）、芍藥苷（批號110736-201943，質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.1%）、細(xì)辛脂素（批號111889-201705，質(zhì)量分?jǐn)?shù)100.0%）、甘草苷（批號111610-201908，質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.0%）、甘草酸銨（批號110731-202021，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.2%），中國食品藥品檢定研究院；對照品藁本內(nèi)酯，CAS：4431-01-0，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%，南京森貝伽生物科技有限公司；對照品芍藥內(nèi)酯苷，批號4644，質(zhì)量分?jǐn)?shù)100%，上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司；對照品鄰甲氧基桂皮醛，批號S28D9G711659，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，上海源葉生物科技有限公司。乙腈，色譜純，默克股份兩合公司；甲醇，色譜純，江蘇漢邦科技有限公司；純凈水，杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司；其他試劑均為分析純。

DSD 由當(dāng)歸、桂枝、白芍、細(xì)辛、甘草、木通和大棗7 味藥組成，均購自于道地產(chǎn)區(qū)或主產(chǎn)區(qū)，每味藥共收集不少于3 個產(chǎn)地，總批次不少于15批。經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院陳建偉教授鑒定分別為傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis(Oliv.) Diels.的干燥根、樟科植物肉桂Cinnamomum cassiaPresl.的干燥嫩枝、毛莨科植物芍藥Paeonia lactifloraPall.的干燥根、馬兜鈴科植物北細(xì)辛Asarum heterotropoidesFr.Schmidt var.mandshuricum(Maxim.) Kitag.的干燥根和根莖、豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的干燥根和根莖、木通科植物三葉木通Akebia trifoliata(Thunb.) Koidz.的干燥藤莖和鼠李科植物棗Ziziphus jujubaMill.的干燥成熟果實。本實驗前期已按照《中國藥典》2020年版項下各味藥的檢測方法和檢測要求對藥材進(jìn)行檢測，選出優(yōu)質(zhì)產(chǎn)地的藥材：當(dāng)歸（甘肅岷縣）、桂枝（廣東肇慶）、白芍（安徽亳州）、細(xì)辛（遼寧新賓）、甘草（甘肅民勤）、三葉木通（陜西西安）、大棗（山東新泰）。按照《中國藥典》2020年版及全國飲片炮制規(guī)范項下相關(guān)要求將藥材炮制成15 批飲片。經(jīng)檢測飲片均符合《中國藥典》2020 版項下相關(guān)規(guī)定。利用Excel 中RANDBETWEEN 函數(shù)生成隨機(jī)數(shù)，將當(dāng)歸、桂枝、白芍、細(xì)辛、木通、炒甘草、大棗7 味飲片的不同批次隨機(jī)組合，DSD 批次組合具體信息見表1。

表1 DSD 組合信息Table 1 Combination information of DSD

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Waters XBridge C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.05%磷酸水溶液；梯度洗脫：0～3 min，5%乙腈；3～10 min，5%～10%乙腈；10～15 min，10%～12%乙腈；15～30 min，12%～14%乙腈；30～35 min，14%～17%乙腈；35～40 min，17%～19%乙腈；40～50 min，19%～25%乙腈；50～75 min，25%～45%乙腈；75～90 min，45%～70%乙腈；90～92 min，70%～95%乙腈；92～95 min，95%～5%乙腈；體積流量1.0 mL/min；檢測波長245 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μL。

2.2 對照品溶液的制備

取各對照品適量，精密稱定，加甲醇配制成含阿魏酸3.34 μg/mL、藁本內(nèi)酯2.20 μg/mL、肉桂酸2.22 μg/mL、鄰甲氧基桂皮醛2.50 μg/mL、芍藥苷104.20 μg/mL、芍藥內(nèi)酯苷13.90 μg/mL、細(xì)辛脂素3.77 μg/mL、甘草苷17.61 μg/mL、甘草酸34.16 μg/mL 的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

按照處方比例稱取7 味飲片量：當(dāng)歸9 g，桂枝9 g，白芍9 g，細(xì)辛9 g，炒甘草6 g，木通6 g，大棗24 g。置砂鍋中，加水1600 mL，浸泡45 min，以武火（2200 W）煮沸后，調(diào)節(jié)火力至1000 W，開蓋，保持微沸并煮至600 mL，趁熱用100 目篩濾過，即得DSD 物質(zhì)基準(zhǔn)對應(yīng)實物。

取DSD 物質(zhì)基準(zhǔn)對應(yīng)實物3 mL，置10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度考察 取DSD 物質(zhì)基準(zhǔn)對應(yīng)實物1份，按照“2.3”項下方法制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖。以18 號峰（甘草酸）為參照峰，計算各個共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果表明各共有峰的相對保留時間RSD 值均小于0.18%，相對峰面積RSD 值均小于3.30%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性考察 取DSD 物質(zhì)基準(zhǔn)對應(yīng)實物1份，按照“2.3”項下方法制備供試品溶液，平行制備6 份，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖。以18 號峰（甘草酸）為參照峰，計算各個共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果表明，各個共有峰的相對保留時間RSD 值均小于0.91%，相對峰面積RSD 值均小于3.82%，表明該方法的重復(fù)性良好，可用于DSD 指紋圖譜的檢測。

2.4.3 穩(wěn)定性考察 取DSD 物質(zhì)基準(zhǔn)對應(yīng)實物1份，按照“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖。以18 號峰（甘草酸）為參照峰，計算各個共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果表明，各個共有峰的相對保留時間RSD值均小于0.90%，相對峰面積RSD 值均小于2.08%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 DSD 物質(zhì)基準(zhǔn)對應(yīng)實物指紋圖譜的建立及相似度評價

取23 批DSD 物質(zhì)基準(zhǔn)對應(yīng)實物供試品溶液與對照品溶液按色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖。通過《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012A）軟件，以S1 為參照峰，采用平均數(shù)法，進(jìn)行多點校正和色譜峰匹配，得到23 批DSD 物質(zhì)基準(zhǔn)對應(yīng)實物指紋圖譜疊加圖、共有模式圖和混合對照品圖，共確認(rèn)25 個色譜峰，指認(rèn)9 個色譜峰。結(jié)果見圖1、2。與對照指紋圖譜相比，23 批DSD 物質(zhì)基準(zhǔn)對應(yīng)實物指紋圖譜的相似度均＞0.90，表明DSD 物質(zhì)基準(zhǔn)對應(yīng)實物的相似度良好，主要物質(zhì)群差異性小，制備工藝較為科學(xué)合理，形成的物質(zhì)基準(zhǔn)對應(yīng)實物對照圖譜能夠作為衡量DSD 物質(zhì)基準(zhǔn)對應(yīng)實物的標(biāo)準(zhǔn)參照物，結(jié)果見表2。

圖1 23 批DSD 物質(zhì)基準(zhǔn)對應(yīng)實物HPLC 指紋圖譜疊加圖Fig.1 HPLC fingerprint of 23 batches of DSD substance standard corresponding substance

圖2 DSD 物質(zhì)基準(zhǔn)對應(yīng)實物HPLC 共有模式圖 (A) 和混合對照品HPLC 圖 (B)Fig.2 Common pattern of HPLC fingerprint of DSD substance standard corresponding substance (A) and HPLC of mixed reference substances (B)

2.6 DSD 物質(zhì)基準(zhǔn)對應(yīng)實物指紋圖譜共有峰的歸屬

按供試品制備方法分別制備單味飲片供試品溶液、缺單味飲片供試品溶液、和DSD 物質(zhì)基準(zhǔn)對應(yīng)實物供試品溶液。取DSD 物質(zhì)基準(zhǔn)對應(yīng)實物、單味飲片、缺單味飲片供試品溶液按上述色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖。分別將DSD 物質(zhì)基準(zhǔn)對應(yīng)實物、單味飲片、缺單味飲片供試品溶液的色譜圖進(jìn)行疊加比較，對DSD 物質(zhì)基準(zhǔn)對應(yīng)實物指紋圖譜的色譜峰進(jìn)行歸屬分析，結(jié)果見圖3 和表3。 根據(jù)圖3 和表3 對DSD 物質(zhì)基準(zhǔn)對應(yīng)實物指紋圖譜中各共有峰進(jìn)行歸屬分析，DSD 物質(zhì)基準(zhǔn)對應(yīng)實物指紋圖譜共確認(rèn)25 個色譜峰，均可以在原料飲片中找到明確歸屬。具體歸屬情況為4、22 號峰歸屬于當(dāng)歸飲片；9、11、15 號峰歸屬于桂枝飲片；2、3、7 號峰歸屬于白芍飲片；1、4、19、20、23～25 號峰歸屬于細(xì)辛飲片；5、6、8～10、12～14、16～18、21 號峰歸屬于甘草；其中4 號峰為當(dāng)歸、細(xì)辛所共有，9 號峰為桂枝、甘草所共有。經(jīng)對照品指認(rèn)9 個色譜峰，分別為2 號峰芍藥內(nèi)酯苷、3號峰芍藥苷、4 號峰阿魏酸、5 號峰甘草苷、11 號峰肉桂酸、15 號峰鄰甲氧基桂皮醛、18 號峰甘草酸、22 號峰藁本內(nèi)酯和23 號峰細(xì)辛脂素，主要藥效成分的指認(rèn)率為36.0%。綜上可知，DSD 物質(zhì)基準(zhǔn)對應(yīng)實物的物質(zhì)群可清晰的追溯到飲片，且色譜峰歸屬明確，指認(rèn)率較高。

表2 23 批DSD 物質(zhì)基準(zhǔn)對應(yīng)實物HPLC 指紋圖譜相似度Table 2 Similarity of HPLC fingerprints of 23 batches of DSD substance standard corresponding substance

從色譜峰個數(shù)與峰強(qiáng)度看，甘草對指紋圖譜的貢獻(xiàn)最大，當(dāng)歸、桂枝、白芍和細(xì)辛對指紋圖譜的貢獻(xiàn)度相對較大，木通、大棗對指紋圖譜的貢獻(xiàn)較低。木通主要含三萜及其苷類，其指標(biāo)性成分木通苯乙醇苷B 在飲片炮制過程中損失嚴(yán)重，導(dǎo)致含量大幅度下降，在DSD 煎煮過程中由飲片轉(zhuǎn)移至水煎液的量極少，在此色譜條件下未檢測出色譜峰。大棗主要成分為多糖和氨基酸類物質(zhì)，水溶性大，含量較低，且大棗中指標(biāo)性成分齊墩果酸、白樺脂酸等物質(zhì)極性較小，由飲片轉(zhuǎn)移至水煎液的量極少， 在此色譜條件下不能檢出色譜峰。因此，木通、大棗2 味飲片，在本實驗色譜條件下難以獲得指紋圖譜信息。

圖3 DSD 物質(zhì)基準(zhǔn)對應(yīng)實物色譜峰歸屬Fig.3 Attribution of chromatographic peaks of DSD substance standard corresponding substance

表3 DSD 物質(zhì)基準(zhǔn)對應(yīng)實物共有峰歸屬情況Table 3 Attribution of common peaks of DSD substance standard corresponding substance

2.7 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的DSD 功效物質(zhì)預(yù)測分析

2.7.1 基于可測性和可追溯性的活性成分篩選 根據(jù)文獻(xiàn)研究，當(dāng)歸、桂枝共為DSD 的君藥，其中阿魏酸為藥典項下當(dāng)歸的質(zhì)量控制指標(biāo)，藁本內(nèi)酯為其揮發(fā)油主要成分；鄰甲氧基桂皮醛是桂枝揮發(fā)油主成分之一，肉桂酸為非揮發(fā)油成分，受熱較穩(wěn)定，具有抗菌、利膽、抗突變、抗腫瘤、抗疲勞等藥理作用[7]。白芍、細(xì)辛均為臣藥，其中芍藥苷為白芍的質(zhì)量控制指標(biāo)，具有鎮(zhèn)痛、解除痙攣、保護(hù)腦血管等作用，芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷等統(tǒng)稱為芍藥總苷，具有補(bǔ)血、抗抑郁等作用[8]；細(xì)辛主要活性成分為揮發(fā)油和木脂素類，細(xì)辛脂素為藥典項下細(xì)辛的質(zhì)量控制指標(biāo)，具有鎮(zhèn)痛、抗炎等作用[9-10]。甘草為佐藥，其活性成分為黃酮類、三萜類，甘草苷具有抗炎、抗菌、抗氧化等作用，甘草酸具有抗炎鎮(zhèn)咳、免疫調(diào)節(jié)等作用，均為藥典項下甘草含量測定的質(zhì)量控制指標(biāo)[11-12]。木通的主要成分為三萜、苷類成分，大棗的有效成分為多糖類。文獻(xiàn)研究結(jié)合DSD 的指紋圖譜研究，以上類別中9 個活性成分均能得到指認(rèn)，且能夠從飲片到物質(zhì)基準(zhǔn)對應(yīng)實物進(jìn)行傳遞?；诳蓽y性和可追溯性，將這9 個活性成分做為候選化合物。利用 NCBI 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）查找9 個候選化合物的Canonical SMILES，為后續(xù)DSD“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建做準(zhǔn)備。

2.7.2 DSD 主要成分成分的靶蛋點預(yù)測 將9 個活性成分的Canonical SMILES 編號分別導(dǎo)入Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫（http://www.swisstarget prediction.ch/）預(yù)測分析其對應(yīng)的靶蛋白，去除重復(fù)靶點，共得到與9 個活性化合物相關(guān)的271 個作用靶點。

2.7.3 蛋白-蛋白相互作用（ protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將篩選得到的271 個作用靶點導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/）構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，選擇物種為“Homo sapiens”，蛋白交互參數(shù)評分值為“high confidence＞0.9”，網(wǎng)絡(luò)顯示選項為“hide disconnected nodes in the network”，其余參數(shù)設(shè)置均保持不變，得到271 個靶蛋白的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖（圖4）。將分析結(jié)果以TSV文本格式導(dǎo)入 Cytoscape 3.7.1 軟件，并利用Cytoscape 3.7.1 軟件中的“Network Analyzer”功能對分析結(jié)果進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觯嬎氵x取度值（degree）、介數(shù)中心性（betweenness centrality）和接近中心性（closeness centrality）3 個重要拓?fù)鋮?shù)均大于中位數(shù)且度值≥10 的靶點作為關(guān)鍵靶點。經(jīng)篩選得到48 個關(guān)鍵靶點，結(jié)果見表4。

圖4 271 個靶蛋白的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 PPI network diagram of 271 target proteins

表4 靶點網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)Table 4 Topological properties of target network

2.7.4 基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析和京都基因和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析 將PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建篩選得到的48 個關(guān)鍵靶點利用David 6.8 數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/）對其進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG 通路富集分析。GO 功能富 集分析和KEGG 通路富集分析均根據(jù)“P≤0.01”和“Benjamini≤0.01”進(jìn)行篩選。

續(xù)表4

GO 功能富集分析共獲取97 個GO 條目。其中生物過程（biological process，BP）占62 條，細(xì)胞組成（cell composition，CC）占9 條，分子功能（molecular function，MF）占26 條。根據(jù)顯著性程度進(jìn)行部分展示，結(jié)果見圖5。BP 主要包括血小板活化、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1（extracellular regulated protein kinases 1，ERK1）和ERK2 級聯(lián)的正調(diào)控、藥物反應(yīng)、MAP 激酶活性的正調(diào)控等方面；CC 主要涉及質(zhì)膜、胞質(zhì)溶膠等過程；MF 主要涉及酶結(jié)合、蛋白激酶活性等過程。KEGG 通路富集分析共富集到78 條通路，根據(jù)顯著性程度進(jìn)行部分展示，結(jié)果見圖6。根據(jù)圖表可知，DSD 9 個活性成分富集的通路主要包括癌癥、磷脂酰肌醇-3-羥激酶-蛋白激酶B（phosphatidylinositol-3-hydroxykinase-protein kinase B，PI3K-Akt）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、瞬時受體電位（transient receptor potential，TRP）通道的炎性介質(zhì)調(diào)節(jié)等信號通路。

圖6 DSD KEGG 富集分析Fig.6 KEGG enrichment analysis of DSD

2.7.5 “成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 根據(jù)篩選得到的9 個活性成分、48 個關(guān)鍵靶點和78 條信號通路，運用Cytoscape 3.7.1 軟件，建立DSD“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果見圖7。由圖可知，DSD相關(guān)活性成分通過調(diào)控不同的蛋白靶點，作用于多條通路發(fā)揮治療作用。

圖7 DSD“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖Fig.7 “Ingredient-target-pathway” network diagram of DSD

2.7.6 整合分析 DSD 具有溫經(jīng)散寒、養(yǎng)血通脈等功效，主治血虛寒厥癥，臨床主要用于治療痛經(jīng)、糖尿病周圍神經(jīng)病變、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腫瘤等疾病。本研究通過文獻(xiàn)研究和指紋圖譜研究基于可測性和可追溯性對DSD 相關(guān)活性成分進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，并對其作用機(jī)制進(jìn)行探討分析。研究顯示，DSD 篩選得到9 個活性化合物，共獲得271 個靶點，通過構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)圖并選用度值、接近中心性、介數(shù)中心性3 個拓?fù)鋮?shù)進(jìn)行分析，篩選得到48 個關(guān)鍵靶點。

經(jīng)分析，DSD 9 個活性成分可能通過作用于去甲腎上腺素受體（norepinephrine receptor，ADR）發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，作用于乙酰膽堿受體（acetylcholine receptor，CHRM）影響神經(jīng)信號傳導(dǎo)[13]；蛋白激酶C（protein kinase C，RKC）是G 蛋白偶聯(lián)受體系統(tǒng)中的效應(yīng)物，通過抑制PKC 的激活，改善皮膚微血管血流紊亂和微血管功能障礙[14]；IL-2 屬于炎癥因子，可用于調(diào)控炎癥反應(yīng)，VEGFA 能夠引起血管新生，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制VEGFA、IL-2 的表達(dá)可減輕疼痛和炎癥反應(yīng)[15-16]；ESR1 對生殖功能、性發(fā)育有重要作用，同時與痛覺傳遞有關(guān)，可用于調(diào)節(jié)陰陽，穩(wěn)定生理功能[17-18]；基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）能夠抑制癌細(xì)胞的侵襲與遷移，達(dá)到治療癌癥的作用[19-20]。

GO 功能富集分析顯示，共獲取97 個GO 條目，主要包括血小板活化、MAPK 級聯(lián)的正調(diào)節(jié)、MAP激酶活性的正調(diào)控等生物過程，質(zhì)膜、胞質(zhì)溶膠等細(xì)胞組成和酶結(jié)合、蛋白激酶活性等分子功能，主要以生物過程為主，涉及神經(jīng)-激素分泌調(diào)節(jié)、細(xì)胞生長增殖、能量代謝等生物學(xué)過程。

KEGG 通路富集分析顯示，DSD 9 個活性成分主要涉及癌癥、PI3K-Akt、MAPK、TRP 通道的炎性介質(zhì)調(diào)節(jié)等信號通路。經(jīng)研究，MAPK 信號通路參與細(xì)胞多種生理過程，是重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)之一，與炎癥、腫瘤等多種疾病有關(guān)[16]；PI3K-Akt、MAPK 信號通路與細(xì)胞增殖、凋亡有關(guān)，通過調(diào)控PI3K-Akt、MAPK 等信號通路能夠抑制癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，促進(jìn)造血和血小板生成，有可能是發(fā)揮補(bǔ)血、活血作用的重要通路[21-22]；TRP 通路是一類離子通道，與炎癥和疼痛的發(fā)生密切相關(guān)，通過調(diào)控TRP 通路，拮抗TRPV1 等TRP 通道家族成員，緩解關(guān)節(jié)炎疼痛，常用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)等疾病[23-24]；叉頭型轉(zhuǎn)錄因子的O亞型（forkhead transcription factor of the O class，F(xiàn)OXO）、低氧誘導(dǎo)因子1（hypoxia-inducible factor 1，HIF-1）等信號通路與造血功能有關(guān)，通過調(diào)控以上通路能夠促進(jìn)O2、營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運，使細(xì)胞免受缺氧損傷，促進(jìn)血管和紅細(xì)胞生成[25]。同時，卻丹華等[16]研究發(fā)現(xiàn)，DSD 可通過調(diào)控MAPK、花生四烯酸等信號通路治療痛經(jīng)；李文婷等[26]、張伏芝[27]研究發(fā)現(xiàn)通過調(diào)控MAPK、PI3K-Akt、HIF-1、晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）等信號通路能夠治療糖尿病周圍神經(jīng)病變；程邦[28]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)DSD 通過調(diào)控TNF、HIF-1、癌癥通路、雌激素、VEGF 等信號通路干預(yù)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。由此推測，DSD 中關(guān)鍵效應(yīng)成分可通過作用于多個靶點，干預(yù)多條通路達(dá)到溫經(jīng)散寒、養(yǎng)血通脈的作用。

基于指紋圖譜和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，阿魏酸、肉桂酸、芍藥苷等9 個成分具有傳遞性和溯源性，且與DSD 的功能屬性密切相關(guān)，可預(yù)測其為影響DSD品質(zhì)的潛在功效關(guān)聯(lián)物質(zhì)。

3 討論

DSD 由當(dāng)歸、桂枝等7 味藥組成，成分復(fù)雜，為了盡可能全面的分析其所含的化學(xué)成分，本研究對色譜條件和供試品提取條件進(jìn)行考察。通過考察不同的檢測波長（237、245、280、290、316 nm）、流動相系統(tǒng)（甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.05%甲酸水溶液、乙腈-0.05%磷酸水溶液）、色譜柱（Waters XBridge C18色譜柱、Merck Purospher Star LP RP18endcapped 色譜柱、Hanbon Hedera ODS-2 色譜柱）、體積流量（0.6、0.8、1.0 mL/min）、柱溫（25、30、35 ℃）等項目，確立了DSD 指紋圖譜分析方法中色譜條件的關(guān)鍵要素：色譜柱為 Waters XBridge C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測波長245 nm；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；流動相為乙腈- 0.05%磷酸水溶液；梯度洗脫；結(jié)合DSD 組成藥味的藥典提取方法對供試品溶液的提取溶劑種類（甲醇、乙醇）和提取溶劑體積分?jǐn)?shù)（0、30%、50%、70%醇溶液）進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)以70%甲醇為提取溶劑時色譜峰基線平穩(wěn)，提取情況較佳，因此，選擇70%甲醇超聲提取。通過以上研究，確立DSD 指紋圖譜的分析方法。

經(jīng)典名方由多味藥組成，成分復(fù)雜，具有多成分、多靶點、多通路的特點，同時經(jīng)典名方的組方配伍又注重君臣佐使的配伍關(guān)系，通過組方配伍對相關(guān)疾病進(jìn)行治療，使其作用機(jī)制研究困難。本實驗以指紋圖譜為指標(biāo)，全面考察DSD 原料飲片-物質(zhì)基準(zhǔn)對應(yīng)實物的關(guān)鍵質(zhì)量屬性的傳遞性。結(jié)果顯示，DSD 物質(zhì)基準(zhǔn)對應(yīng)實物共確認(rèn)25 個峰，指認(rèn)9 個色譜峰，均能在原料飲片中找到明確歸屬。從色譜峰個數(shù)與峰強(qiáng)度看，甘草對指紋圖譜的貢獻(xiàn)最大，當(dāng)歸、桂枝、白芍和細(xì)辛對指紋圖譜的貢獻(xiàn)度相對較大，木通、大棗對指紋圖譜的貢獻(xiàn)較低。木通指標(biāo)性成分木通苯乙醇苷B 在飲片炮制過程中損失嚴(yán)重，導(dǎo)致含量大幅度下降，在DSD 煎煮過程中由飲片轉(zhuǎn)移至水煎液的量極少，在此色譜條件下未檢測出色譜峰；大棗主要成分為多糖和氨基酸類物質(zhì)，水溶性大，含量較低，在此色譜條件下未檢出色譜峰。因此，木通、大棗2 味飲片，在本實驗條件下難以獲得指紋圖譜信息，后期可結(jié)合其他質(zhì)量控制方法對其進(jìn)行全面的質(zhì)量控制。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)主要是基于系統(tǒng)生物學(xué)的理論，對生物系統(tǒng)的網(wǎng)絡(luò)分析，選取特定信號節(jié)點進(jìn)行多靶點藥物分子設(shè)計的新學(xué)科，具有系統(tǒng)性與整體性的特點，可用于闡釋及分析中藥復(fù)方制劑配伍之間的作用關(guān)系及作用機(jī)制[29-31]。本實驗將指紋圖譜與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相結(jié)合，通過對經(jīng)典名方DSD 進(jìn)行指紋圖譜研究，并采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)識別技術(shù)，構(gòu)建DSD的“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測分析與DSD 的功能主治密切相關(guān)的核心靶點、信號通路及功效關(guān)聯(lián)物質(zhì)，進(jìn)一步推進(jìn)對經(jīng)典名方復(fù)方制劑作用機(jī)制的研究。

本研究基于指紋圖譜及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，分析預(yù)測DSD 溫經(jīng)散寒、養(yǎng)血通脈功效關(guān)聯(lián)物質(zhì)，為后期DSD 復(fù)方制劑全方位的質(zhì)量控制及作用機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)，有助于建立全過程的質(zhì)量控制體系，提高中藥產(chǎn)業(yè)質(zhì)量控制水平。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突