鄭 燕，江 媛， 馮 展，曾鐵鑫，繆雨靜，張 翔，黃林芳*

1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，國家中醫(yī)藥管理局中藥資源保護(hù)重點(diǎn)研究室，北京 100193

2.中藥資源教育部工程研究中心，北京 100193

3.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330000

4.大理大學(xué)，云南 大理 671000

丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhizaBge.的干燥根和根莖[1]，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，后世《吳普本草》《日華子本草》等均有記載[2-5]?，F(xiàn)代藥理研究表明，丹參具有多種生物學(xué)活性，包括抗腫瘤、抗菌、消炎和心血管保護(hù)作用，常用于治療冠心病、肝炎、神經(jīng)衰弱等疾病[6-9]。近年來，國內(nèi)外學(xué)者研究了丹參的抗腫瘤和心血管疾病的保護(hù)作用[10-12]及在流行性感冒病毒（influenza virus）感染過程中的抗流感病毒和免疫調(diào)節(jié)的作用[13]。

流感是一種具有高發(fā)病率和死亡率的病毒感染性疾病，嚴(yán)重威脅著人類健康，近年來，全世界每年約有50 萬人死于流感病毒[14-15]。流行性感冒病毒是正粘病毒科（Orthomyxoviridae）的代表種，簡稱流感病毒[16]。人流感病毒分為甲、乙、丙3 型，且甲型流感易于變異[17]。目前，市場上有2 種主要類型的抗流感藥物，為奧司他韋和扎那米韋。但這些抗流感藥物存在較多不良反應(yīng)[18-19]。因此，尋找和開發(fā)抗流感的中藥資源迫在眉睫。

超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜儀（UPLC-Q-TOF-MS）是一種先進(jìn)的化學(xué)成分定量和定性分析工具[20]。本研究通過UPLC-Q-TOF-MS 鑒定了丹參提取物的化學(xué)成分，將主要化學(xué)成分與神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase，NA）對接，以可視化的方式探索其對流感病毒的抑制作用，再進(jìn)行NA 抑制實(shí)驗(yàn)，以進(jìn)一步探索其抑制活性。實(shí)驗(yàn)流程見圖1。

圖1 實(shí)驗(yàn)流程Fig.1 Flow chart

1 材料

Acquity UPLC-Synapt MS 色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（包括MassLynx V4.1 質(zhì)譜工作站，美國Waters 公司），PURELAB Classic-UVF 純水機(jī)（英國ELGA 公司）。甲醇（色譜純，F(xiàn)isher），甲酸（色譜純），超純水，其他試劑為分析純。

對照品紫草酸（質(zhì)量分?jǐn)?shù) 98.1%，批號1053003）、迷迭香酸（質(zhì)量分?jǐn)?shù)95%，批號111871- 201102）、丹酚酸A（質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.3%，批號171217）、丹酚酸B（質(zhì)量分?jǐn)?shù)94.1%，批號150927）、丹參酮IIA（質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.5%，批號110766-201121）、二氫丹參酮（質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.9%，批號11041211）、隱丹參酮（質(zhì)量分?jǐn)?shù)94.8%，批號110852-201107）和丹參酮I（質(zhì)量分?jǐn)?shù)97.6%，批號110867-201107）購自成都曼思特生物科技有限公司。奧司他韋酸（質(zhì) 量分?jǐn)?shù)＞98%，批號S80494）購自Medchem Express（美國新澤西州Monmouth Junction）；NA 抑制劑篩選試劑盒（批號P0309），碧云天生物技術(shù)有限公司（中國上海）。

新鮮丹參采自云南省大理市，經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所黃林芳教授鑒定為唇形科鼠尾草屬植物丹參S.miltiorrhizaBge.的干燥根及根莖，樣品（CMPB04801）存放在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所標(biāo)本館。

2 方法

2.1 待測樣品制備

將干燥丹參樣品粉碎為細(xì)粉，取500 g 細(xì)粉，加入2.5 L 石油醚，浸泡24 h，后回收石油醚，得石油醚提取物。殘?jiān)鼡]去石油醚，殘?jiān)?0%乙醇回流提取3 次，每次2 h；合并提取液，減壓回收乙醇至無醇味，用等體積醋酸乙酯萃取2 次，合并醋酸乙酯萃取液（上層），濃縮至干，得醋酸乙酯萃取物。為進(jìn)一步評估石油醚和乙醇提取物的抗流感病毒活性，使用UPLC-Q-TOF-MS 對活性更好的提取物進(jìn)行定性分析。取初提物，溶于甲醇，使其質(zhì)量濃度為5 mg/mL，后用0.22 μm 微孔膜濾過，既得供試品溶液[21-23]。

2.2 UPLC-Q-TOF-MS 分析

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流動相：0.1%的甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～2 min，5% B；2～4 min，5%～10% B；4～8 min，10%～15% B；8～18 min，15%～20% B，18～22 min，20%～30% B。進(jìn)樣量 2 μL，進(jìn)樣溫度15 ℃。

2.2.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧電離離子源（ESI），正/負(fù)離子模式檢測m/z100～1200，毛細(xì)管電壓2.2 kV（ESI?）或3.0 kV（ESI+），錐孔電壓10～40 kV，離子源溫度100 ℃，脫溶劑溫度450 ℃，霧化氣N2，體積流量60 L/h，脫溶劑氣N2，體積流量800 L/h，碰撞氣Ar，碰撞壓力7.066 mPa，質(zhì)量校正質(zhì)核比m/z556.277 1。使用甲酸鈉校準(zhǔn)質(zhì)譜儀，用亮氨酸-腦啡肽以5 μL/min 的恒定體積流量進(jìn)行外部參考。

2.3 NA 抑制實(shí)驗(yàn)

參照試劑盒說明書，神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(yàn)在96孔微培養(yǎng)板中進(jìn)行。設(shè)置5 個樣品組（樣品質(zhì)量濃度分別為25、50、100、150、200 μg/mL），5 個陽性藥組（陽性藥質(zhì)量濃度分別為25、50、100、150、200 μg/mL）及1 個空白組，樣品組及陽性藥組設(shè)置3 個重復(fù)。向每個孔中添加70 μL 緩沖液和10 μL NA，后分別向樣品組添加丹參提取物，向陽性藥組添加奧司他韋酸，進(jìn)行振動混合1 min，然后在37 ℃下反應(yīng)2 min。加入10 μL NA 熒光底物后，將混合物在37 ℃和30 min 振動1 min。將激發(fā)波長設(shè)置為322 nm，發(fā)射波長設(shè)置為450 nm，在微孔板分光光度計(jì)上讀取熒光值。按照公式計(jì)算抑制率。

Fm為無藥孔的熒光值，F(xiàn)s為樣品的熒光值，F(xiàn)0為空白組的熒光值

2.4 統(tǒng)計(jì)分析

使用IBM 19（BM SPSS，美國伊利諾伊州芝加哥）[24]計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50）。

3 結(jié)果

3.1 丹參不同提取物的NA 活性測定

乙醇和石油醚提取物的NA 抑制活性見圖2，奧司他韋酸作陽性對照。結(jié)果表明，乙醇提取物比 石油醚提取物具有更強(qiáng)的NA 抑制活性。乙醇提取物的抑制活性隨濃度的增加而增加，故采用UPLC-Q-TOF-MS 分析丹參乙醇提取物。

圖2 丹參石油醚醚及乙醇提取物的NA 抑制活性Fig.2 NA inhibitory activity of PE and ethanol extract of S.miltiorrhiza

3.2 丹參的UPLC-Q-TOF-MS 分析

由于丹酚酸和丹參酮分別在負(fù)離子和正離子掃描模式下敏感，因此在正離子和負(fù)離子模式下均可獲得丹參的質(zhì)譜圖（圖3）。根據(jù)保留時間、分子離子、主要碎片并根據(jù)文獻(xiàn)，初步確定了36 種化合物[25-34]。鑒定出的化合物大致分為酚酸和醌，主要化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖4，化合物信息見表1。

圖3 丹參乙醇提取物的基峰色譜圖Fig.3 Base peak chromatogram (BPC) of ethanol extract of S.miltiorrhiza

由于丹參顯著的藥理活性，紫草酸、丹參酸、丹酚酸A、丹酚酸B、迷迭香酸、原兒茶醛、原兒茶酸和其他衍生物引起了相當(dāng)大的關(guān)注[39-40]。丹酚酸B 通常用作丹參的質(zhì)量指標(biāo)。丹參中的大多數(shù)酚酸由咖啡酸衍生物組成。負(fù)離子掃描模式中丹酚酸B 的主要片段為m/z5193 21。據(jù)推測，它去除了1個丹參素，形式為m/z519.1，去除了2 個丹參素，形式為m/z32。

大多數(shù)丹參二萜類化合物，如二氫丹參酮I、丹參酮IIA、丹參酮I 和隱丹參酮，均具有 [2M＋Na]+的二聚體[41]。這些二萜類化合物的碎片離子主要為H2O、CH3和CO。丹參酮IIA在正離子掃描模式下的主要碎片為m/z280、277、262、252、249。我們推測m/z280 由m/z295 去除甲基（-CH3），m/z277 通過m/z295 脫水（-H2O），m/z262 通過m/z277去除甲基（-CH3），m/z249 通過去除m/z280 中的一氧化碳（-CO）導(dǎo)致m/z277 和m/z252 中的一氧化碳（-CO）損失。

3.3 主要化合物的分子對接

分子對接是分子建模的重要方法之一。其本質(zhì)是2 個或更多分子之間的識別。該過程涉及分子之 間的空間匹配和能量匹配[42]。分子對接操作環(huán)境2014.09（Chemical Computing Group Inc，Montreal，QC，Canada）和蛋白質(zhì)晶體（PDB ID：3TI3）來自PDB 數(shù)據(jù)庫（http://www.rcsb.org/pdb）[43]。本研究旨在模擬NA 與丹參主要成分的識別與對接，并比較NA 抑制實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。本研究選擇8 種主要化合物，即紫草酚酸、迷迭香酸、丹酚酸A、紫草酚酸B、丹參酮IIA、二氫丹參酮I、二氫丹參酮、隱丹參酮和丹參酮I，利用PharmaDB 目標(biāo)數(shù)據(jù)庫將這些化合物連接到3TI3，自由能絕對值高，生物活性高。表2 結(jié)果表明，上述化合物生物活性大小分別為丹參酮I（?38.908 kJ/mol）＞丹參酮II（?7.826 kJ/mol）＞丹酚酸B（?6.528 kJ/mol）＞紫草酸（?5.549 kJ/mol）＞迷迭香酸（?4.207 kJ/mol）＞二氫丹參酮（3.013 kJ/mol）＞隱丹參酮（?2.419 kJ/mol）＞丹酚酸A（?0.508 kJ/mol）。自由能絕對值最高的前4 種化合物與NA 的結(jié)合方式見圖5。

3.4 丹參主要化合物的NA 活性測定

圖4 丹參主要化合物的結(jié)構(gòu)Fig.4 Structural formula of main compounds from S.miltiorrhiza

表1 UPLC-Q-TOF/MS 鑒定丹參乙醇提取物中的36 種成分Table 1 Thirty-six constituents identified in ethanol of S.miltiorrhiza extracts by UPLC-Q-TOF/MS

續(xù)表1

表2 丹參中8 種化合物的自由能值Table 2 Free energy values of eight compounds of S.miltiorrhiza

NA 是分布在流感病毒包膜上的糖蛋白，被認(rèn)為是篩選抗甲型和乙型流感藥物的重要靶標(biāo)。結(jié)果表明，與石油醚提取物相比，丹參的乙醇提取物對 NA 的抑制作用更好。為了確認(rèn)提取物的生物活性化合物，篩選了鑒定出的8 種標(biāo)準(zhǔn)化合物的NA 抑制活性。奧司他韋酸用作陽性對照。結(jié)果表明，8種化合物均顯示抑制活性，并顯示出劑量相關(guān)性作用（圖6）。8 種化合物的抗流感病毒IC50依次為紫草酚酸（157.44 mol/L）＞迷迭香酸（204.74 mol/L）＞丹參酮IIA（300.74 mol/L）＞丹酚酸A（307.86 mol/L）＞丹參酸B（310.07 mol/L）＞二氫丹參酮（321.47 mol/L）＞奧司他韋酸（361.83 mol/L）＞丹參酮I（566.09 mol/L）＞隱丹參酮（584.57 mol/L）。研究結(jié)果表明，丹參提取物在體外具有抗流感病毒 的活性，因此丹參具有抗病毒潛力，但尚需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

圖5 與NA 對接的化合物的三維 (1) 和二維 (2)圖 Fig.5 Three-dimensional (1) and two-dimensional (2) maps of compounds docking with NA

4 討論

流感是一種具有高度傳染性的疾病，可導(dǎo)致高發(fā)病率和死亡率?？共《舅幬锸侵委熈鞲械挠行Х椒?，但是由于流感病毒的頻繁突變，流感對藥物逐漸產(chǎn)生抗藥性。由于流感病毒對藥物的廣泛耐藥性，開發(fā)了市場上的扎那米韋、奧司他韋和帕拉米韋等藥物。但是，這些藥物具有副作用和其他缺點(diǎn)。因此，迫切需要尋找新的天然藥物資源。然而，一些天然中草藥具有抗流感作用，本研究為探究丹參的抗流感作用，通過UPLC-Q-TOF-MS 鑒定了丹參提 取物的化學(xué)成分，并結(jié)合了NA 活性測定和分子對接技術(shù)對主要活性成分進(jìn)行了評估。初步確定了36 種化合物。其中，4 種化合物（紫草酚酸、迷迭香酸、丹參酮IIA、丹酚酸A）與NA 的親和性良好。上述化合物均顯示出NA抑制活性，其中丹酚酸A表現(xiàn)最佳。

圖6 丹參乙醇提取物的8 種成分的神經(jīng)氨酸酶抑制活性 ( ± s , n=3, a) 和IC50 (b)Fig.6 Neuraminidase inhibitory activity of eight constituents of ethanol extracts in S.miltiorrhiza ( ± s , n=3, a) and IC50 (b)

中藥是中國中醫(yī)藥事業(yè)傳承和發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)，中藥又因其含有許多化學(xué)成分，具有復(fù)雜性、多樣性的特點(diǎn)，近年來研究發(fā)現(xiàn)中藥在預(yù)防和治療流感病毒中發(fā)揮極其重要的作用[44]。丹參是大宗藥材，迄今已有2000 多年藥用歷史，具有較高的藥用價(jià)值。明晰其化學(xué)成分，探究其主要化合物（紫草酚酸、迷迭香酸、丹參酮IIA及丹酚酸A）對NA 的抑制活性，為將其開發(fā)為抗流感病毒的中藥資源提供了理論依據(jù)。

丹參可能通過多途徑、多靶點(diǎn)發(fā)揮抗病毒作用，為明晰其抗流感機(jī)制，還需對其體內(nèi)抗病毒作用機(jī)制進(jìn)行深入研究，為其臨床抗流感病毒應(yīng)用提供理論支撐。為進(jìn)一步探究丹參抗流感潛在應(yīng)用價(jià)值，課題組后期將在體內(nèi)外對紫草酚酸，迷迭香酸，丹參酮IIA及丹酚酸A 的抗流感機(jī)制進(jìn)行深入研究，進(jìn)一步闡明丹參抗流感病毒的機(jī)制。本研究為抗流感新藥的研發(fā)提供了參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突