何 迅，王津濤，鄭田利，鄒曉莉，游 蘭，李晶晶，嚴 純，左浩江，許 欣，裴曉方*

（1.四川大學(xué) 華西公共衛(wèi)生學(xué)院（華西第四醫(yī)院），四川 成都 610041；2.食品安全監(jiān)測與風(fēng)險評估四川省重點實驗室，四川 成都 610041）

白酒是中國傳統(tǒng)的蒸餾酒，經(jīng)固態(tài)發(fā)酵、固態(tài)蒸餾、貯藏和勾兌等步驟制得[1]，是中國獨有的特色產(chǎn)品。其按照主體香氣成分可分為濃香型、醬香型和清香型等12種[2]。白酒由酒精、水和微量成分組成，其中微量成分是主要功能性成分，來源于發(fā)酵過程中微生物和酶的催化反應(yīng)、貯存過程中的化學(xué)變化以及生產(chǎn)原料特殊的化學(xué)反應(yīng)[3-5]。多項研究均顯示適量飲酒確是有益于健康[6-10]。白酒中的川穹嗪[11]、芳香族化合物[12]、4-萜烯醇[13]等微量成分對人體均具有一定有益作用。選擇性改變非酒精成分可減少酒精對人類的有害影響。但目前缺乏對不同香型白酒的整體性研究比較，且非酒精成分在體內(nèi)的作用途徑及對機體的影響的研究也很少。

白酒經(jīng)口入胃后，在胃腸道通過生物膜進入血液循環(huán)，迅速地在各組織器官進行代謝。經(jīng)胃腸道吸收的酒精約90%在肝臟代謝，因此對肝臟的影響最為明顯[14]。血液中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）水平的升高在臨床上通常作為酒精性肝損傷的標(biāo)志[15]。但對于飲酒后機體的早期細微變化，僅通過ALT、AST等血清學(xué)指標(biāo)較難反映。轉(zhuǎn)錄組是細胞或組織中基因在特定狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄出的所有核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）的總和，能反映出不同生理狀態(tài)下機體基因的表達情況[16]。在轉(zhuǎn)錄組研究中基因芯片是應(yīng)用最廣泛的技術(shù)，可同時快速測定成千上萬個基因活動[17]。因此本研究采用氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術(shù)檢測不同香型白酒中的非酒精成分，并以此為基礎(chǔ)，從血清學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)兩方面，探索攝入適量[18]不同香型白酒后，SD大鼠肝腎功能和基因表達變化，初步探討適量飲用不同香型白酒對健康的潛在影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級健康成年雄性SD大鼠60只（體質(zhì)量215～235 g）：由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，飼養(yǎng)于四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院屏障級動物房。飼養(yǎng)環(huán)境溫度21～25 ℃，相對濕度50%～60%。實驗協(xié)議（No.K2016042）獲得四川大學(xué)動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)（成都）。

4種白酒樣品：（酒樣1、酒樣2：不同品牌52°濃香型白酒；酒樣3：53°醬香型白酒；酒樣4：53°清香型白酒）：市售；酒精對照：蒸餾水配制成體積分數(shù)53.0%的乙醇溶液。

無水乙醇：上海安譜實驗科技服份有限公司；2-甲基丁酸、2-甲基吡嗪：美國Chem Service公司；2-乙基-3甲基吡嗪、四-甲基吡嗪：美國Chromadex公司；RNeasy Mini Kit試劑盒：Qiagen公司；Trizol@Reagent：美國Invitrogen公司；DB-WAX毛細管柱（30.0 m×0.25 mm，0.25 μm），Quick Amp Labeling Kit One-Color 試劑盒：美國Agilent公司；10×Tris硼酸緩沖液：成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司；DNase/RNase-Free去離子水：天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A-5975C氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀、P/N G2545A微列陣雜交爐、P/N G2565BA芯片掃描儀：美國Agilent公司；AU-400全自動生化分析儀：日本Olympus公司；PICO 21高速離心機、ST 16R高速冷凍離心機、NanoDrop ND-1000超微量分光光度計：美國Thermo Scientific公司；PowerPace Basic電泳儀：美國BIO-RAD公司。

1.3 方法

1.3.1 GC-MS測定不同香型白酒中主要非酒精成分

（1）有機非酒精成分測定

酒樣經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，以2-甲基丁酸（5 mg/mL）為內(nèi)標(biāo)，上樣量1 μL。色譜條件：DB-WAX毛細管柱；載氣為氦氣（He）；流速1 mL/min；程序升溫。質(zhì)譜條件：離子源溫度230 ℃；電子能量70 eV；四極桿溫度150 ℃；溶劑延遲7 min；全掃描模式質(zhì)量掃描范圍30～500 amu，內(nèi)標(biāo)定量。

（2）主要吡嗪類化合物測定

樣品稀釋定容后直接測定或用二氯甲烷萃取濃縮后測定，以喹啉（25 μg/mL）為內(nèi)標(biāo)。上樣量1 μL。

色譜條件：DB-WAX毛細管柱；分流比10∶1；載氣為氦氣（He）；流速1.0 mL/min；程序升溫。質(zhì)譜條件：離子源溫度230 ℃；電子能量70 eV；四級桿溫度150 ℃；溶劑延遲時間2min；全掃描模式質(zhì)量掃描范圍50～200 amu，內(nèi)標(biāo)定量。

1.3.2 實驗動物分組及處理

60只SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)后隨機分為6組：空白對照組（Water組），酒精對照組（EtOH組），濃香型白酒1組（Strong1組），濃香型白酒2組（Strong2組），醬香型白酒組（Sauce組），清香型白酒組（Light組）；每組各10只。實驗組以約0.64 mL/100 g體質(zhì)量劑量[19]灌胃不同酒樣，酒精對照組及空白對照組分別灌胃等量的體積分數(shù)53%的乙醇溶液和蒸餾水。每天灌胃一次連續(xù)灌胃5周。實驗期間動物自由飲水及攝食，每周稱質(zhì)量一次。

灌胃結(jié)束后大鼠禁食16 h，稱質(zhì)量。腹腔注射2%的戊巴比妥鈉麻醉，取動脈血，靜置后分離血清，小管分裝并凍存于-20 ℃冰箱。隨后頸椎脫位法處死，收集所需臟器，稱濕質(zhì)量，計算臟器系數(shù)。臟器系數(shù)計算公式如下：

1.3.3 血清學(xué)指標(biāo)檢測

使用自動生化分析儀測定血清中的ALT、AST、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、肌酐（creatinine，Cr）等血清學(xué)指標(biāo)。

1.3.4 微陣列檢測

Trizol法提取肝組織總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄、標(biāo)記、純化、雜交、孵育后，采用安捷倫DNA微陣列掃描儀清洗、固定、掃描雜交序列。

使用Agilent Microarray Scanner 11.0.1.1軟件進行微陣列圖譜掃描，Agilent Feature Extraction軟件進行圖譜分析。使用Agilent Gene Spring GX 11.5軟件進行分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化和后續(xù)數(shù)據(jù)處理。Log2（Foldchange）≥1且P＜0.05的基因認為是顯著性差異表達基因。采用GO功能富集分析和KEGG通路富集分析對所得差異基因進行富集分析。

1.3.5 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析采用SPSS 19.0軟件，連續(xù)變量以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用單因素方差分析或非參數(shù)檢驗，P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同香型白酒的非酒精成分分析

白酒非酒精成分中的吡嗪類化合物有著特殊的作用。其不光能作為香味成分，還具有抗氧化[20]、抗炎[21]的功效，還有研究發(fā)現(xiàn)其可抑制幽門螺旋桿菌相關(guān)毒力基因的轉(zhuǎn)錄和表達[22]。四甲基吡嗪又名川芎嗪，具有擴張血管、改善微循環(huán)及抑制血小板積聚的作用[23]，還有保肝、護肝、防止肝纖維化等功效[24]。吡嗪化合物雖有一定健康功效，但中長期大量使用可導(dǎo)致血清球蛋白減少，血清肌酐和血糖增加[25]。因此，對飲用白酒的健康效果仍需謹慎評價。吡嗪類化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見圖1。

圖1 吡嗪類化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of pyrazine standard solution analysis by GC-MS

由圖1可見，全掃描模式下3種吡嗪類化合物和內(nèi)標(biāo)的色譜峰形及分離效果均較好。在該條件下對不同香型白酒中吡嗪類化合物含量進行檢測，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，不同香型白酒中3種主要吡嗪類化合物含量存在較大差異：濃香型白酒1組中的吡嗪類化合物以2-乙基-3-甲基吡嗪為主，所測得的含量為0.17 μg/mL，其他三組白酒中均以2,3,5,6-四甲基吡嗪為主要吡嗪類化合物，且醬香型白酒中的四甲基吡嗪含量高達17.03 μg/mL，遠高于其他測試酒樣。除醇類物質(zhì)以外，濃香型白酒1組中含有較高含量的己酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸乙酯等酯類和糠醛；除酯類物質(zhì)外，濃香型白酒2另含有較高的糠醛、丙酮等醛酮類組分。醬香型白酒中含有較高的乳酸乙酯、乙酸乙酯、戊酸乙酯等酯類以及丙酮、乙醛等醛酮物質(zhì)；清香型白酒中除酯類物質(zhì)外，還含有較高含量的糠醛。

圖2 不同香型白酒中的主要吡嗪類化合物檢測結(jié)果Fig.2 Detection results of main pyrazine compounds in different flavor Baijiu

2.2 不同香型白酒對SD大鼠基線體征及肝腎功能影響

實驗結(jié)束時，除濃香型白酒2組有3只大鼠死亡外，其余各組大鼠身體及精神狀態(tài)均良好。處理組大鼠體質(zhì)量、臟器系數(shù)及肝、腎功能指標(biāo)變化見表1。由表1可知，處理組大鼠體質(zhì)量、臟器系數(shù)均較空白組無統(tǒng)計學(xué)差異，且實驗組大鼠血清AST、Cr、BUN水平無顯著改變，而濃香型白酒2組的血清ALT水平較酒精對照組顯著升高（P＜0.05）。說明短期適量飲用白酒對SD大鼠肝腎功能影響有限，與濃香型白酒2組相比，其他白酒中的某些非酒精成分可能對酒精所致的肝功障礙有一定保護作用。

表1 不同香型白酒中非酒精成分對大鼠臟器指數(shù)及肝腎功能的影響Table 1 Effect of non-alcoholic ingredients on viscera index and liver and kidney functions in different flavor Baijiu

2.3 不同香型白酒對大鼠肝臟基因表達譜及相關(guān)通路影響

2.3.1 mRNA差異表達情況

兩組間mRNAs的顯著差異表達情況見圖3。由圖3可知，與空白組相比，濃香型白1組有369條差異基因表達顯著上調(diào)，216條差異基因顯著性表達下調(diào)；濃香型白酒2組有1 014條差異基因表達顯著上調(diào)，428條差異基因顯著性表達下調(diào)；醬香型白酒組有927條差異基因表達顯著上調(diào)，510條差異基因顯著性表達下調(diào)；清香型白酒組有1 048條差異基因表達顯著上調(diào)，558條差異基因顯著性表達下調(diào)；酒精對照組有803條基因表達上調(diào)，408條基因表達下調(diào)。除濃香型白酒1組外，其余香型白酒引起的上調(diào)或下調(diào)的基因數(shù)均高于酒精對照。

圖3 差異表達基因的火山圖Fig.3 Volcano plot of differentially expressed genes

2.3.2 GO和KEGG富集分析

GO功能富集分析能從生物學(xué)過程（biological process，BP）、細胞學(xué)組分（cellular components，CC）和分子生物學(xué)功能（molecular function，MF）三個方面對基因功能進行描述，部分結(jié)果見圖4。

由圖4可知，濃香型白酒1組中，在BP分類中，化學(xué)應(yīng)激、生物調(diào)節(jié)、刺激反應(yīng)相關(guān)功能基因差異性表達上調(diào)，免疫系統(tǒng)過程、長鏈脂肪酸代謝過程、苦味感受相關(guān)功能基因差異性下調(diào)；在CC分類中，膜組成成分、固有成分相關(guān)功能基因差異性上調(diào)而與自噬體膜相關(guān)功能基因差異性表達下調(diào)；在MF分類中，差異基因上調(diào)主要富集在嗅覺感受器活動、信號受體活性相關(guān)功能上，下調(diào)基因富集在嘌呤核糖核苷三磷酸結(jié)合、嘌呤核糖核酸結(jié)合等功能上。

圖4 GO功能富集分析部分結(jié)果Fig.4 Some results of GO functional enrichment analysis

濃香型白酒2組中，在BP分類中，差異性上調(diào)基因主要富集在多細胞生物過程、細胞表面受體信號通路等相關(guān)功能，差異下調(diào)基因富集在免疫系統(tǒng)相關(guān)功能上；在CC分類中，膜的固有成分、膜組成成分相關(guān)功能表達基因上調(diào)，中間纖維細胞骨架相關(guān)功能基因表達下調(diào)；在MF分類中，SMAD蛋白結(jié)合相關(guān)功能基因差異性上調(diào)表達，CCR趨化因子受體結(jié)合相關(guān)功能基因表達下調(diào)。

醬香型白酒組中，在BP分類中，差異性上調(diào)的基因富集在肝膽管系統(tǒng)發(fā)育、后腎發(fā)育調(diào)節(jié)、肝臟發(fā)育相關(guān)功能上，而免疫系統(tǒng)過程、免疫系統(tǒng)過程的正向調(diào)節(jié)、對外部刺激應(yīng)答相關(guān)功能基因表達下調(diào)；在CC分類中，核質(zhì)相關(guān)功能基因表達上調(diào)，細胞外間隙相關(guān)功能表達下調(diào)；在MF分類中，差異性上調(diào)的基因富集在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶結(jié)合相關(guān)功能上，而差異性下調(diào)基因富集在細胞因子活性相關(guān)功能上。

清香型白酒組中，在BP分類中，差異上調(diào)的基因富集在感官知覺、G蛋白偶聯(lián)受體信號通路、嗅覺感覺相關(guān)功能上，發(fā)育過程、膠質(zhì)細胞生成、細胞化學(xué)應(yīng)激相關(guān)功能基因表達下調(diào)；在CC分類中，膜組成成分等功能基因表達上調(diào)，細胞外基質(zhì)、胞外區(qū)相關(guān)功能基因表達下調(diào)；在MF分類中，差異上調(diào)基因主要富集在跨膜信號受體活性、G蛋白偶聯(lián)受體活性、嗅覺感受器活性相關(guān)功能上，而RNA聚合酶II核心啟動子序列特異性DNA結(jié)合相關(guān)功能基因表達下調(diào)。

酒精對照組中，在BP分類中，嗅覺感知、神經(jīng)系統(tǒng)過程、刺激感應(yīng)相關(guān)功能基因差異性上調(diào)，大分子代謝過程的正向調(diào)控、第二信使介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、膠質(zhì)細胞生成相關(guān)功能基因下調(diào)；在CC分類中，膜組成成分相關(guān)功能表達基因上調(diào)，中間纖維細胞骨架相關(guān)功能基因表達下調(diào)；在MF分類中，差異性上調(diào)基因富集在嗅覺受體活性相關(guān)功能上，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性相關(guān)功能基因表達有所下調(diào)。

利用KEGG 數(shù)據(jù)庫可以分析差異表達基因參與的最主要代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，分析部分結(jié)果見圖5。

由圖5可知，在濃香型白酒1組中，差異性表達上調(diào)的基因主要調(diào)控嗅覺傳導(dǎo)通路，而差異性表達下調(diào)的基因則參與調(diào)控移植物抗宿主病、自然殺傷細胞介導(dǎo)的細胞毒作用、不飽和脂肪酸的生物合成等通路。

圖5 KEGG通路富集分析部分結(jié)果Fig.5 Some results of KEGG pathway enrichment analysis

在濃香型白酒2組中，參與調(diào)控嗅覺傳導(dǎo)、大腸癌等通路基因表達上調(diào)，而差異性表達下調(diào)的基因則主要調(diào)控γ-氨基丁酸能突觸通路。

在醬香型白酒組中，調(diào)控前列腺癌、甲狀腺癌等多種癌癥通路的基因差異性表達上調(diào)，而參與調(diào)控瘧疾、Toll樣受體信號通路的基因表達下調(diào)。

在清香型白酒組中，調(diào)控嗅覺傳導(dǎo)通路的基因表達上調(diào)，參與病毒性心肌炎、血管平滑肌收縮等通路基因表達差異性下調(diào)。

在酒精對照組中，差異性表達上調(diào)的基因主要調(diào)控嗅覺傳導(dǎo)通路，而表達下調(diào)的基因則主要參與調(diào)控Toll樣受體信號通路、T細胞受體信號通路。

3 結(jié)論

本研究應(yīng)用GC-MS對不同香型白酒中的非酒精成分進行檢測，結(jié)果顯示不同香型白酒中具有不同的酯類成分，除此之外，濃香型白酒中還含有糠醛、丙酮等特殊成分。另外還對不同香型白酒中吡嗪類化合物含量進行了檢測，結(jié)果顯示醬香型白酒中四甲基吡嗪含量遠高于其他測試酒樣。基于該結(jié)果，在后續(xù)的研究中可對白酒中的非酒精成分進行缺失/添加試驗，進一步探討特定非酒精成分的單獨或協(xié)同健康作用。

對各組SPF大鼠分別進行不同酒樣的灌胃處理，連續(xù)灌胃5周后處死并對大鼠的基線體征和肝腎指標(biāo)進行評價，提取大鼠肝臟中的mRNA進行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。血清學(xué)結(jié)果表明，短期內(nèi)適量攝入不同香型白酒對SD大鼠的肝腎功能影響不大。進一步的轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)果顯示適量攝入白酒對SD大鼠肝臟基因表達有顯著調(diào)控，主要影響大鼠的嗅覺感受、應(yīng)激反應(yīng)、肝腎系統(tǒng)發(fā)育、免疫反應(yīng)和代謝過程等相關(guān)基因。部分酒樣還導(dǎo)致大腸癌、甲狀腺癌等數(shù)個腫瘤相關(guān)通路上調(diào)。與其他測試酒樣相比，濃香型白酒1組具有更優(yōu)的健康效應(yīng)，可能與其中某些功能性非酒精成分的獨特健康效應(yīng)有關(guān)，但具體機制還有待深入探究。