姜彥君，張麗華，李 楠，李丕武，王瑞明，隋松森，郭傳莊，王建彬，李俊霖，李小雙，連 戰(zhàn)，劉思奇，張晨曦，汪俊卿*

（1.齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）生物工程學(xué)院，山東 濟(jì)南 250300；2.諸城東曉生物科技有限公司，山東 濰坊 261000）

D-阿洛酮糖（D-allulose）是D-果糖在C3位的差向異構(gòu)體[1]。D-阿洛酮糖是白色的粉末狀晶體，無臭并且不易吸潮，易溶于水[2]，其甜度可以代替蔗糖作為Ⅱ型糖尿病人的甜味劑和膳食補(bǔ)充劑[3]。D-阿洛酮糖具有預(yù)防保護(hù)神經(jīng)、治療神經(jīng)變性的作用[4]。其熱量低，可以有效抑制血脂和血糖的升高[5]，具有調(diào)節(jié)血糖穩(wěn)定等特殊功能，是近幾年來發(fā)現(xiàn)的一種具有特殊保健功能[6]胞內(nèi)產(chǎn)物。

D-阿洛酮糖在自然界中的含量很少，通過人工合成的方法可以大規(guī)模生產(chǎn)，合成方法主要有兩種：化學(xué)法和生物法。D-阿洛酮糖可以利用鉬酸離子催化劑催化D-果糖合成D-阿洛酮糖[7]，也可以加熱乙醇和三乙胺合成得到D-阿洛酮糖[8]?；瘜W(xué)法合成D-阿洛酮糖目前較為困難，尚未取得突破性進(jìn)展，由此可以借鑒化學(xué)法合成稀少糖的方式合成D-阿洛酮糖。ANDREANA P R等[9-10]報(bào)道了一種通過關(guān)環(huán)轉(zhuǎn)換合成稀少糖的方法，該反應(yīng)相對簡單，但只能產(chǎn)生3,4位順式的稀有糖衍生物，還伴隨產(chǎn)生烯烴物。NORTHRUP A B等[11]提出了兩步法，通過選擇性醇醛縮合合成糖類化合物，但在大規(guī)模生產(chǎn)中具有一定的局限性?；瘜W(xué)法合成步驟復(fù)雜不可控、轉(zhuǎn)化效率低，而市場對于D-阿洛酮糖的需求量和品質(zhì)的要求越來越高，通過生物法生產(chǎn)D-阿洛酮糖成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。日本香川大學(xué)Izumori團(tuán)隊(duì)首次提出產(chǎn)堿桿菌屬細(xì)菌能夠以半乳糖醇、阿洛糖醇或D-塔格糖作為底物生產(chǎn)D-阿洛酮糖[12]。黃擎宇等[13]則是利用生物反應(yīng)器的原理大規(guī)模生產(chǎn)D-阿洛酮糖。相比于化學(xué)法，生物法具有高度的專一性，反應(yīng)條件和純化步驟較為簡單，也是國內(nèi)外研究生產(chǎn)D-阿洛酮糖的主要方法。與國外研究現(xiàn)狀相比，國內(nèi)的研究起步較晚，但近年來通過生物法催化合成D-阿洛酮糖的研究也有了較大進(jìn)展，主要有中糧營養(yǎng)健康研究院、江南大學(xué)等團(tuán)隊(duì)針對D-阿洛酮糖進(jìn)行研究，其內(nèi)容涵蓋了產(chǎn)業(yè)化技術(shù)開發(fā)的各關(guān)鍵環(huán)節(jié)[14]。

通過生物合成法，以D-果糖為底物合成D-阿洛酮糖得到混合糖液，即為轉(zhuǎn)化液，粗樣品需要經(jīng)過分離純化得到純度較高的D-阿洛酮糖。阿洛酮糖的分離純化方法主要有兩種，分別是直接分離法和間接分離法。直接分離法，如模擬移動(dòng)床（simulated moving bed，SMB）[15]和色譜分離技術(shù)，其中SMB是一種利用色譜柱的吸附原理將液體進(jìn)行分離操作的設(shè)備。色譜分離技術(shù)是利用不同物質(zhì)在固定相和流動(dòng)相中分配系數(shù)差異來分離混合物，混合糖液分別通過再生好的陽離子交換樹脂和陰離子交換樹脂脫色脫鹽，再通過帶有恒溫夾套的DTF-Ca2+型色譜分離樹脂分離純化，用分部收集器對樣品進(jìn)行洗脫[16-17]。但由于D-果糖與D-阿洛酮糖的性質(zhì)極為接近，因此使用色譜分離技術(shù)對D-果糖與D-阿洛酮糖進(jìn)行直接分離難度較高。間接分離法，即利用微生物或酶對D-果糖進(jìn)行轉(zhuǎn)化消耗，降低D-阿洛酮糖的分離難度。如SONG Y等[18]利用發(fā)酵法，對蔬菜的殘?jiān)M(jìn)行水解，經(jīng)D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶（D-allulose-3-epimerase，DAEase）催化后，利用釀酒酵母厭氧發(fā)酵消耗混合糖液中的D-果糖，在分離出D-阿洛酮糖的同時(shí)得到乙醇。LI Z J等[19]則使用兩步法酶催化反應(yīng)，利用葡萄糖異構(gòu)酶和葡萄糖氧化酶將混合糖液中的D-果糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸，再利用離子交換樹脂分離葡萄糖酸，以乙醇為D-阿洛酮糖的結(jié)晶體系[19-20]，可以得到純度較高的D-阿洛酮糖。上述分離方法雖然對D-果糖進(jìn)行了消耗，但會(huì)引入新的物質(zhì)，對后續(xù)的分離純化造成一定的影響。另外，可以利用酵母的代謝特異性去除發(fā)酵產(chǎn)物中的雜糖，具有耗時(shí)短，安全性高，價(jià)格低廉，操作工藝、設(shè)備要求簡單的特點(diǎn)，有利于中下游分離純化，易于工業(yè)化[21-22]，如王秀娟等[23-24]分別采用釀酒高活性干酵母發(fā)酵法去除木糖母液中的葡萄糖，提高其中木糖及阿拉伯糖的純度，以便進(jìn)行后續(xù)分離，在最適條件下，葡萄糖濃度降至0.2%以下。曹如燕等[25]采用面包酵母發(fā)酵法對蛋清進(jìn)行脫糖處理，脫糖率可達(dá)95%以上。本研究利用含有組成型啟動(dòng)子的質(zhì)粒pET-20b作為載體，在大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中對3種D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶進(jìn)行異源表達(dá)，其后以D-果糖為底物進(jìn)行靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化。同時(shí)為降低D-果糖對D-阿洛酮糖純化過程中的影響，在產(chǎn)糖后偶聯(lián)釀酒酵母好氧發(fā)酵，相比于酵母的厭氧發(fā)酵產(chǎn)CO2和乙醇，偶聯(lián)釀酒酵母好氧發(fā)酵的產(chǎn)物為CO2和水，不產(chǎn)生額外的物質(zhì)，針對D-阿洛酮糖的深入研究，為下游D-阿洛酮糖的分離和純化提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 主要質(zhì)粒、菌株和引物

Escherichia coliBL21（DE3）：北京全式金生物技術(shù)有限公司；pET20b-DPE1、pET20b-DPE2 和pET20b-DPE3 質(zhì)粒：生工生物工程有限公司。pET20b-DPE1、pET20b-DPE2和pET20b-DPE3的大小分別為4 500 bp、4 509 bp和4 515 bp。以Nde I和BamH I作為基因的載體插入位點(diǎn)，連接后分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中。得到E.coliBL21-DPE1、E.coliBL21-DPE2和E.coliBL21-DPE3。其中基因DPE1、DPE2、DPE3的來源分別為土壤農(nóng)桿菌（Agrobacteriumsp.）、類芽孢桿菌（Paenibacillus senegalensis）和斑葉黃酮菌（Flavonifractor plautii）。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in the study

1.1.2 化學(xué)試劑

限制性內(nèi)切酶BamH I（10 U/μL）、Nde I（10 U/μL）：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；果糖（質(zhì)量濃度為100 g/L）、氨芐青霉素（質(zhì)量濃度為100 mg/mL）：北京索萊寶科技有限公司；酵母浸粉、蛋白胨（均為生化試劑）、氯化鈉（分析純）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；PAGE凝膠快速制備試劑盒、三色預(yù)染蛋白Marker（10～250 kDa）：上海雅酶生物科技有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司；超高保真脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合酶：南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基采用LB液體培養(yǎng)基：酵母浸粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L。121 ℃滅菌20 min。

含氨芐青霉素LB平板：酵母浸粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂粉15 g/L。121 ℃滅菌20 min，晾涼后加入0.1%氨芐青霉素。在無菌環(huán)境下分裝添加了抗生素的培養(yǎng)基至培養(yǎng)皿內(nèi)，厚度約為2～3 mm，約為15 mL固體培養(yǎng)基。其中每個(gè)培養(yǎng)皿中的成分和含量依次是酵母浸粉0.075 g，蛋白胨0.15 g，NaCl 0.15 g，氨芐青霉素100 μg/mL。

發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母浸粉20 g/L，蛋白胨20g/L，糊精20 g/L。115 ℃滅菌20 min。

滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基中經(jīng)無菌操作分別加入經(jīng)過單獨(dú)滅活的無機(jī)鹽A（20%）、B（0.20%）、C（0.20%），其中無機(jī)鹽為：KH2PO43.0 g，Na2HPO412.8 g，NaCl 0.5 g，NH4Cl 1.0 g，溶于200 mL的水中；無機(jī)鹽B：MgSO4·7H2O 2.4 g，溶于10 mL的水中；無機(jī)鹽C：CaCl20.11 g，溶于10 mL的水中。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA124S電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司DK-8D電熱恒溫水槽：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Applied BiosystemsTMVeritiTM96 孔熱循環(huán)儀、Applied BiosystemsTMMiniAmpTM熱循環(huán)儀：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；Z326K高速離心機(jī)：德國Hemeus公司；D3024 臺(tái)式高速微量小型離心機(jī)：大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）有限公司；DYY-12核酸電泳儀：北京六一生物科技有限公司；JY300C蛋白質(zhì)電泳儀：北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；ZQZY-70BS振蕩培養(yǎng)箱：上海知楚儀器有限公司；ESSENTIAL V6凝膠成像系統(tǒng)：英國UVItec公司；LC-20A高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：日本島津公司；Hi-Plex Ca色譜柱（300 mm×7.7 mm，8 μm）：安捷倫科技（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理方法

取1 mL待測樣品于1.5 mL離心管內(nèi)，在轉(zhuǎn)速5 000 r/min條件下離心2 min，取上清液稀釋10倍，取1 mL于1.5 mL針管內(nèi)，濾膜過濾置于樣品瓶中，進(jìn)行高效液相色譜分析。

1.3.2 質(zhì)粒pET20b-DPE1、pET20b-DPE2和pET20b-DPE3的構(gòu)建

以pET20b-DPE1、pET20b-DPE2和pET20b-DPE3質(zhì)粒作為模板，設(shè)計(jì)含有Nde I和BamH I酶切位點(diǎn)的引物DPE1-F和DPE1-R、DPE2-F和DPE2-R、DPE3-F和DPE3-R，分別擴(kuò)增3種D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶基因序列，通過Nde I和BamH I連接pET-20b，構(gòu)建獲得3個(gè)不同的質(zhì)粒pET-20b-DPE1、pET-20b-DPE2、pET-20b-DPE3。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15s，60℃退火15s，72℃延伸30s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4 ℃保存。

1.3.3 大腸桿菌的轉(zhuǎn)化及抗性篩選

在冰上融化感受態(tài)細(xì)胞，取5 μL質(zhì)粒加到25 μL的感受態(tài)中，混勻。冰浴30 min，42 ℃水浴，熱激45 s，迅速轉(zhuǎn)至冰浴1 min，過程中避免振動(dòng)。加入800 μL LB液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)45 min。分別將E.coliBL21-DPE1、E.coliBL21-DPE2和E.coliBL21-DPE3接種到含100 μg/mL氨芐青霉素的LB冷平板上。將平板倒置，放到37℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上長出菌落即為成功轉(zhuǎn)入抗性質(zhì)粒。

1.3.4 大腸桿菌工程菌的發(fā)酵和制備方法

將25 mL種子培養(yǎng)基裝于250 mL錐形瓶中，按1%（V/V）接種量從E.coliBL21-DPE1甘油管接種至種子培養(yǎng)基，搖床培養(yǎng)溫度為37 ℃，轉(zhuǎn)速200 r/min，連續(xù)培養(yǎng)16 h后，得種子液。將種子液按2%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，搖床培養(yǎng)溫度為30 ℃，轉(zhuǎn)速200 r/min，培養(yǎng)48 h，得發(fā)酵液。

取50 mL帶菌發(fā)酵液離心，轉(zhuǎn)速12 000 r/min離心5 min，留取菌體，加入50 mL pH 8.0的KOH緩沖液（含200 g/LD-果糖），懸浮菌體。在50 ℃水浴反應(yīng)10 h，每小時(shí)取樣1 mL，稀釋10倍，進(jìn)行HPLC檢測，測定D-阿洛酮糖含量。

1.3.5D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶活性的測定

D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶活性采用高效液相色譜法。高效液相色譜條件：Hi-Plex Ca色譜柱（300 mm×7.7 mm，8μm）；流動(dòng)相為超純水，預(yù)先超聲排除空氣；流速0.6mL/min；柱溫箱溫度80 ℃；檢測器為示差折光檢測器；溫度40 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

樣品前處理：100 μL待測樣品與900 μL 50 mmol/L濃度的緩沖液（pH 8.0，含100 g/LD-果糖）充分混合后，55 ℃水浴反應(yīng)10 min，反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)至沸水中滅活5 min。將煮沸后的菌液，12 000 r/min離心10 min，上清液稀釋10倍，用13 mm×0.22 μm的水系濾器過濾去除雜質(zhì)后，轉(zhuǎn)移到樣品瓶中，進(jìn)樣10 μL，HPLC分析D-果糖和D-阿洛酮糖的濃度。

定性定量方法：根據(jù)D-阿洛酮糖的保留時(shí)間定性，采用外標(biāo)法定量。

D-阿洛酮糖3差向異構(gòu)酶酶活定義：在55 ℃，pH 8.0的條件下，每分鐘生成1 μmolD-阿洛酮糖即為一個(gè)酶活單位（IU/mL）。

酶活計(jì)算公式如下：

式中：m為HPLC進(jìn)樣10 μL樣品中D-阿洛酮糖的含量，mg；進(jìn)樣量為100 μL；稀釋倍數(shù)為10；μL換算mL乘以1 000；D-阿洛酮糖的分子質(zhì)量為180.16；反應(yīng)時(shí)間為10 min。

D-果糖轉(zhuǎn)化率計(jì)算公式如下：

1.3.6 轉(zhuǎn)化液偶聯(lián)酵母好氧發(fā)酵

干酵母活化方法：2%果糖與純水混合液，加5%干酵母，38 ℃水浴15 min，再于30 ℃搖床中，以100 r/min活化2 h，即為酵母活化液。將此酵母活化液5 000 r/min離心10 min，棄上清，蒸餾水洗酵母后再次離心，收集酵母泥備用。

在50 ℃水浴條件下，大腸桿菌利用D-果糖10 h后加入1%～2%的酵母菌泥，在35 ℃、pH 4.5的條件下發(fā)酵14 h，發(fā)酵過程中每2 h取一次樣，采用HPLC法測定分析D-果糖和D-阿洛酮糖的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組菌大腸桿菌BL21（DE3）-DPE的驗(yàn)證

3個(gè)重組菌的PCR驗(yàn)證結(jié)果見圖1。由圖1可知，目的片段大小分別為872 bp、879 bp、885 bp，與目的基因大小相符說明目的基因均已成功轉(zhuǎn)化入E.coliBL21(DE3)中。

圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoresis of PCR amplified products

2.2 SDS-PAGE蛋白凝膠電泳分析

為驗(yàn)證pET-20b-DPE1、pET-20b-DPE2、pET-20b-DPE3在E.coliBL21（DE3）中是否正確表達(dá)，對發(fā)酵培養(yǎng)破碎后的重組大腸桿菌細(xì)胞進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測分析結(jié)果見圖2。由圖2可知，發(fā)酵后的重組大腸桿菌在32 kDa左右處有目的條帶，與目的蛋白的分子質(zhì)量一致，SDS-PAGE結(jié)果證明了D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶DPE1、DPE2和DPE3在E.coliBL21（DE3）中均已正確表達(dá)。

圖2 重組大腸桿菌SDS-PAGE電泳圖Fig.2 SDS-PAGE analysis of the recombinant Escherichia coli cells

2.3 D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶活性及果糖轉(zhuǎn)化分析

采用HPLC方法對E.coliBL21-DPE1、E.coliBL21-DPE2和E.coliBL21-DPE3細(xì)胞中的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶酶活進(jìn)行測定，結(jié)果見圖3。由圖3可知，E.coliBL21-DPE1的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶酶活性最高，為10.18U/mL，E.coliBL21-DPE2和E.coliBL21-DPE3的酶活分別為3.06 U/mL、6.48 U/mL。

圖3 D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶活性及果糖轉(zhuǎn)化分析Fig.3 Analysis of the activity and fructose conversion of D-allulose 3-heteroisomeras

離心收集含有D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的細(xì)胞E.coliBL21-DPE1、E.coliBL21-DPE2和E.coliBL21-DPE3，并對各含有D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的菌體的轉(zhuǎn)化率進(jìn)行分析，經(jīng)55 ℃水浴轉(zhuǎn)化10 h后，每1 h取樣，結(jié)果見圖3。由圖3可知，0～3 h時(shí)，果糖不斷減少，酮糖不斷增加，轉(zhuǎn)化率升高。4 h以后轉(zhuǎn)化率基本達(dá)到平穩(wěn)狀態(tài)。其中E.coliBL21-DPE1轉(zhuǎn)化率最高為27.56%，E.coliBL21-DPE2轉(zhuǎn)化率最高為23.99%，E.coliBL21-DPE3轉(zhuǎn)化率最高為25.98%?？紤]到E.coliBL21-DPE1具有最高的轉(zhuǎn)化率，后續(xù)偶聯(lián)釀酒酵母發(fā)酵時(shí)采用E.coliBL21-DPE1的轉(zhuǎn)化液進(jìn)行進(jìn)一步轉(zhuǎn)化。

2.4 轉(zhuǎn)化液偶聯(lián)酵母發(fā)酵分析

轉(zhuǎn)化液偶聯(lián)酵母發(fā)酵分析結(jié)果見圖4。

圖4 轉(zhuǎn)化液偶聯(lián)酵母發(fā)酵分析Fig.4 Transfer liquid-coupled yeast fermentation analysis

由圖4可知，加入2%酵母菌泥后，前8 h 酵母消耗D-果糖較慢，轉(zhuǎn)化8 h后，酵母快速消耗D-果糖，而在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，幾乎不消耗酮糖，質(zhì)量濃度保持在54 g/L左右，而經(jīng)24 h 轉(zhuǎn)化后，D-果糖質(zhì)量濃度降低至7.71 g/L，D-阿洛酮糖的質(zhì)量濃度則由初始的28.33%提高至87.54%，D-果糖轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化后的D-果糖率達(dá)到94.22%。

3 結(jié)論

本研究經(jīng)基因克隆得到pET-20b-DPE1、pET-20b-DPE2、pET-20b-DPE3這三個(gè)質(zhì)粒，通過電轉(zhuǎn)化將三個(gè)質(zhì)粒導(dǎo)入E.coliBL21（DE3）中，得到重組菌E.coliBL21-DPE1、E.coliBL21-DPE2和E.coliBL21-DPE3。經(jīng)活性分析發(fā)現(xiàn)，E.coliBL21-DPE1的酶活性最高為10.18 U/mL，E.coliBL21-DPE2和E.coliBL21-DPE3的酶活分別為3.06 U/mL、6.48 U/mL。其中E.coliBL21-DPE1轉(zhuǎn)化率最高為27.56%，E.coliBL21-DPE2和E.coliBL21-DPE3的轉(zhuǎn)化率分別為23.99%和25.98%，由此可以看出E.coliBL21-DPE1的優(yōu)勢遠(yuǎn)高于其他兩種基因。與此同時(shí)偶聯(lián)酵母菌發(fā)酵，消耗混合糖液D-果糖和D-阿洛酮糖中的D-果糖，D-果糖去除率達(dá)到94.22%，增加D-阿洛酮糖的相對含量，為推進(jìn)下游D-阿洛酮糖的純化提供新思路，對推動(dòng)工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，豐富功能性稀有糖市場具有重要的意義。