李志銘，曾小波，劉 戀，康艷麗，朱新貴*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學 食品學院，廣東 廣州 510642；2.李錦記 研究發(fā)展中心，廣東 江門 529156）

小麥是我國的主要糧食作物，其產(chǎn)量和消費量占世界谷物消費總量的30%左右[1-2]。淀粉約占小麥籽粒干質(zhì)量的54%～72%[3]。在制糖行業(yè)中，多采用小麥淀粉雙酶法制糖，但是此工藝糖化液中的蛋白質(zhì)等其他雜質(zhì)多，容易造成葡萄糖收率低和蛋白質(zhì)浪費[4]，大量的小麥蛋白并沒有得到充分利用。小麥中的蛋白質(zhì)含量約占小麥總質(zhì)量的13%[5]。研究表明，小麥蛋白有幾乎齊全的氨基酸組成，其中谷氨酰胺含量最高[6]。而谷氨酰胺經(jīng)水解后所得到的產(chǎn)物谷氨酸是食品中鮮味的主要來源。

蛋白質(zhì)發(fā)酵液是由動植物等天然蛋白質(zhì)經(jīng)化學和生物方法水解，通過分離純化得到的產(chǎn)物[7]。蛋白質(zhì)經(jīng)過水解生成氨基酸、肽等具有生物活性的小分子物質(zhì)，影響食品的呈味和營養(yǎng)特性[8]，可被開發(fā)成安全，營養(yǎng)的新型調(diào)味品。同時，這些發(fā)酵液在抗菌[9]、降低血壓[10]、提高動物免疫水平[11]等方面的潛力也越來越受到人們的關注。

目前，生產(chǎn)蛋白質(zhì)水解物主要途徑是蛋白酶酶解[12]。這種方法條件溫和，安全性高，可控性強[13]。但是商業(yè)用的蛋白酶制劑多為單一型內(nèi)切酶[14]，存在原料利用不完全，成本高昂等問題。因此微生物水解法就成為一種非常安全，有效的替代方式。枯草芽孢桿菌在2008年被農(nóng)業(yè)部列為益生菌之一[15]。而米曲霉是釀造醬油的重要微生物[16]。兩種微生物胞外酶系十分復雜，能分泌蛋白酶[17-18]、谷氨酰胺酶、糖化酶等。

本研究的主要目的是以小麥宏量組分定向酶解后的一種產(chǎn)物，即脫淀粉麥粒中蛋白質(zhì)為基質(zhì)，利用枯草芽孢桿菌和米曲霉進行前發(fā)酵，獲得具有高蛋白酶活力的前發(fā)酵基質(zhì)，通過加鹽水進行后發(fā)酵，評估兩種微生物發(fā)酵液的理化指標和氨基酸組成，以期為小麥蛋白質(zhì)的生物加工和高值化利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枯草芽孢桿菌BS001：由華南農(nóng)業(yè)大學食品學院工業(yè)微生物育種實驗室分離保藏；米曲霉孢子（滬釀3.042）：上海佳民釀造食品有限公司；脫淀粉小麥：由華南農(nóng)業(yè)大學食品學院工業(yè)微生物育種實驗室制備[19]；LB液體培養(yǎng)基：北京索萊寶科技有限公司；其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1FD潔凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；三溫區(qū)培養(yǎng)箱FPG 3：寧波萊?？萍加邢薰?；FE20型pH計、AL204型分析天平：梅特勒－托利多儀器有限公司；759紫外線可見分光光度計：上海儀電分析儀器有限公司；手持折光儀：上海力辰儀器科技有限公司；日立L-8900全自動氨基酸分析儀：日立高新技術公司。

1.3 方法

1.3.1 枯草芽孢桿菌和米曲霉前發(fā)酵試驗

取2個250 mL三角瓶，分別加入20.0 g脫淀粉小麥?？莶菅挎邨U菌發(fā)酵樣品按料液比2∶1（g∶mL）加入40 g質(zhì)量分數(shù)為1.2%的葡萄糖溶液；米曲霉發(fā)酵樣品按料液比1∶1（g∶mL）加入20 g質(zhì)量分數(shù)為1.2%的葡萄糖溶液。兩個樣品在121 ℃高壓滅菌15 min，使樣品充分復水，冷卻后，枯草芽孢桿菌發(fā)酵樣品在無菌操作下按3.0%的接種量（以脫淀粉小麥干質(zhì)量計）接入枯草芽孢桿菌種子液，于34 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h；米曲霉樣品按脫淀粉小麥干質(zhì)量的0.1%拌入米曲霉孢子，混勻后在4層紗布上攤開，表面同樣覆蓋4層紗布，置于30 ℃的人工氣候箱中培養(yǎng)，相對濕度為90%，培養(yǎng)時間為48 h，在18 h翻動基質(zhì)，防止溫度過高。兩種微生物的前發(fā)酵條件已進行工藝優(yōu)化，為最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)條件。

1.3.2 枯草芽孢桿菌和米曲霉后發(fā)酵試驗

在枯草芽孢桿菌和米曲霉發(fā)酵樣品中分別按料液比2∶1（g∶mL）和3.5∶1（g∶mL）（以前發(fā)酵基質(zhì)質(zhì)量計）加入120 g和140 g質(zhì)量分數(shù)8.0%的鹽水，保持枯草芽孢桿菌和米曲霉樣品在整個發(fā)酵過程中加水量一致。兩個樣品同時置于42 ℃培養(yǎng)箱保溫發(fā)酵。每2 d攪動發(fā)酵液，保持表面濕潤，每6 d測定氨基酸態(tài)氮、pH、可溶性固形物等指標。42 d后停止發(fā)酵，過濾發(fā)酵液，測定其氨基酸組成，并進行感官評價。

1.3.3 測定方法

中性蛋白酶活力：參照GAO X L等[20]的方法進行測定，酶活力以干基計；pH值：采用pH計直接測定；可溶性無鹽固形物含量：采用手持折光儀直接測定；氨基酸態(tài)氮：參照GB 5009.235—2016《食品中氨基酸態(tài)氮的測定方法》[21]；蛋白質(zhì)水解度：參照歷望等[22]的方法進行測定。

發(fā)酵液中游離氨基酸分析：將發(fā)酵液中殘渣過濾后，吸取1 mL發(fā)酵液稀釋3倍，加入3 mL磺基水楊酸溶液（5%）混合，4 ℃靜置1 h 后以12 000 r/min離心10 min。通過0.22 μm膜過濾后使用自動氨基酸分析儀進行分析。分析條件：柱溫為程序變溫；色譜柱為日立855-4507型；反應柱溫135 ℃；檸檬酸（鋰）PF緩沖液梯度洗脫；檢測波長為570 nm+440 nm；洗脫泵流速0.35 mL/min，衍生泵流速0.30 mL/min；分析時間148 min；進樣量20 μL。氨基酸評價：必需氨基酸（essential amino acid，EAA）按照參考文獻[23]進行評價；呈味氨基酸參考王馨雨等[24]的方法進行評價。

發(fā)酵液感官評價：以色澤、體態(tài)、香氣、鮮味、咸味、苦澀味、后味為指標，評分及評分標準見表1。

表1 發(fā)酵液的感官評定標準Table 1 Sensory evaluation standards of fermentation broth

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均重復進行3次。數(shù)據(jù)處理與圖表繪制采用Origin 8.5和Excel 2016。

2 結果與分析

2.1 前發(fā)酵中性蛋白酶活力比較

由圖1可知，12～48 h時枯草芽孢桿菌中性蛋白酶活力快速升高，并在48 h達到最大值，此時中性蛋白酶活力為1 060.82 U/g。48 h后由于活細菌減少，開始形成芽孢，而在芽孢形成過程中，母細胞需要廣泛的更新蛋白，消耗了母細胞的營養(yǎng)物質(zhì)，因此，大量的中性蛋白酶用于新蛋白的合成迅速衰退[25-26]。12～48 h時米曲霉中性蛋白酶活力隨培養(yǎng)時間的延長而逐漸提高，在48 h時達到最大值，此時中性蛋白酶活力為908.02 U/g。48 h后，米曲霉分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生的氨基酸、多肽等胞外蛋白物質(zhì)開始累積，對蛋白酶的抑制作用和產(chǎn)蛋白酶的阻礙作用導致蛋白酶活力減小[27]。總體而言，枯草芽孢桿菌和米曲霉在培養(yǎng)48 h時，均能達到產(chǎn)酶峰值。因此，選定培養(yǎng)48 h的發(fā)酵基質(zhì)進行加鹽水后發(fā)酵。

2.2 枯草芽孢桿菌和米曲霉加鹽水后發(fā)酵

2.2.1 兩種微生物后發(fā)酵過程中pH值的變化

由圖2可知，加鹽水后兩種微生物發(fā)酵液的pH呈現(xiàn)較大差異，枯草芽孢桿菌發(fā)酵液的pH在0～24 d內(nèi)穩(wěn)定上升，這可能是枯草芽孢桿菌分泌的中性蛋白酶在水解蛋白質(zhì)時，會產(chǎn)生胺類物質(zhì)甚至氨氣，從而使發(fā)酵液pH升高[28]，24 d后由于耐鹽型乳酸菌繁殖代謝產(chǎn)生乳酸、乙酸等有機酸[29]，這些酸性代謝產(chǎn)物的積累，使枯草芽孢桿菌發(fā)酵液的pH逐漸降低至7.08。米曲霉發(fā)酵液的pH在0～30 d呈現(xiàn)降低趨勢，這是由于發(fā)酵前期是氨基酸溶出的過程，pH快速降低；在發(fā)酵中后期，以乳酸菌逐漸繁殖[30]，因此pH值進一步降低。30 d后pH值趨于穩(wěn)定（pH值為5.37）。

圖2 枯草芽孢桿菌、米曲霉后發(fā)酵過程pH值變化趨勢Fig.2 Change trend of pH value during post-fermentation process of Bacillus subtilis and Aspergillus oryzae

2.2.2 兩種微生物后發(fā)酵過程中可溶性無鹽固形物含量的變化

由圖3可知，在后發(fā)酵過程，枯草芽孢桿菌和米曲霉發(fā)酵液中可溶性無鹽固形物含量逐漸增加，分別在36 d和30 d保持穩(wěn)定，可溶性無鹽固形物最終含量為15.60%和18.98%?？傮w看，米曲霉發(fā)酵液各時期的可溶性無鹽固形物含量均高于枯草芽孢桿菌，這可能是枯草芽孢桿菌對脫淀粉小麥中蛋白質(zhì)的利用率較低，游離氨基酸轉化能力差。

圖3 枯草芽孢桿菌、米曲霉后發(fā)酵過程可溶性無鹽固形物含量變化趨勢Fig.3 Change trend of soluble salt-free solids contents during postfermentation process of Bacillus subtilis and Aspergillus oryzae

2.2.3 兩種微生物后發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮含量的變化

由圖4可知，0～24 d內(nèi)枯草芽孢桿菌發(fā)酵液氨基酸態(tài)氮含量持續(xù)增加；24 d后保持平穩(wěn)；42 d后發(fā)酵液氨基酸態(tài)氮含量為0.727 g/100 mL，蛋白質(zhì)水解度為55.99%。米曲霉發(fā)酵液基酸態(tài)氮含量逐漸增加，最終值為0.746 g/100 mL，蛋白質(zhì)水解度為59.71%。

圖4 枯草芽孢桿菌、米曲霉后發(fā)酵過程氨基酸態(tài)氮含量變化趨勢Fig.4 Change trend of amino acid nitrogen contents during post-fermentation process of Bacillus subtilis and Aspergillus oryzae

2.3 兩種微生物發(fā)酵液中游離氨基酸分析

2.3.1 兩種微生物發(fā)酵液中游離氨基酸的組成和呈味特性

由表2可知，枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中氨基酸種類共有16種，總游離氨基酸（total free amino acid，TAA）含量為4.352 mg/mL。米曲霉發(fā)酵液中氨基酸種類為17種，總游離氨基酸含量為9.044 mg/mL。除枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中的16種氨基酸外，米曲霉發(fā)酵液中還檢測出精氨酸，這說明枯草芽孢桿菌和米曲霉的酶系有一定差異，其對小麥蛋白的水解位點及活力有差別，導致最終發(fā)酵液的氨基酸組成不同[31]。

表2 枯草芽孢桿菌、米曲霉發(fā)酵液中游離氨基酸的組成及含量Table 2 Composition and contents of free amino acids in fermentation broth of Bacillus subtilis and Aspergillus oryzae

根據(jù)呈味特性，游離氨基酸可分為4類，鮮味氨基酸（Asp、Glu、Lys）、甜味氨基酸（Thr、Ser、Gly、Ala、His、Pro）、苦味氨基酸（Met、Ile、Val、Leu、Arg）、其他氨基酸（Tyr、Phe、Cys）。在呈味氨基酸總含量方面，米曲霉發(fā)酵液高于枯草芽孢桿菌發(fā)酵液。其中，米曲霉發(fā)酵液中鮮味氨基酸和甜味氨基酸含量均高于枯草芽孢桿菌發(fā)酵液，米曲霉發(fā)酵液中的谷氨酸含量為2.208 mg/mL，遠高于于枯草芽孢桿菌；枯草芽孢桿菌苦味氨基酸占比更高。整體看，米曲霉發(fā)酵液中鮮味氨基酸和甜味氨基酸對發(fā)酵液的風味貢獻更大。

2.3.2 兩種發(fā)酵液中氨基酸的營養(yǎng)特性評價

必需氨基酸（EAA）的種類和比例是評價食物蛋白質(zhì)的重要營養(yǎng)指標，必需氨基酸的組成與比例越接近世界衛(wèi)生組織/聯(lián)合國糧農(nóng)組織（World Health Organization/Food and Agriculture Organization of the United Nations，WHO/FAO）推薦的氨基酸模式譜，營養(yǎng)價值就越高，也越容易被人體吸收利用[34]。由表3可知，與WHO/FAO模式譜相比，枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中的Lys、Ile、Val、Leu、Tyr+Phe、Cys+Met均高于WHO/FAO模式譜標準，僅Thr未達到該模式譜要求；米曲霉發(fā)酵液Thr、Ile、Val、Leu、Tyr+Phe均高于模式譜標準，而Lys、Cys+Met未達到?？傮w看，枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中必需氨基酸比例除Thr外，其余必需氨基酸比例均高于米曲霉發(fā)酵液，其中Val、Leu、Tyr+Phe、Cys+Met含量占比約為米曲霉發(fā)酵液的兩倍。

表3 枯草芽孢桿菌、米曲霉發(fā)酵液必需氨基酸比例對比Table 3 Comparison of essential amino acids ratio in fermentation broth of Bacillus subtilis and Aspergillus oryzae%

根據(jù)WHO/FAO提出的理想蛋白質(zhì)模式，EAA與TAA的比值應在40%左右，EAA與非必需氨基酸（non-essential amino acid，NEAA）的比值接近或超過60%。枯草芽孢桿菌和米曲霉發(fā)酵液樣品EAA/TAA和EAA/NEAA的比值見表4。

表4 枯草芽孢桿菌、米曲霉發(fā)酵液必需氨基酸和非必需氨基酸比例對比Table 4 Comparison of essential and non-essential amino acids ratio in fermentation broth of Bacillus subtilis and Aspergillus oryzae%

由表4可知，米曲霉發(fā)酵液EAA/NEAA的值為56.36%，EAA/TAA的比值也接近40%?？莶菅挎邨U菌發(fā)酵液樣品EAA/TAA的比值為65.23%，高于此模式標準。EAA/NEAA的比值為187.64%，因此，可以將枯草芽孢桿菌發(fā)酵液與其他營養(yǎng)物質(zhì)進行復配，作為營養(yǎng)補充劑攝入。

2.3.3 發(fā)酵液感官評定

由表5可知，米曲霉發(fā)酵液各項感官指標的評分均高于枯草芽孢桿菌，兩者在后味、咸味和咸味方面接近。綜合感官評定的各項指標，米曲霉發(fā)酵的脫淀粉麥粒蛋白質(zhì)發(fā)酵液的風味要好于枯草芽孢桿菌。這與游離氨基酸的檢測結果相印證，說明米曲霉發(fā)酵液更適合作調(diào)味液使用。

表5 兩種發(fā)酵液感官評價結果Table 5 Results of sensory evaluation in two kinds of fermentation broth

3 結論

在最適前發(fā)酵工藝的條件下，枯草芽孢桿菌和米曲霉中性蛋白酶活力分別為1 060.82 U/g和908.02 U/g；兩種微生物最終發(fā)酵液pH值為7.08和5.37，可溶性無鹽固形物為15.60%和18.98%，氨基酸態(tài)氮含量為0.727 g/100 mL和0.746 g/100 mL，總游離氨基酸含量為4.352 mg/mL和9.044 mg/mL，蛋白質(zhì)水解度為55.99%和59.71%?？莶菅挎邨U菌發(fā)酵液中的必需氨基酸比例高于米曲霉發(fā)酵液，而米曲霉發(fā)酵液中的呈味氨基酸總量高于枯草芽孢桿菌發(fā)酵液，尤其是鮮味氨基酸和甜味氨基酸；米曲霉發(fā)酵液中氨基酸態(tài)氮含量也高于枯草芽孢桿菌。因此，枯草芽孢桿菌發(fā)酵液可以作為營養(yǎng)補充劑的原料；米曲霉發(fā)酵液風味更好，可以用作調(diào)味品基料。