王 琪，付 強，周巧麗，金 岳，胡夢琪，趙豐麗，2*

（1.廣西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，廣西 桂林 541006；2.珍稀瀕危動植物生態(tài)與環(huán)境保護教育部重點實驗室，廣西 桂林 541006）

自然界中的多糖主要從植物和微生物中提取，微生物多糖是其在生長代謝過程中產(chǎn)生并分泌到細胞外的一類多糖[1]，其在微生物抵抗環(huán)境壓力（滲透壓、干燥、有毒化合物和噬菌體）時發(fā)揮重要的作用[2]。微生物多糖分為胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）和胞壁多糖[3]。與胞壁多糖相比，胞外多糖更易與菌體分離，在水溶液中呈膠體狀態(tài)[4-5]。因具有易提取、周期短、不受季節(jié)影響而被廣泛用于食品添加劑、黏合劑和廢水處理。近幾十年來，由于微生物EPS在產(chǎn)品結(jié)構(gòu)、性能及生產(chǎn)方面所具有的優(yōu)勢而得到大力研究開發(fā)[6]。目前研究證實，EPS具有良好的抗氧化、增強免疫力及抑菌等功能。LIU X等[7]從粗毛纖孔菌子實體提取的多糖對急性酒精肝損傷小鼠有較強抗腫瘤活性；孫曉萌[8]對海參腸道的季也蒙假絲酵母（Candida guilliermondii）產(chǎn)的EPS進行研究，發(fā)現(xiàn)EPS-2具有較強的抗氧化活性和還原力；孫建瑞等[9]研究發(fā)現(xiàn)，EPS能明顯的抑制金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。因此，微生物多糖受到了廣泛的關(guān)注[10-11]。

羅漢果（Siraitia grosvenorii）為葫蘆科多年生藤本植物的果實[12]，羅漢果的內(nèi)生菌種類繁多，張昌志等[13-15]從羅漢果中分離出幾十株內(nèi)生菌，從中篩選出高產(chǎn)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶、具有抗氧化能力以及對α-淀粉酶有抑制作用的菌株。但是尚有更多其他生物活性值得開發(fā)利用[16-18]。

本研究從課題組分離的羅漢果內(nèi)生菌株中，擬篩選出產(chǎn)EPS的菌株，并通過形態(tài)觀察、生理生化試驗及分子生物學(xué)技術(shù)進行菌種鑒定。在此基礎(chǔ)上，采用單因素及正交試驗對其產(chǎn)EPS的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，確定最佳發(fā)酵工藝條件，以期提高EPS的含量，為微生物多糖的應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 羅漢果內(nèi)生菌株

羅漢果內(nèi)生菌株：38株，保存于廣西師范大學(xué)生物學(xué)實驗中心發(fā)酵工程實驗室[13-15]。

1.1.2 主要試劑

葡萄糖、氯化鈉、碳酸鈉、蔗糖、硫酸、苯酚（均為分析純）：西隴科學(xué)股份有限公司；無水乙醇（分析純）：廣東光華科技股份有限公司；酵母浸粉（生化試劑）：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；α-萘酚（生化試劑）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖肉湯（potato dextrose broth，PDB）培養(yǎng)基：參考龍楚媚等[15]的研究。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、基礎(chǔ)培養(yǎng)基、溶菌肉湯（lysogeny broth，LB）培養(yǎng)基、超級肉湯（terrific broth，TB）培養(yǎng)基（胰蛋白胨1.2 g，酵母提取物2.4 g，甘油0.4 mL，磷酸氫二鉀1.2 g，定容至100 mL）：參考于杰[19]的研究。

甲基紅試驗培養(yǎng)基、吲哚試驗培養(yǎng)基：參考《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[20]。

以上培養(yǎng)基pH均為7.0～7.2，滅菌條件均為121 ℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設(shè)備

YM75型立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海三申醫(yī)療器械有限公司；ZD-85型恒溫振蕩器：國華儀器制造有限公司；HP400S型生化培養(yǎng)箱：武漢瑞華儀器設(shè)備有限責(zé)任公司；BX63型熒光成像分析系統(tǒng)顯微鏡：日本Olympus公司；Infinite M200Pro酶標(biāo)儀：帝肯貿(mào)易有限公司；TD-5A大容量離心機：常州中城儀器制造有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 胞外多糖樣品的制備及測定

胞外多糖的提取方法參考王爽等[21-22]的研究，將羅漢果內(nèi)生菌接種于LB培養(yǎng)基中，30 ℃、130 r/min條件下培養(yǎng)24 h得到種子液；以4%（V/V）的接種量接種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，30 ℃、130 r/min條件下培養(yǎng)48 h，4 000 r/min離心15 min，去除菌體，加入3倍體積的無水乙醇，4 ℃冰箱靜置過夜，相同條件下離心得沉淀，沉淀中加入適量蒸餾水復(fù)溶，得粗提的多糖樣品溶液，采用苯酚-硫酸法[23]測其EPS含量。

1.3.2 胞外多糖產(chǎn)生菌株的篩選

初篩（定性）：采用α-萘酚-硫酸法[24]進行初篩。

復(fù)篩（定量）：對初篩得到的產(chǎn)EPS較高的菌株進一步采用苯酚-硫酸法測其EPS含量，從而復(fù)篩到高產(chǎn)EPS的菌株。

1.3.3 胞外多糖產(chǎn)生菌株的鑒定

形態(tài)學(xué)觀察：依據(jù)菌株菌落形態(tài)特征和顯微形態(tài)特征進行形態(tài)學(xué)觀察。

生理生化試驗：對菌株進行甲基紅試驗、接觸酶試驗、二乙酰試驗（V-P試驗）等生理生化試驗[20]。

分子生物學(xué)鑒定：將菌株送往武漢華大基因科技有限公司，完成16S rDNA測序，并在美國國家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫中采用基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）對測序結(jié)果進行基因同源性的搜索，選取同源性較高的模式菌株的16S rDNA基因序列，采用MEGA 7.0軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 生長曲線及胞外多糖生產(chǎn)曲線

將復(fù)篩得到的菌株活化后，接入基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，30 ℃、130r/min條件下培養(yǎng)120h，每3h取一次發(fā)酵液，在波長600nm處測定吸光度值，繪制菌株的生長曲線。同時，采用苯酚-硫酸法測定EPS含量，繪制菌株產(chǎn)胞外多糖曲線。

1.3.5 胞外多糖產(chǎn)生菌株發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗

將篩選出的菌株按4%（V/V）的接種量分別接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、基礎(chǔ)培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、TB培養(yǎng)基、PDB培養(yǎng)基，30 ℃、130 r/min條件下培養(yǎng)48 h，測定EPS含量，篩選出有利于菌株產(chǎn)EPS的培養(yǎng)基。在此基礎(chǔ)上，采用單因素輪換法依次考察接種量、初始pH值、碳源種類（2.0%）及添加量、氮源種類（1.0%）及添加量、無機鹽種類（1.0%）及添加量對菌株產(chǎn)EPS的影響[19]，因素與水平見表1。

表1 發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of single factor tests for fermentation conditions optimization

1.3.6 胞外多糖產(chǎn)生菌株發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選擇對試驗結(jié)果影響較大的因素，以EPS產(chǎn)量（Y）為評價指標(biāo)進行4因素3水平的正交試驗，試驗因素與水平見表2。

表2 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of orthogonal tests for fermentation conditions optimization

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)處理采用Q值檢測[25]。利用SPSS 26.0和Excel 2016軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計與分析。試驗數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示，組間差異用Duncan檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 胞外多糖產(chǎn)生菌株的篩選

采用α-萘酚-硫酸法從38株羅漢果內(nèi)生菌株中篩選得到6株產(chǎn)胞外多糖的菌株，其中菌株LHG-3發(fā)酵液的顯色反應(yīng)的顏色最深，菌株GZ-5的最淺。因此，初步篩選得到菌株LHG-3產(chǎn)EPS的量最高。進一步測定6株菌株發(fā)酵液多糖樣品的EPS含量，結(jié)果見圖1。

圖1 初篩菌株的胞外多糖產(chǎn)量Fig.1 Extracellular polysaccharide production of preliminary screening strains

由圖1可知，菌株LHG-3的EPS含量最高，達（0.78±0.02）mg/mL，明顯高于其余菌株（P＜0.05），與顯色反應(yīng)的結(jié)果相一致。因此，選擇該菌株進行后續(xù)試驗。

2.2 菌株LHG-3的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)觀察

菌株LHG-3的菌落及細胞形態(tài)觀察結(jié)果見圖2。

圖2 菌株LHG-3的菌落（a）及細胞（b）形態(tài)Fig.2 Colony (a) and cell (b) morphology of strain LHG-3

由圖2可知，菌株LHG-3的菌落表面為乳白色，表面濕潤光滑，不透明，挑起時有較強黏性。細胞呈桿狀，革蘭氏染色呈紫色，為革蘭氏陽性菌。

2.2.2 生理生化試驗

生理生化試驗結(jié)果表明，菌株LHG-3的甲基紅試驗、接觸酶試驗、V-P試驗、葡萄糖利用試驗、淀粉水解試驗、脂酶試驗、明膠液化試驗、檸檬酸鹽利用試驗結(jié)果均為陽性，吲哚試驗為陰性。結(jié)合形態(tài)特征，參考《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[17]，初步將菌株LHG-3歸為芽孢桿菌屬（Bacillussp.）。

2.2.3 分子生物學(xué)鑒定

基于16S rDNA基因序列構(gòu)建菌株LHG-3的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖3。由圖3可知，菌株LHG-3與韋德曼尼芽孢桿菌（Bacillus wiedmannii）同屬一支，BLAST結(jié)果顯示菌株LHG-3與Bacillus wiedmannii的16S rDNA序列同源性＞99%，親源關(guān)系最近。結(jié)合其形態(tài)觀察和生理生化鑒定結(jié)果，最終鑒定菌株LHG-3為韋德曼尼芽孢桿菌（Bacillus wiedmannii）。

圖3 基于16S rDNA基因序列菌株LHG-3的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain LHG-3 based on 16S rDNA gene sequences

2.3 菌株LHG-3的生長曲線及產(chǎn)胞外多糖曲線

菌株LHG-3的生長曲線和產(chǎn)EPS曲線見圖4。

圖4 菌株LHG-3的生長曲線及產(chǎn)胞外多糖曲線Fig.4 Growth curve and extracellular polysaccharide production curve of strain LHG-3

由圖4可知，菌株LHG-3的生長和產(chǎn)EPS是同步的，屬于生長偶聯(lián)型，產(chǎn)EPS的最佳發(fā)酵時間為42 h。

2.4 菌株LHG-3產(chǎn)胞外多糖發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗結(jié)果

菌株LHG-3在5種培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后的EPS產(chǎn)量見圖5。由圖5可知，菌株LHG-3在5種培養(yǎng)基發(fā)酵48 h都能產(chǎn)EPS，其中TB培養(yǎng)基中EPS產(chǎn)量最高，為（0.83±0.03）mg/mL，明顯高于其他培養(yǎng)基（P＜0.01）。因此，選擇TB培養(yǎng)基作為后續(xù)試驗的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基。

圖5 不同培養(yǎng)基對菌株LHG-3產(chǎn)胞外多糖的影響Fig.5 Effect of different media on extracellular polysaccharide production by strain LHG-3

不同因素對菌株LHG-3產(chǎn)EPS的影響見表3。由表3可知，當(dāng)碳源、氮源和無機鹽種類分別為蔗糖、尿素、氯化鈣時，EPS產(chǎn)量最高，分別為（0.99±0.04）mg/mL、（1.25±0.01）mg/mL、（1.35±0.01）mg/mL，說明最優(yōu)碳源為蔗糖，最優(yōu)氮源為尿素，最優(yōu)無機鹽為氯化鈣。隨著接種量、初始pH值、蔗糖添加量、尿素添加量、氯化鈣添加量的增加，菌株LHG-3的EPS產(chǎn)量均呈先升高后下降的趨勢，當(dāng)接種量、初始pH值、蔗糖添加量、尿素添加量、氯化鈣添加量分別為8%、7.0、2.5%、1.0%、0.6%時，EPS產(chǎn)量最高，分別為（0.91±0.01）mg/mL、（0.88±0.03）mg/mL、（1.12±0.02）mg/mL、（1.24±0.01）mg/mL、（1.39±0.01）mg/mL，因此，確定最佳條件為接種量8%、初始pH值7.0、蔗糖添加量2.5%、尿素添加量1.0%、氯化鈣添加量0.6%。

表3 不同因素對菌株LHG-3產(chǎn)EPS的影響Table 3 Effect of different factors on extracellular polysaccharide production by strain LHG-3 mg/mL

2.5 菌株LHG-3產(chǎn)胞外多糖發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，確定初始pH值為7.0，選擇蔗糖添加量（A）、尿素添加量（B）、氯化鈣添加量（C）、接種量（D）為考察因素，以EPS產(chǎn)量（Y）為評價指標(biāo)，采用正交試驗研究不同因素對菌株產(chǎn)EPS的影響，結(jié)果見表4，方差分析見表5。

表4 菌株LHG-3產(chǎn)胞外多糖發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 4 Results and analysis of orthogonal tests for fermentation conditions optimization of extracellular polysaccharide produced by strain LHG-3

表5 正交試驗結(jié)果方差分析Table 5 Variance analysis of orthogonal tests results

由表4可知，根據(jù)極差大小可以判斷影響菌株產(chǎn)EPS的因素主次順序為D＞A＞B＞C，即接種量＞蔗糖添加量＞尿素添加量＞氯化鈣添加量。菌株LGH-3產(chǎn)EPS的最佳條件組合是A2B3C1D2，即蔗糖2.5%、尿素1.2%、氯化鈣0.4%、接種量8%。由表5可知，接種量對菌株LGH-3產(chǎn)EPS的影響極顯著（P＜0.01）。

2.6 驗證試驗

采用優(yōu)化后的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件對菌株LHG-3進行發(fā)酵，發(fā)酵42 h后，測得EPS的產(chǎn)量為（1.59±0.03）mg/mL，高于試驗組6的（1.52±0.02）mg/mL。

3 結(jié)論

從羅漢果內(nèi)生菌中篩選得到1株高產(chǎn)EPS的菌株，編號為LHG-3，經(jīng)過形態(tài)觀察、生理生化試驗及分子生物學(xué)鑒定，最終鑒定其為韋德曼尼芽孢桿菌（Bacillus wiedmannii）。該菌株產(chǎn)EPS的最優(yōu)培養(yǎng)基為TB培養(yǎng)基，通過單因素和正交試驗優(yōu)化確定該菌株產(chǎn)EPS的最優(yōu)條件為接種量8%、蔗糖2.5%、尿素1.2%、氯化鈣0.4%，初始pH值7.0，在30 ℃條件下培養(yǎng)42 h，菌株LHG-3的EPS產(chǎn)量達到（1.59±0.03）mg/mL，是優(yōu)化前的1.9倍。由此可見，羅漢果內(nèi)生菌具有產(chǎn)EPS的潛力，利用菌株LHG-3發(fā)酵生產(chǎn)EPS，不僅為EPS的生產(chǎn)提供了菌株來源，也為利用菌株LHG-3大量生產(chǎn)EPS提供了理論基礎(chǔ)。