葉 茂，鄧毛程，林凱旋，何雪瑩，尹愛國

（1.廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品與生物技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州 510300；2.廣東省特色調(diào)味品工程技術(shù)開發(fā)中心，廣東 廣州 510300；3.廣東石油化工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，廣東 茂名 525000）

羧肽酶（carboxypeptidases，CPs）是指能專一催化水解多肽鏈羧基末端氨基酸的一類外肽酶，是一種具有重要應(yīng)用潛力的工業(yè)酶制劑。羧肽酶的應(yīng)用主要涉及到生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)等多個學(xué)科領(lǐng)域。在食品和飼料工業(yè)，可用于制備高F值寡肽[3]，去除赭曲霉素[4]，多肽脫苦、生物活性多肽的延長或特異性修飾[5]；在生物學(xué)領(lǐng)域，可用于多肽的合成[6]及多肽氨基酸序列測定[7]；在醫(yī)學(xué)用途方面，通過體內(nèi)羧肽酶的檢測達到診斷和治療疾病的目的[8-9]。近幾年，羧肽酶的新功能和新用途不斷被發(fā)現(xiàn)和拓展，使得羧肽酶具有更高的研究價值和更廣闊的應(yīng)用前景。

目前，羧肽酶酶制劑商品供應(yīng)主要來源于豬胰腺，但價格昂貴[10-11]。因此，利用微生物獲得大量的羧肽酶，具有重要的現(xiàn)實意義[12-13]。黑曲霉（Aspergillus niger）是國際上公認(rèn)的安全發(fā)酵微生物，且適合采用固態(tài)發(fā)酵的方式[14]，而黑曲霉生產(chǎn)羧肽酶發(fā)酵工藝條件鮮見報道[15]。本研究是在前期篩選分離純化獲得的羧肽酶活力較高的黑曲霉（Aspergillus niger）H1-6的基礎(chǔ)上，利用固態(tài)發(fā)酵技術(shù)，優(yōu)化其產(chǎn)酶發(fā)酵工藝參數(shù)，并考察發(fā)酵粗酶液在醬油釀造發(fā)酵中的應(yīng)用效果，為實現(xiàn)羧肽酶的規(guī)?；a(chǎn)、降低成本來滿足商業(yè)化的需要，對推動我國相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

黑曲霉（Aspergillus niger）H1-6：本實驗室篩選獲得，馬鈴薯培養(yǎng)基斜面保藏于4 ℃冰箱。

1.1.2 化學(xué)試劑

碳源（麩皮、玉米芯粉、甘蔗渣、米糠）、氮源（豆粕、花生粕、菜籽油餅、玉米粉）：市售；羧肽酶底物（N-芐氧羰?；?L-苯丙氨酰-L-亮氨酸（N-carbobenzyloxy-L-phenylalanyl-L-leucine，N-CBZ-Phe-Leu））：美國Sigma-Aldrich公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基，稱取PDA培養(yǎng)基干粉39 g，加入蒸餾水或去離子水1 000 mL，攪拌加熱煮沸至完全溶解，121 ℃高壓滅菌15 min。

固體發(fā)酵培養(yǎng)基：稱取一定量的碳源、氮源和無機鹽，加水，121 ℃高壓滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-ZFD型雙人單面凈化工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；DHP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海博迅實業(yè)有限公司；722N型可見分光光度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的活化

將黑曲霉菌株H1-6接種于PDA培養(yǎng)基進行活化，30 ℃培養(yǎng)3～4 d，待長滿孢子后備用。

1.3.2 單孢子懸液的制備

取培養(yǎng)好的PDA斜面，加入無菌生理鹽水，用接種環(huán)刮下黑曲霉菌株H1-6孢子后轉(zhuǎn)移至裝有玻璃珠的無菌錐形瓶中，充分搖動使孢子散開，將孢子濃度調(diào)整到1×108CFU/mL，備用[16]。

1.3.3 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)

500 mL三角瓶裝100 g固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，固態(tài)培養(yǎng)基的具體配方根據(jù)單因素試驗和響應(yīng)面分析試驗設(shè)計，通過添加1 mol/L HCl或NaOH水溶液來調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的初始pH值，然后121 ℃高壓滅菌20 min，待培養(yǎng)基冷卻到室溫（20～25）℃，按培養(yǎng)基質(zhì)量的比例接種孢子懸液（1×108CFU/mL），在32 ℃條件下，恒溫培養(yǎng)3 d后獲得成曲，培養(yǎng)期每天翻曲2次。試驗平行3次[17]，結(jié)果取平均值。

1.3.4 粗酶液的制備

參考文獻[16]，并略作修改。分別稱取10 g成曲，研磨后加入100 mL無菌水，40 ℃浸提1 h，期間攪拌2～3次。用中速定性濾紙過濾，濾液即為粗酶液。同時測定曲料水分，酶活力用曲料干基質(zhì)量表示，即mU/g[18]。

1.3.5 羧肽酶活力的測定方法

采用鎘-茚三酮法測定羧肽酶的活力[19]。羧肽酶酶活定義：在30 ℃，pH 3.7的條件下，每秒鐘產(chǎn)生1 mmol的酪氨酸所需的酶量為一個酶活單位（mU）。

1.3.6 羧肽酶粗酶液在醬油釀造中的應(yīng)用

結(jié)合固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)條件試驗結(jié)果，添加0～2.5 U/kg成曲羧肽酶，采用高鹽稀態(tài)發(fā)酵法釀造醬油，在成曲加18%鹽水前，先將羧肽酶粗酶液溶解到鹽水中，發(fā)酵后壓榨出油檢測氨基態(tài)氮含量[20]。

1.3.7 產(chǎn)酶條件優(yōu)化單因素試驗

按100 g固體發(fā)酵培養(yǎng)基，分別稱取45%碳源（麩皮、玉米芯、米糠及甘蔗渣），45%氮源（豆粕、花生粕、玉米粉及油菜籽粉），10%無機鹽（K2PO3、MgSO4、MnSO4·H2O、FeCl3·H2O和CaCl2），分別按40%、45%、50%、55%和60%加入蒸餾水，置于500 mL三角瓶，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的初始pH值分別至5.0、5.5、6.0、6.5和7.0，121 ℃滅菌20 min，待培養(yǎng)基冷卻，按培養(yǎng)基質(zhì)量的比例接種黑曲霉菌株H1-6孢子懸液（1×108CFU/mL）0.5%、1.0%、1.5%和2.0%，在32 ℃條件下，恒溫培養(yǎng)3 d獲得成曲，成曲按照方法1.3.4提取粗酶液并按照1.3.5方法測定羧肽酶活力。所有的試驗平行3次[17]，結(jié)果取平均值。

1.3.8 產(chǎn)酶條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗

（1）Plackett-Burman（PB）試驗設(shè)計

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，以羧肽酶酶活為響應(yīng)值，利用PB試驗分析麩皮添加量（X1）、豆粕添加量（X2）、NaCl添加量（X3）、初始pH值（X4）、水分含量（X5）、接種量（X6）等6個因素，每個因素取2個水平，PB試驗設(shè)計因素與水平見表1。

表1 Plackett-Burman試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman tests design

（2）最陡爬坡試驗

依據(jù)PB試驗結(jié)果，以各個顯著影響因素效應(yīng)的大小設(shè)定變化步長；依據(jù)變化的梯度方向確定爬坡方向，快速逼近最佳值區(qū)域；確定主要影響因素為麩皮添加量、水分含量和接種量，將此3個因素進行最陡爬坡試驗。

（3）Box-Behnken 試驗設(shè)計

根據(jù)Box-Behnken 試驗設(shè)計原理（中心組合試驗設(shè)計原理），進行3因素3水平15個試驗組的響應(yīng)面試驗，分析每個因素主效應(yīng)與交互效應(yīng)，繪制響應(yīng)曲面，求出最佳值，獲得最佳產(chǎn)酶條件。以羧肽酶酶活力（Y）為響應(yīng)值，優(yōu)化麩皮添加量（A）、水分含量（B）和接種量（C），Box-Behnken試驗設(shè)計因素與水平見表2。

表2 Box-Benhnken試驗設(shè)計因素及水平Table 2 Factors and levels of Box-Benhnken tests design

1.3.9 數(shù)據(jù)處理

所有試驗結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”形式表示。利用SPSS 22.0軟件進行方差分析（analysis of variance，ANONA）檢驗，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。采用Design-Expert 8.0.7軟件進行響應(yīng)面試驗數(shù)據(jù)分析[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)酶條件優(yōu)化單因素試驗

由表3可知，當(dāng)碳源為麩皮時，羧肽酶的固態(tài)發(fā)酵酶活力最高（640±32）mU/g，其他依次為玉米芯粉、米糠和甘蔗渣；當(dāng)?shù)礊槎蛊蓵r，羧肽酶的酶活力最高（703±11）mU/g，其他依次為花生粕、玉米粉和菜籽油餅；無機鹽中的NaCl對羧肽酶的固態(tài)發(fā)酵酶活力有正相關(guān)性，其他的K2PO3、MgSO4、MnSO4·H2O、FeCl3·H2O和CaCl2則沒有影響；黑曲霉接種量為1.0%時，羧肽酶的固態(tài)發(fā)酵酶活力達到最高（746±22）mU/g；初始pH值為6.5時，羧肽酶的固態(tài)發(fā)酵酶活力最高（773±16）mU/g；水分含量為55%時，羧肽酶的固態(tài)發(fā)酵酶活力最高（826±23）mU/g。

表3 產(chǎn)酶條件優(yōu)化單因素試驗結(jié)果Table 3 Results of single factor tests for optimization of enzymeproduction conditions

因此，選用麩皮為碳源，添加量為45%；豆粕為氮源，添加量為45%；氯化鈉為無機鹽，添加量為10%，并調(diào)節(jié)初始pH值為6.5、黑曲霉H1-6接種量為1.0%，水分含量為55%。

2.2 Plackett-Burman試驗設(shè)計及結(jié)果

在上述單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，以羧肽酶酶活為響應(yīng)值，利用Plackett-Burman試驗設(shè)計分析麩皮添加量（X1）、豆粕添加量（X2）、NaCl添加量（X3）、初始pH值（X4）、水分含量（X5）、接種量（X6）等6個因素的顯著性，每個因素取2個水平，每個試驗重復(fù)3次。為了估計試驗誤差，另設(shè)3個虛擬變量。PB試驗設(shè)計及結(jié)果見表4，方差分析見表5。

表4 Plackett-Burman 試驗設(shè)計及結(jié)果Table 4 Design and results of Plackett-Burman tests

表5 Plackett-Burman試驗結(jié)果方差分析Table 5 Variance analysis of Plackett-Burman tests results

由表5可知，此模型P=0.020 7＜0.05，說明回歸方程顯著；該模型的決定系數(shù)R2為0.9015，調(diào)整決定系數(shù)R2為0.7833，表明多項式模型擬合較好。影響黑曲霉H1-6固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)羧肽酶的顯著因素分別是麩皮添加量X1（P=0.021 5）、水分含量X5（P=0.008 5）和接種量X6（P=0.013 0），P值均＜0.05，可以作為進一步優(yōu)化的因素，其他因素對結(jié)果影響不大，在下一步研究中，取中間值。因此，選用麩皮添加量、水分含量以及黑曲霉H1-6接種量作為最陡爬坡試驗因素。

2.3 最陡爬坡試驗結(jié)果

根據(jù)Plackett-Burman試驗結(jié)果確定的3個主要顯著因素，其中麩皮添加量（A）對酶活力表現(xiàn)為正效應(yīng)，水分含量（B）和黑曲霉H1-6接種量（C）對酶活力表現(xiàn)為負(fù)效應(yīng)，根據(jù)這3個顯著影響因素效應(yīng)的大小確定試驗的爬坡方向和變化步長，以最快的速度逼近最大響應(yīng)值（酶活力）的區(qū)域[22]。其余因素則依據(jù)效應(yīng)關(guān)系，分別選擇對應(yīng)的水平[23]。最陡爬坡試驗設(shè)計與結(jié)果見表6。

表6 最陡爬坡試驗設(shè)計和結(jié)果Table 6 Design and results of the steepest ascent tests

由表6可知，隨著3個主要影響因素含量的變化，羧肽酶活力呈現(xiàn)先升高后降低，羧肽酶活力在試驗第5組的條件下，羧肽酶活力最高（867±12）mU/g。因此，選擇試驗第5組的條件作為響應(yīng)面設(shè)計因素水平的中心點，即麩皮添加量（A）、水分含量（B）和接種量（C）分別為40%、55%和1.2%。

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken 試驗設(shè)計原理（中心組合試驗設(shè)計原理），設(shè)計3因素5水平共20個試驗點的響應(yīng)面分析試驗，其中有14個析因點，6個零點重復(fù)，以羧肽酶酶活力（Y）為響應(yīng)值，以估計試驗誤差，分析黑曲霉H1-6固態(tài)發(fā)酵羧肽酶活力的最佳條件。Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果見表7，方差分析結(jié)果見表8。

表7 Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果Table 7 Design and results of Box-Behnken tests

續(xù)表

表8 回歸模型的方差分析Table 8 Variance analysis of regression model

以羧肽酶活力為響應(yīng)值，運用Design-Expert 8.0.7軟件進行回歸擬合，得到酶活力（Y）與麩皮含量（A）、含水量（B）與接種量（C）的二次多項回歸方程：

由表7可以看出，在α=0.01水平時，H1-6菌株產(chǎn)羧肽酶響應(yīng)面試驗?zāi)Ｐ突貧w極顯著（P＜0.000 1），并且失擬項不顯著（P=0.285 0＞0.05），表明該方程對試驗數(shù)據(jù)擬合良好。該模型決定系數(shù)R2=0.968 4，說明96.84%的試驗數(shù)據(jù)可用該模型解釋，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.939 9，證明該模型可以很好的擬合試驗數(shù)據(jù)。根據(jù)各因素P值大小，一次項A、B、C，二次項A2、B2、C2對羧肽酶活力影響極顯著（P＜0.01）。

根據(jù)Box-Behnken試驗結(jié)果，應(yīng)用Design-Expert 8.0.7軟件對數(shù)據(jù)進行分析擬合，得到各因素交互作用對羧肽酶活力影響的響應(yīng)面及等高線見圖1。由圖1可知，麩皮添加量（A）、水分含量（B）和接種量（C）3個因素之間互有交互作用，但對結(jié)果均無顯著影響（P＞0.05）。

圖1 麩皮添加量、含水量及接種量對黑曲霉H1-6固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)羧肽酶活力的響應(yīng)面及等高線Fig.1 Response surface polts and contour lines for effects of interaction between bran addition,moisture and inoculum on carboxypeptidase activity produced by Aspergillus niger H1-6 with solid-state fermentation

2.5 響應(yīng)面驗證試驗

為了驗證該模型預(yù)測的可靠性與準(zhǔn)確性，通過單因素試驗與響應(yīng)面試驗最優(yōu)產(chǎn)酶條件為：得到A=-0.769、B=0.318、C=0.331，即麩皮添加量為36.16%，水分含量為56.59%，接種量為1.27%。此條件下模型預(yù)測的羧肽酶活力理論值為950.39 mU/g。考慮到實際操作的便利性，將最優(yōu)產(chǎn)酶條件修正為：麩皮添加量為36%，含水量為56.6%，接種量為1.3%（即1.3×106CFU/g）。在此優(yōu)化條件下，制曲培養(yǎng)3 d，測定成曲中羧肽酶活力，3次平行試驗羧肽酶活力實際值為938.33 mU/g，與預(yù)測值接近，說明實驗值與預(yù)測值有較好的擬合性，所得產(chǎn)酶條件可以用于指導(dǎo)實際發(fā)酵。

2.6 羧肽酶在醬油釀造中的添加量試驗

氨基酸態(tài)氮含量指的是以氨基酸形式存在的氮元素的含量，醬油中的香味就是各種氨基酸的自然效果，該指標(biāo)越高，說明醬油中氨基酸含量越高，鮮味越好[24]。已經(jīng)證實羧肽酶能夠水解多肽和蛋白質(zhì)C端的氨基酸，應(yīng)用于氨基酸生產(chǎn)以及食品工業(yè)中的脫苦和風(fēng)味提升等方面[25]。因此，將不同添加量的羧肽酶添加到發(fā)酵醬醪中，然后進行發(fā)酵、壓榨出油檢測，不同羧肽酶添加量對醬油中氨基態(tài)氮含量的影響結(jié)果見圖2。

圖2 不同羧肽酶添加量對醬油中氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.2 Effect of different carboxypeptidase addition on amino nitrogen contents in soy sauce

由圖2可知，與對照樣品相比較，添加0～2.5 U/kg成曲的羧肽酶粗酶液后氨基態(tài)氮都有所提高，這可能是添加羧肽酶后，醬醪中更多的多肽被水解成氨基酸。此外，隨著羧肽酶添加量的增加，氨基態(tài)氮含量顯著增加，但羧肽酶添加量到一定程度（1.5 U/kg成曲），氨基態(tài)氮含量增加不顯著。因此建議羧肽酶的添加量控制在1.5 U/kg成曲。

3 結(jié)論

本研究考察了不同碳源、氮源、初始pH值、多種無機鹽、水分含量及接種量對黑曲霉H1-6固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)羧肽酶的影響。在單因素試驗及Plackett-Burman試驗的基礎(chǔ)上，采用中心組合響應(yīng)面法對產(chǎn)酶條件進行優(yōu)化，并建立了酶活力與麩皮、水分含量及接種量之間的二次多項回歸模型，得出最優(yōu)發(fā)酵條件為：麩皮添加量36%，豆粕添加量50%、NaCl添加量10%、初始pH值為6.0、含水量56.6%，接種量為1.3%（即1.3×106CFU/g）。在此優(yōu)化條件下，羧肽酶的酶活力達到938.33 mU/g。在最優(yōu)發(fā)酵條件下獲得的發(fā)酵羧肽酶粗酶液添加到醬油釀造中，能有效提高醬油中氨基態(tài)氮的含量，進而提高其鮮味，并且最佳添加量為1.5 U/kg成曲。該研究結(jié)果為羧肽酶生產(chǎn)應(yīng)用的研究提供實驗基礎(chǔ)。下一步研究將繼續(xù)在合適的生物反應(yīng)器進行放大試驗生產(chǎn)，以促進羧肽酶固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)實現(xiàn)工業(yè)化。