王帥靜，李 嘯，2 *，劉玲彥，談亞麗，肖澤濤，王慶宇，裴宇鵬，馮雪娜

（1.三峽大學(xué)生物制藥學(xué)院 中國(guó)輕工業(yè)酵母功能重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 宜昌 443002；2.安琪酵母股份有限公司 湖北省酵母功能重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 宜昌 443003；3.安琪生物集團(tuán)有限公司 湖北省酵母功能重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 宜昌 443003）

益生菌即食用者通過攝取適當(dāng)?shù)牧浚?duì)其身體健康有益處的微生物統(tǒng)稱[1-2]。乳酸菌作為一種優(yōu)良益生菌，具有改善宿主的腸道環(huán)境、抑制有害菌的生長(zhǎng)[3-4]、提高免疫力[5]、調(diào)節(jié)腸道黏膜屏障[6]、降低膽固醇含量[7]等優(yōu)點(diǎn)，有益于宿主身體健康[8]。同時(shí)，益生菌憑借其安全、可靠及性能優(yōu)良等特點(diǎn)在疾病的預(yù)防、治療和重癥修復(fù)過程中起著重要作用[9-11]。由于益生菌具有良好的降膽固醇，抑制有害菌生長(zhǎng)和重癥修復(fù)等特性，所以國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)對(duì)益生菌的需求量每年都在穩(wěn)步增長(zhǎng)[12]。

西藏地區(qū)具有低氧、高海拔及晝夜溫差大等特點(diǎn)，有利于篩出抗逆性能較好的工業(yè)菌株。咸天成等[13]以保水率、酸化能力和乳清析出率等指標(biāo)，從西藏藏靈菇中篩選出改善牦牛奶營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的桿菌Q5；杜琨[14]采用牛津杯法于西藏高原酸奶中篩選出能夠抑制金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的乳酸菌。目前已有從發(fā)酵食品及腸道中篩選出優(yōu)良益生菌菌株并成功應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)[15-16]，但是我國(guó)益生菌市場(chǎng)上抗逆性能較好的核心工業(yè)化菌株相對(duì)較少。因此，從西藏地區(qū)篩選功能性益生菌并對(duì)其抗逆性進(jìn)行研究具有重要意義。

本研究采用鈣透明圈法從西藏地區(qū)牧民家奶酪、牦牛奶、奶牛糞等樣品中分離、篩選益生菌株，采用形態(tài)觀察及分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行鑒定，并對(duì)所篩選出的益生菌的生長(zhǎng)特性、產(chǎn)酸能力、膽鹽、酸、人工胃液耐受性能及抑制大腸桿菌（Escherichia coli）能力進(jìn)行分析，以期得到耐性比較好、具有工業(yè)化潛力的益生菌菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

公牛糞、母牛糞、犏牛糞、奶牛糞、牛犢糞、牦牛奶、犏牛奶、牧民家奶酪：西藏地區(qū)。

1.1.2 菌株

大腸桿菌（Escherichia coli）標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）GL、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）PL、鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）SLT：安琪酵母股份有限公司。

1.1.2 試劑

細(xì)菌通用引物27F、1492R：武漢奧科鼎盛生物科技有限公司；2×T5 Super聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）Mix：北京擎科生物科技有限公司；牛膽鹽（生化試劑）、胃蛋白酶（3 000 U/g）、巰基乙酸鈉（分析純）：上海源葉生物科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS固體培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基（自然pH 6.2）：北京陸橋技術(shù)股份有限公司；膽鹽乳糖（bile lactose，BL）固體培養(yǎng)基：北京索萊寶科技有限公司；SL固體培養(yǎng)基：山東拓普生物工程有限公司。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，氯化鈉10 g/L，酵母提取物5 g/L，121 ℃高壓蒸汽壓滅菌20 min。固體培養(yǎng)基中添加20 g/L瓊脂粉。

1.2 儀器與設(shè)備

GDS-8000凝膠成像儀：美國(guó)UVP Biolmaging System公司；FP-1100-C Bioscreen全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀：芬蘭Bioscreen有限公司；5418G型離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司；XSP-2C顯微鏡：上海長(zhǎng)方光學(xué)儀器有限公司；TDL-40B離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；SP-754紫外可見光分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株種子液制備

乳酸菌種子液培養(yǎng)：挑取保藏于MRS斜面上的乳酸菌單菌落接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中，于37 ℃靜置培養(yǎng)24 h。

大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922種子液的培養(yǎng)：挑取保藏于LB斜面上的大腸桿菌單菌落接種于LB培養(yǎng)基中，于37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)24 h。

1.3.2 乳酸菌的分離純化與篩選

分別取1 g樣品于10 mL無菌水中混勻，按10倍梯度依次稀釋至10-7，取稀釋度分別為10-5、10-6、10-7的菌懸液涂布于含0.2%碳酸鈣的MRS、BL和SL固體培養(yǎng)基中[17-18]，于37 ℃條件下靜置培養(yǎng)24～48 h。培養(yǎng)結(jié)束后以平板上菌落直徑與透明圈直徑比為指標(biāo)對(duì)產(chǎn)酸菌株進(jìn)行初步篩選；采用平板劃線法對(duì)篩選所得的菌株進(jìn)行多次純化，以菌落生長(zhǎng)情況（表面乳白色）及細(xì)胞形態(tài)（桿狀）為指標(biāo)，對(duì)樣品中的乳酸菌進(jìn)行復(fù)篩。

1.3.3 乳酸菌菌株的鑒定

形態(tài)觀察：將分離菌株接種到MRS固體培養(yǎng)基平板上，37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落形態(tài)與顯微形態(tài)[19]。

分子生物學(xué)鑒定：采用十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）法[19-20]提取細(xì)菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA），以其為模板，27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）[21]為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：mix 25 μL，引物27F 2 μL，引物1492R 2 μL，DNA模板1 μL，雙蒸水（ddH2O）20 μL。PCR擴(kuò)增條件：98 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性10 s，58 ℃退火10 s，72 ℃延伸45 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)合格后，送至奧科鼎盛有限公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果提交至美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnologyinformation，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中采用基本局部比對(duì)搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）進(jìn)行同源性比對(duì)搜索[22-23]，若與已知的菌株同源性達(dá)97.5%，則認(rèn)為是同一種[23]。

1.3.4 乳酸菌的生長(zhǎng)及代謝特性研究

（1）生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

將乳酸菌的種子液按5%（V/V）的接種量分別接種至裝有MRS肉湯培養(yǎng)基的微孔板（100孔）中，將微孔板置于全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀中，于37 ℃培養(yǎng)，直到乳酸菌生長(zhǎng)至穩(wěn)定期為止，期間每隔2 h測(cè)定OD600nm值，對(duì)不同菌株的生長(zhǎng)曲線進(jìn)行繪制。

（2）產(chǎn)酸能力測(cè)定[24]

將乳酸菌的種子液按5%（V/V）的接種量分別接種至MRS肉湯培養(yǎng)基中，于37 ℃靜置培養(yǎng)24～48 h，培養(yǎng)過程中，每隔3 h取適量發(fā)酵液于10 000 r/min離心5 min，取上清液測(cè)pH值和乳酸含量。

（3）耐受性分析

膽鹽耐受性：將乳酸菌的種子液按5%（V/V）的接種量分別接種至含不同膽鹽（0、0.2%、0.4%、0.6%）[18]的MRS肉湯培養(yǎng)基中，置于微孔板（100孔）中，將微孔板置于全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀中，于37 ℃培養(yǎng)48 h，期間每隔2 h測(cè)定OD600nm值，對(duì)菌株在不同濃度膽鹽下的生長(zhǎng)情況進(jìn)行研究。

酸耐受性：將乳酸菌的種子液按5%（V/V）的接種量接種至含不同pH（2、3、4、自然（6.2））的MRS肉湯培養(yǎng)基的微孔板（100孔）中，將微孔板置于全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀中，于37 ℃培養(yǎng)48 h，期間每隔2 h測(cè)定OD600nm值，對(duì)菌株在不同pH值下的生長(zhǎng)情況進(jìn)行研究。

人工胃液耐受性：將乳酸菌的種子液按5%（V/V）的接種量接種至MRS肉湯培養(yǎng)基中，于37℃條件下靜置培養(yǎng)24～48 h取發(fā)酵液，測(cè)定菌株耐人工胃液（0.20%NaCl、0.30%胃蛋白酶，pH 2.5）的能力[18]，采用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定活菌數(shù)[18]，并計(jì)算存活率，其計(jì)算公式如下：

式中：SLAB為培養(yǎng)2 h的活菌數(shù)，CFU/mL；SMRS為培養(yǎng)0 h的活菌數(shù)，CFU/mL。

（4）抑制大腸桿菌的能力

將乳酸菌的種子液按5%的接種量接種至MRS肉湯培養(yǎng)基中，于37 ℃條件下靜置培養(yǎng)24～48 h，培養(yǎng)結(jié)束后，取發(fā)酵上清液為試驗(yàn)組，SLT、MRS培養(yǎng)基和水均為對(duì)照組，采用牛津杯法測(cè)抑菌圈直徑[25]。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌菌株的分離及篩選

從樣品中共分離純化出76株細(xì)菌，通過革蘭氏染色及鈣透明圈法篩選出25株疑似乳酸菌。部分典型菌株的菌落及細(xì)胞形態(tài)見圖1，25株疑似乳酸菌的菌落及細(xì)胞形態(tài)描述見表1。

圖1 典型乳酸菌菌株的菌落形態(tài)（A）及細(xì)胞特征（B）Fig.1 Colony morphology (A) and cell characteristics (B) of typical lactic acid bacteria strains

表1 乳酸菌菌株的菌落形態(tài)及細(xì)胞特征描述Table 1 Description of colony morphology and cell characteristics of lactic acid bacteria strains

由圖1及表1可知，篩選得到的25株乳酸菌菌株的菌落均呈圓形、有光澤、表面光滑、有光澤、邊緣規(guī)則、微凸起、不透明，細(xì)胞呈球狀、桿狀、鏈球狀3種形態(tài)。

2.2 乳酸菌菌株的鑒定

25株乳酸菌菌株的鑒定結(jié)果見表2。

表2 25株菌株的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果Table 2 Molecular biology identification results of 25 strains

由表2可知，25株乳酸菌中7株為益生菌，包括2株鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosum）（T1-1和T1-2）；4株副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）（T1-5、T1-7、T1-9、T1-d）；1株植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）（B2）；其他17株菌株為非益生菌，分別為3株食竇魏斯氏菌（Weissella cibaria）；7株腸球菌（Enterococcus）；6株鏈球菌（Streptococcus）；1株微小桿菌（Exiguobacterium）。

2.3 乳酸菌菌株的生長(zhǎng)曲線

10株乳酸菌菌株的生長(zhǎng)曲線見圖2。

由圖2可知，菌株T1-1、T1-2、T1-5、T1-7、T1-9、T1-d、B2、SLT的遲滯期為0～2 h，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為2～12 h，穩(wěn)定期為12～48 h。當(dāng)菌株生長(zhǎng)至穩(wěn)定期，鼠李糖乳桿菌T1-1、T1-2比菌株SLT的生物量多；副干酪乳桿菌T1-5、T1-9、T1-d比菌株GL和T1-7的生長(zhǎng)速度快；植物乳桿菌B2生長(zhǎng)速度明顯快于菌株SLT。這些菌株短時(shí)間生長(zhǎng)速度快，符合工業(yè)化菌株的要求。因此，選擇在生長(zhǎng)方面具有一定優(yōu)勢(shì)的菌株T1-1、T1-2、T1-5、T1-9、T1-d、B2、SLT測(cè)定產(chǎn)酸能力。

圖2 乳酸菌菌株的生長(zhǎng)曲線Fig.2 Growth curves of lactic acid bacteria strains

2.4 乳酸菌菌株產(chǎn)酸能力的測(cè)定結(jié)果

以商業(yè)化菌株SLT為對(duì)照，菌株T1-1、T1-2、T1-5、T1-9、T1-d、B2的產(chǎn)乳酸量與發(fā)酵上清液的pH值見圖3。

由圖3A可知，當(dāng)乳酸菌菌株發(fā)酵時(shí)間為72 h時(shí)，菌株T1-1及SLT的產(chǎn)乳酸能力較強(qiáng)，乳酸含量分別為13.58 g/L和13.46 g/L，其次是菌株T1-2、T1-5、T1-9、T1-d。而菌株B2的產(chǎn)乳酸能力最弱（7.14 g/L），但是由圖3B可知，菌株B2的發(fā)酵液pH值最低，因此，推測(cè)菌株B2產(chǎn)其他有機(jī)酸的能力較強(qiáng)。此外，所有菌株的培養(yǎng)過程中，發(fā)酵液pH逐步降低（從pH6.0降低至pH4.0左右），并且結(jié)合菌株生長(zhǎng)曲線可知，這些菌株的生長(zhǎng)能力較高，因此，可以初步推測(cè)這些菌株的耐酸能力較高，是符合工業(yè)化生產(chǎn)的益生菌菌株。

圖3 乳酸菌菌株產(chǎn)乳酸量（A）與發(fā)酵上清液的pH值（B）在發(fā)酵過程中的變化Fig.3 Changes of lactic acid yield (A) and pH value of fermentation supernatant (B) of lactic acid bacteria strains during fermentation process

2.5 乳酸菌菌株耐受性分析

2.5.1 耐酸能力測(cè)定結(jié)果

以商業(yè)化菌株SLT為對(duì)照，菌株T1-1、T1-2、T1-5、T1-9、T1-d、B2的耐酸能力見圖4。

圖4 乳酸菌菌株耐酸能力的測(cè)定結(jié)果Fig.4 Determination results of acid resistance ability of lactic acid bacteria strains

由圖4可知，當(dāng)MRS肉湯培養(yǎng)基的初始pH值為2和3時(shí)，7株乳酸菌株幾乎不生長(zhǎng)；當(dāng)初始pH值為4和6.2（自然）時(shí)，這7株菌株都能生長(zhǎng)。其中菌株B2生長(zhǎng)能力較好，因此該菌株表現(xiàn)出較好的耐酸能力。

2.5.2 耐膽鹽能力測(cè)定結(jié)果

以商業(yè)化菌株SLT為對(duì)照，菌株T1-1、T1-2、T1-5、T1-9、T1-d、B2的耐膽鹽能力見圖5。

耐膽鹽試驗(yàn)可以模擬益生菌在人體腸道中的生長(zhǎng)繁殖情況，在膽鹽濃度越高的情況下，若菌株仍可生長(zhǎng)，則說明該益生菌株可以在人體腸道中生存。由圖5可知，菌株SLT在膽鹽濃度為0.2%時(shí)生長(zhǎng)能力較好；菌株T1-1、T1-9在膽鹽濃度為0.4%時(shí)生長(zhǎng)能力較好，而菌株T1-2、T1-5、B2在膽鹽濃度為0.6%時(shí)生長(zhǎng)能力較好，說明菌株T1-2、T1-5、B2耐膽鹽能力好，比較符合工業(yè)益生菌的耐膽鹽要求[26]。

圖5 乳酸菌菌株耐膽鹽能力測(cè)定結(jié)果Fig.5 Determination results of bile salt resistance ability of lactic acid bacteria strains

2.5.3 乳酸菌菌株耐人工胃液能力的測(cè)定結(jié)果

以商業(yè)化菌株SLT為對(duì)照，菌株T1-1、T1-2、T1-5、T1-9、T1-d、B2耐人工胃液的能力見圖6。

圖6 乳酸菌菌株耐人工胃液能力Fig.6 Artificial gastric juice resistance ability of lactic acid bacteria strains

由圖6可知，植物乳桿菌B2在人工胃液的存活率最高為57.4%，副干酪乳桿菌T1-2在人工胃液的存活率最低為9%。這幾株菌都能在人工胃液中生存，但是菌株B2相對(duì)其他菌株而言，存活率較高，比較符合益生菌的要求。

2.6 乳酸菌菌株對(duì)大腸桿菌的抑菌效果

以商業(yè)化菌株SLT為對(duì)照，MRS培養(yǎng)基及水為空白，菌株T1-1、T1-2、T1-5、T1-9、T1-d、B2對(duì)大腸桿菌的抑制能力見圖7。

圖7 乳酸菌菌株對(duì)大腸桿菌的抑菌效果Fig.7 Antibacterial effect of lactic acid bacteria strains on Escherichia coli

由圖7可知，與對(duì)照組相比，處理組中的大腸桿菌指示菌生長(zhǎng)被明顯抑制，且抑菌圈明顯，說明菌株T1-1、T1-2、T1-5、T1-9、T1-d、B2的代謝產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌有明顯的抑制作用。其中菌株T1-2和B2具有較好的抑菌效果，抑菌圈直徑分別為22.0 mm和19.5 mm。

3 結(jié)論

采用鈣透明圈法從西藏地區(qū)不同來源樣品中分離、篩選得到25株乳酸菌，經(jīng)形態(tài)觀察及分子生物學(xué)鑒定，確定7株為益生菌，分別為1株植物乳桿菌（Lactobacillus plan tarum），2株鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）；4株副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracaseium）。其中植物乳桿菌B2具有良好的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)、產(chǎn)酸能力（發(fā)酵終pH值在4左右）、耐酸（pH為4）、耐膽鹽（0.6%）、耐人工胃液能力（菌株存活率為57.4%）以及抑菌效果（抑菌圈直徑為19.5 mm）。本研究可為從西藏地區(qū)篩選出益生功能菌株提供一定的指導(dǎo)意義。