吳浪濤，房 峻，吳 新，李兆雯，王曉珂，方 芳*

（1.江南大學 生物工程學院 工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 未來食品科學中心，江蘇 無錫 214122；3.珠海天禾食品有限公司，廣東 珠海 519090）

醬油是以大豆或豆粕、小麥或麩皮為原料，通過微生物發(fā)酵成的液體調味品。醬油味道鮮美，含有氨基酸、有機酸、醇類、酯類、醛類等多種呈味和風味物質。中國醬油一般采用低鹽固態(tài)或高鹽稀態(tài)發(fā)酵工藝，其生產流程包括：原料蒸煮、種曲培養(yǎng)、成曲制備、鹽水發(fā)酵、淋油或壓榨[1]。醬油發(fā)酵是包括霉菌、細菌、酵母在內的多菌種參與的混菌發(fā)酵過程。生產醬油的原料中含有豐富的營養(yǎng)物質，能夠為微生物生長提供良好的條件。因此，醬油在生產和貯存過程中易出現(xiàn)因微生物污染引起的“生花”、變餿、脹袋、沉淀、渾濁、變酸等問題[2]。圓盤制曲和罐內控溫發(fā)酵工藝的普及，對減少醬油生產過程中雜菌和腐敗菌的污染起到了良好的作用。然而醬油發(fā)酵過程不是全封閉的純菌種發(fā)酵過程，固態(tài)原料蒸煮時也可能存在滅菌的死角。為了保證發(fā)酵進程的順利和成品的質量，目前，普遍采用生產工藝優(yōu)化和在成品中添加化學防腐劑等防止腐敗微生物污染的防治手段。生產工藝優(yōu)化不能完全解決雜菌污染，對生產條件如廠房衛(wèi)生條件和設備配置也有一定的要求。添加化學防腐劑不符合高端、綠色和健康食品的理念。因此，醬油的生物防腐工藝和措施受到研究者的廣泛關注。乳酸菌是一類參與許多食品發(fā)酵的重要微生物，它們不僅對食品風味和營養(yǎng)的形成有積極貢獻，還可合成許多具有抑菌性能的代謝產物，如有機酸、蛋白肽類物質、過氧化氫等。將乳酸菌或其抗菌代謝產物用于醬油的生物防腐具有良好的應用潛力和重要的研究意義。

1 微生物引起的醬油變質

與醬油變質有關的微生物包括耐熱或耐鹽的革蘭氏陽性細菌、霉菌和酵母。芽孢桿菌（Bacillus）和酵母菌是最常見的引起醬油變質的污染菌。引起醬油沉淀和渾濁的微生物主要包括芽孢桿菌、鐮刀菌和霉菌；導致醬油出現(xiàn)脹袋、產氣的微生物則包括芽孢桿菌、乳桿菌（Lactobacillus）、假絲酵母（Candida）和白地霉（Geotrichum candidum）；醬油變餿和“生花”則主要與酵母菌有關（見圖1）。

圖1 引起醬油變質的微生物Fig.1 Microorganisms causing spoilage in soy sauce

1.1 醬油“生花”與變餿

在醬油生產過程中，空氣、發(fā)酵容器、生產工具、原料等中的耐鹽酵母容易混入其中并開始繁殖。酵母菌一方面能夠產生醇、酯等多種風味物質形成特殊香氣，是醬油釀造中重要的具有產香功能的微生物；另一方面，有些酵母菌會使醬油表面長出白膜引起醬油“生花”、產生氨臭味引起醬油變餿等危害。如產醭酵母能夠在醬油表面生成灰白色粉狀皮膜，并且分解醬油中的物質成分產生臭味。畢赤酵母（Pichia）、球擬酵母（Torulopsis）和魯氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）是常見的產醭酵母，能夠在醬油表面形成白膜[3]。研究證實，醬醅里的白點與產膜性魯氏接合酵母過度繁殖有關。產膜性魯氏接合酵母在高滲透壓環(huán)境下高效表達編碼疏水蛋白的基因FLO11，在細胞表面積累糖蛋白，增加酵母疏水性，從而聚集在醬醅表面形成白點[4]。引起醬油變餿的雜菌包括枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、納豆芽孢桿菌（Bacillus natto）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）等。醬油中污染了這些菌不僅會使醬油達不到食品衛(wèi)生要求，還產生令人不愉快的氨臭味，嚴重影響醬油的食用安全和品質。此外，醬油中存在的雜菌還能利用葡萄糖進行厭氧發(fā)酵生成2,3-丁二醇并進一步轉化為雙乙酰[5]，當醬油中雙乙酰含量過高時表現(xiàn)為餿味，嚴重影響醬油的品質和風味。

1.2 醬油產氣與脹袋

醬油產氣脹袋（罐）是常見的一種醬油腐敗現(xiàn)象。醬油產氣脹袋的機理復雜，其原因主要有三類：物理因素、化學因素和生物因素。物理因素常指夏季高溫時空氣發(fā)生熱脹冷縮，導致醬油脹袋?；瘜W因素一般是酸與馬口鐵的鐵銹作用產生氣體，對瓶裝和袋裝醬油影響較小。生物因素是醬油產氣的主要原因，空氣、原料及產品中含有的微生物以及因滅菌不徹底留下的微生物都有可能繼續(xù)發(fā)酵醬油產生氣體。能夠引起醬油脹袋的細菌主要有芽孢桿菌、乳酸菌、梭菌等。對醬油的生產和包裝過程中的產氣微生物情況研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）及其亞種（Bacillus subtilissubsp.natto）和破布子乳桿菌（Lactobacillus pobuzihii）含量較多時對醬油的脹袋、脹罐等有很大影響[6]。此外，巨大芽孢桿菌不止會使醬油脹袋，還會快速分解明膠等大分子物質，容易造成醬油中的風味物質降解嚴重破壞醬油的風味[7]。能夠引起醬油脹袋的真菌包括菌膜假絲酵母（Candida pelliculosa）和白地霉（Geotrichum candidum）。這兩類菌能耐受較高的滲透壓（15%NaCl或80%葡萄糖），在pH值為5～6生長狀態(tài)良好，它們的存在對醬油的品質有較大的不良影響[8]。

1.3 醬油沉淀與渾濁

醬油出現(xiàn)沉淀或渾濁，如果不是污染了腐敗微生物并不影響其食用安全，但卻降低了醬油的品質。因此，保證生醬油加熱不產生沉淀和渾濁以及成品醬油的澄清透明是醬油生產過程控制的重點。引起醬油沉淀和渾濁的因素主要包括原料、蒸煮工藝或發(fā)酵工藝參數(shù)的改變、浸淋工序不合理、制曲的條件差、成曲酶活力低、雜菌污染、滅菌不徹底等。其中雜菌污染是使醬油發(fā)生沉淀或渾濁的一個重要的因素。制曲時由于曲料營養(yǎng)豐富容易使一些厭氧菌大量繁殖，通過浸淋和滅菌后仍滯留在成品當中。此外，細菌菌體的表面張力大，也容易吸附醬油中的一些大分子物質形成肉眼可見的沉淀物。地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）和巨大芽孢桿菌（Bacillus megatherium）產生的胞外多糖進入到醬油中會形成黏液多糖，進而使醬油產生絮狀沉淀。對醬油一次沉淀形成機制的研究發(fā)現(xiàn)，醬油原油在60 ℃時會形成促沉淀因子L-谷氨酸-5-丁酯，促進蛋白質的絮凝沉淀[9]。曾新安等[10]在對醬油的原沉淀、一級沉淀和二級沉淀的成分進行分析后發(fā)現(xiàn)，蛋白質沉淀是醬油沉淀的主要原因。但目前關于醬油各級沉淀形成機制的研究尚不完全清楚，醬油污染微生物的代謝產物與醬油沉淀的關系也有待開展深入研究。

2 醬油微生物污染的防治

2.1 工藝優(yōu)化防止醬油腐敗

醬油腐敗變質主要與微生物有關，因此防止醬油腐敗的關鍵在于去除雜菌的污染。為了避免醬油出現(xiàn)“生花”、變餿、脹袋、沉淀、渾濁等問題，除了可以通過建立無菌的過濾車間、醬油高溫瞬時滅菌、嚴格對設備滅菌、保持場地的清潔衛(wèi)生來實現(xiàn)[3-4]。超聲波保鮮、紫外線保鮮、電離輻射保鮮技術也常用于醬油保鮮，超聲波滅菌速度快、且無外來添加物、對人體無害，但滅菌不徹底，常與其他滅菌手段協(xié)同滅菌，高獻禮等[11]則應用超聲協(xié)同熱殺菌技術使醬油在無外加防腐劑、密封的情況下保質期大于180 d。紫外線滅菌對細菌、酵母、霉菌等都有很好的殺滅效果，用紫外線能夠殺滅醬油菌落總數(shù)的85%，但該滅菌手段會使高蛋白、高脂肪食物產生輕度不良風味[12]。電離輻射對腐敗細菌同樣有很好的殺滅效果，戴智華[13]用90萬rad的γ射線輻射滅菌醬油，能使醬油滅菌率在96%以上，且對醬油總酸、氨基酸態(tài)氮及感官指標幾乎沒有影響。但醬油中的酵母和霉菌對該技術有一定的抗性所以也存在一定局限性。

此外限制氧氣對醬醅產生白點有一定的控制作用，所以可在貯油罐上口加蓋并需注意間歇通氣來防止醬油“生花”。為了防止醬油產氣、脹袋，可在醬油灌裝前進行真空脫氣處理，并將灌裝管深入到容器底部，減少氣體的產生。對于減少醬油發(fā)生沉淀的工藝優(yōu)化措施主要有：在原料的處理方面選擇適合的原料和合適的粉碎粒度大?。辉谡糁筮^程中確定合適的蒸煮加水量、潤水時間、水溫及蒸煮壓力；提高成曲質量并且在發(fā)酵過程中確定合適的發(fā)酵溫度、醬醪pH值、鹽水濃度；去除醬油的二次沉淀可選擇添加蛋白酶制劑、澄清劑或者利用硅藻土過濾、膜過濾來實現(xiàn)[14]。

2.2 防腐劑用于防止醬油變質

在醬油中添加防腐劑也是防止醬油的腐敗的有效措施，比工藝優(yōu)化更高效、經濟和方便?？稍卺u油中添加的防腐劑包括化學防腐劑和天然防腐劑。化學防腐劑包括苯甲酸及其鈉鹽、山梨酸及其鉀鹽、雙乙酸鈉、對羥基苯甲酸酯類（尼泊金酯）和脫氫醋酸鈉等[15]。苯甲酸及其鈉鹽是應用最為廣泛的食品用化學防腐劑，其在偏酸性環(huán)境下對細菌的抑制力較強，對酵母和霉菌的抑制力較弱，防腐適宜pH值為2.5～4.0，在醬油中的使用限量為1.0 mg/L。山梨酸（鉀）能有效地抑制霉菌、酵母菌和好氣性細菌的活性，還能抑制肉毒桿菌（Clostridium botulinum）、葡萄球菌（Staphylococcus）、沙門氏菌（Salmonella）等有害微生物的生長和繁殖，防腐適宜pH值在5.5以下，在醬油中的添加比例為0.01%。對羥基苯甲酸酯類對霉菌及酵母的作用較強，對細菌尤其是革蘭氏陰性桿菌和乳酸菌的抑制作用較弱，其防腐適宜pH值為4～8，在醬油中的最大使用量為0.3 g/kg?；瘜W防腐劑的抑菌譜與抑菌強度存在一定的差異，所以將各類化學防腐劑聯(lián)合起來使用能夠達到更好的防腐效果。例如，將苯甲酸鈉和山梨酸鉀按照1∶1的質量比配成復合防腐液，當溫度為25 ℃時，總質量濃度只需0.4 mg/kg即可達到防腐效果[16]。在醬油中添加山梨酸和對羥基苯甲酸的混合物，對霉菌、酵母菌、細菌有更好的抑制作用[17]。雖然化學防腐劑能夠在很大程度上滿足人們對防腐的要求，但是當這些化學防腐劑攝入過量或者長期攝入的話對人體可能有一定的毒副作用。因此研究者考察了一些天然植物提取物的抑菌作用。在對118種中草藥對醬油腐敗菌畢赤氏酵母的抑制研究發(fā)現(xiàn)，烏梅、丁香和石榴皮對醬油都有防腐效果。其中烏梅的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）和最低殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）最小，分別是31.0 g/L和62.5 g/L[18]。洋蔥汁、甘草、迷迭香等物質的抑菌性在醬油中也有很好的應用[19-20]。但目前植物提取物存在提取方法各異、分離水平低、應用成本高且無法確定有效抑菌成分及其抑菌機理等缺點，所以限制了其應用的快速發(fā)展。

3 乳酸菌在醬油防腐中的應用

化學防腐劑用于食品防腐存在一定的安全問題，而植物天然提取物防腐劑存在提取成本高、分離水平低等問題。因此微生物防治受到研究者們的廣泛關注，許多微生物都可以合成抑制其他微生物生長的抑菌物質。目前，通過微生物培養(yǎng)、產物提取和分離已成功獲得了納他霉素、乳酸鏈球菌素、羅氏菌素、苯乳酸、乳酸、檸檬酸等多種具有抑制和殺滅食品腐敗菌的微生物防腐劑[21]。乳酸菌是一類革蘭氏陽性、不產生孢子、耐酸且產乳酸的兼性厭氧細菌。它們中的大多數(shù)菌是食品安全菌，并且乳酸所產的細菌素、有機酸等代謝產物具有多種腐敗細菌和部分真菌的特性，在防治醬油腐敗具有良好的應用效果和前景。乳酸菌主要包括乳桿菌屬、乳球菌屬（Lactococcus）、氣球菌屬（Aerococcus）、足球菌屬（Pediococcus）、鏈球菌屬（Streptococcus）等多個菌屬[22]。乳酸菌在醬油的發(fā)酵過程中不僅能通過產生包括有機酸、氨基酸在內的多種風味物質而參與發(fā)酵，還能夠合成多種抑菌物質來抑制如革蘭氏陰性菌和真菌食品腐敗菌的生長（見圖2）。

圖2 乳酸菌抗菌代謝產物及其對醬油中腐敗菌的抑制Fig.2 Antimicrobial substances synthesized by lactic acid bacteria and their inhibition on spoilages organisms from soy sauce

因此，乳酸菌及其代謝產物可被認為是天然的綠色防腐劑[23]。如在醬醪發(fā)酵前期添加1×106CFU/g的嗜鹽片球菌（Pediococcus halophilus）到醬醪中，能減少89.12%沉淀生成量，延遲發(fā)酵醬油二次沉淀的產生時間（15 d）且對醬油風味影響較小[24]。此外乳酸菌還能合成多種抗菌化合物如有機酸、生物活性抗菌肽、脂肪酸、羧酸、細菌素、過氧化氫、酚類等[25]。正是由于這些抑菌物質的作用，賦予了乳酸菌廣泛的抗菌效果，它們被證明是最有潛力的生物防腐劑。

3.1 有機酸防腐

有機酸是微生物利用碳水化合物發(fā)酵產生的代謝產物之一。微生物合成的有機酸包括乳酸、乙酸、甲酸、丙酸、苯乳酸、檸檬酸、蘋果酸等。通常微生物細胞在環(huán)境pH接近中性時才能保持其內部的化學平衡，而乳酸菌可以通過產生有機酸來影響外界環(huán)境的pH值。外界環(huán)境物質組成和pH值改變時，細胞膜的結構單位如蛋白質、磷脂等也隨之發(fā)生變化。這些改變會影響細胞膜的通透性，導致細胞內代謝物的滲漏[26]。乳酸是乳酸菌合成的主要有機酸，它不僅可以被用作各種加工食品中的酸化劑、pH緩沖劑，也是有效的腐敗微生物抑制劑。乳酸不僅對大腸桿菌（Escherichia coli）、黃曲霉（Aspergillus flavus）、凝結芽孢桿菌（Bacillus coagulans）、單核增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）、沙門氏菌（Salmonella）等都有不同程度的抑制作用，還能夠增加醬油的口感并通過降低醬醪的pH值來有效抑制可引起醬油變質、脹袋的巨大芽孢桿菌生長。乙酸對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、酵母菌、霉菌都有一定的抑制作用。微生物對乙酸的敏感性取決于它們的細胞形態(tài)和結構特性。如與革蘭氏陽性菌、酵母菌、霉菌相比，革蘭氏陰性菌細胞壁較為脆弱，它們在pH值為6時生長即受到抑制；黑曲霉則在乙酸pH＜4.1才能被抑制，釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）要在乙酸pH＜3.9才能被抑制[27]。研究表明添加0.3%乙酸鈉和乳酸能有效防止醬油的產氣脹袋[28]。在面對不同雜菌時，不同有機酸表現(xiàn)出來的抑菌強度存在一定差異。在泰利普氏醬油培養(yǎng)基中檸檬酸可使大腸桿菌的數(shù)量減少6.3個數(shù)量級，且其抗菌性能強于乙酸和乳酸。在實際的應用過程中常將各類有機酸結合起來運用以達到更好的抑菌效果。在醬油中添加0.15%～0.60%的復合有機酸（以質量比為3∶2∶2∶2的乙酸、檸檬酸、琥珀酸、乳酸）能夠有效阻止產膜酵母的的生長防止醬油生花[29]。乳酸菌合成的苯乳酸作為一種新型高效生物防腐劑，能夠破壞雜菌細胞膜的通透性和完整性，其對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌和腐敗真菌都有一定的抑制作用，具有有效的廣譜抗菌活性。此外，它具有溶解性高、穩(wěn)定性強等特點，且對人和動物無毒無害，其潛在的防腐功能有望開發(fā)并運用在醬油腐敗的防治中[30-31]。

3.2 細菌素的抑菌作用

肽類物質是乳酸菌合成的抑菌物質之一，也稱為細菌素。通過分析它們是否對蛋白酶處理敏感可以判斷乳酸菌的抑菌物質是否為蛋白質或肽類[32]。細菌素是由某些細菌產生的一類具有抑菌活性的多肽或前體多肽，能夠對同種近緣菌株呈現(xiàn)狹窄的抑制譜。大多數(shù)乳酸菌所產的細菌素只抑制革蘭氏陽性菌，如發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentium）、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）產生的細菌素對乳桿菌、足球菌、明串球菌（Leuconostoc）、乳球菌等具有抑制作用。有些乳桿菌產的細菌素，如植物乳桿菌素SLG1不但可以抑制革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌，還可以抑制部分真菌[33]。目前，只有乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）產生的乳酸鏈球菌素（Nisin）已作為食品防腐劑應用在食品中。Nisin主要有2種抑菌機制：一種是作用在敏感細胞膜上，并且依賴于肽聚糖前體分子脂質Ⅱ的濃度，使細胞膜上形成孔洞，導致內容物泄漏，細胞自溶而死亡；另一種是隔離脂質Ⅱ來抑制細胞壁的合成，進而抑制菌的生長。乳酸鏈球菌素對大部分的革蘭氏陽性菌，比如金黃色葡萄球菌、李斯特菌、微球菌，特別是芽孢桿菌、梭菌等具有明顯的抑制作用[34-35]。已有研究證實，在醬醅中添加0.4%的乳酸乳球菌發(fā)酵液能夠有效抑制醬醅中雜菌的生長，并保持醬醅62 d不變質[36]。在醬油中加入50～100 mg/L乳酸鏈球菌素，能夠有效地抑殺醬油中的腐敗細菌，實現(xiàn)醬油的防腐保鮮[37]。Nisin也常與其他抑菌物質協(xié)同抑菌應用在醬油防腐當中，如使用60 IU/g nisin，1%乳酸鈉和0.02%單辛酸甘油酯組成的復合抑菌劑能有效抑制醬油中的酵母菌和霉菌，延長醬油的保質期[38]。羅氏菌素（reutrein）是羅伊氏乳桿菌產生的廣譜抗菌物質，由乳桿菌在厭氧條件下發(fā)酵甘油產生。羅氏菌素是3-羥基丙醛單體、其環(huán)狀二聚體及其水合物的混合物[39-41]。研究指出羅氏菌素的醛基能與巰基小分子和引起細胞氧化應激的蛋白質相互作用，進而能夠使多種革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、酵母菌、霉菌的生長受到抑制[42]，其廣泛的抑菌譜作為醬油防腐劑具有很好的潛力。

3.3 其他抑菌物質

乳酸菌代謝物質種類繁多，雖然對未知代謝產物的分離較為困難，但是隨著不斷改進抗菌化合物的分離和鑒定的方法可以發(fā)現(xiàn)更多新的乳酸菌產的抑菌物質。研究表明，乳酸菌產生的脂肪酸、酚類物質、過氧化氫、環(huán)二肽等都有很好的抑菌性能。乳酸菌產的脂肪酸能夠有效的抑制某些芽孢桿菌和霉菌[43]，酚類物質對煙曲霉、寄生曲霉、鐮刀菌和青霉均能產生不同程度的抑制作用[44]。過氧化氫能抑制嗜冷和致病微生物的生長[45]，環(huán)二肽對革蘭氏陰性菌、霉菌和酵母的抑制作用也得到了很好的證明[46]。除此之外許多其他的抗菌代謝產物也相繼被發(fā)現(xiàn)，例如分離自食淀粉乳桿菌培養(yǎng)液的兩個具有抗真菌活性的核苷（胞嘧啶核苷和脫氧胞嘧啶核苷），已證實能夠有效的抑制煙色曲霉菌[47]。二乙酰、13-羥基-9-十八烯酸、2-丙烯酯等這些乳酸菌的代謝產物也相繼被報道具有抑菌活性和不同的抑菌譜[48-50]。乳酸菌在發(fā)酵過程中產生的每一種抑菌化合物對醬油的防腐都具有潛在的作用。它們都可能會對醬油中腐敗微生物的生長繁殖造成額外的阻礙。

4 展望

醬油生產過程是多種微生物參與的混菌發(fā)酵過程。雖然醬醪體系中的優(yōu)勢真菌、乳酸菌和鹽對雜菌和腐敗菌有暫時的抑制作用，仍然存在醬油中含有腐敗微生物導致在生產后期或貨架期使醬油變質的風險。了解醬油生產過程可能受到污染的微生物種類，明析污染途徑或工藝階段，解析醬油腐敗的微生物因素和其產生條件，尋找抑制腐敗菌的食品級菌株或添加劑，對建立和開發(fā)防止醬油腐敗的方法和措施具有重要意義。乳酸菌作為食品安全菌，它們是參與食品發(fā)酵的生產菌。乳酸菌可以合成多種類型的可抑制不同微生物的抑菌物質。通過廣泛和深入開展其抑菌物質的分離及純化方法、抑菌機理等方面的研究，將乳酸菌的抗菌代謝產物取代傳統(tǒng)化學防腐劑添加到醬油當中能夠抑制食源性致病菌、腐敗菌，延長醬油的貨架期；另一方面也可篩選具有良好抑菌效果且不影響醬油風味的乳酸菌，將其用于醬油的發(fā)酵生產以防止腐敗微生物的污染。利用乳酸菌作為食品生物防腐劑將推進提升發(fā)酵調味品或發(fā)酵食品品質和安全性的技術研發(fā)與革新。