張 敏，李星星，何 霞，袁 麗，程 希，童榮生

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，四川 成都 610071；2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院藥學(xué)部，四川 成都 610072；3.電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院/個體化藥物治療四川省重點實驗室，四川 成都 610072)

谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(Glutathione S-tranaferase，GSTs)是一種由多個亞家族組成二相代謝酶，GSTM1、GSTT1和GSTP1是其主要的亞組成員，在消除有毒中間代謝物中發(fā)揮著重要作用[1，2]。目前GSTM1、GSTT1和GSTP1與抗結(jié)核藥物誘導(dǎo)的肝損傷(druginduced liver injury during anti-TB treatment，AT-DILI)相關(guān)性研究存在爭議[3，4]，而GSTM1、GSTT1和GSTP1與抗結(jié)核藥物異煙肼、利福平等血藥濃度具有相關(guān)性卻鮮有報道。本文將研究肺結(jié)核患者的GSTs基因多態(tài)性與結(jié)核標(biāo)準(zhǔn)治療方案治療后血漿中抗結(jié)核藥物血藥濃度的相關(guān)性，為進一步研究GSTs與AT-DILI相關(guān)性提供臨床基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料本研究經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院和四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，采用前瞻性研究的方法納入2019年1月至 2020年12月在成都中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院和四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院診斷為肺結(jié)核的60名住院治療患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①根據(jù)世界衛(wèi)生組織《結(jié)核病管理指南》以及中國《抗結(jié)核藥物性肝損傷診治指南(2019年版)》[5，6]確診的或臨床診斷為肺結(jié)核的患者；②年齡16～70周歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①不使用異煙肼等一線抗結(jié)核藥物標(biāo)準(zhǔn)治療方案進行治療的患者；②不能獲取患者抗結(jié)核藥物前后完整相關(guān)生化指標(biāo)檢測值或數(shù)據(jù)情況的病例；③入組前肝功能異?；蚝喜⒒加胁《拘愿窝祝靖蔚葘Ω喂艽笥绊懙幕颊?；④合并服用有其他說明書中肝毒性為主要不良反應(yīng)藥物的患者，如化療藥物、部分抗菌藥物、大劑量對乙酰氨基酚等。

在接受抗結(jié)核治療前應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng) (PCR)-芯片雜交技術(shù)測定 GSTs基因亞組GSTM1、GSTT1和GSTP1位點的基因型。開始抗結(jié)核治療日期，抗結(jié)核治療藥物及其劑量，檢測異煙肼、利福平、吡嗪酰胺三種目前血藥濃度與AT-DILI發(fā)生相關(guān)性較明確的藥物血藥濃度[7～10]。

1.2 方法

1.2.1給藥方案 按照世界衛(wèi)生組織推薦的一線抗結(jié)核治療方案為：異煙肼(INH)、利福平(RFP)、乙胺丁醇(EMB)和吡嗪酰胺(PZA)強化治療2個月，INH+ RFP鞏固治療4個月(2IREP+4IR)方案進行治療。在抗結(jié)核治療開始后7天采集患者外周血，應(yīng)用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)法測定血漿中抗結(jié)核藥物濃度，分析 GSTs基因多態(tài)性與標(biāo)準(zhǔn)結(jié)核治療后抗結(jié)核藥物血藥濃度之間的關(guān)系。

1.2.2試劑與儀器 血液基因組離心柱型DNA提取試劑盒，中國北京天根生化科技有限公司；GSTP1 Taqman SNP 基因分型試劑盒，美國ApliedBpiosystem公司；GSTM1 / GSTT1基因分型試劑盒，美國Thermo Fisher Scientific公司；GSTM1 / GSTT1primer，美國 Invitrogen公司；異煙肼標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格：每支100 mg，批號：100578-200401，中國食品藥品檢定研究院；吡嗪酰胺標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格：每支100 mg，批號：100178-201104，中國食品藥品檢定研究院；利福平標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格：每支100 mg，批號：130496-201403，中國食品藥品檢定研究院；NanoDrop 2000型核酸濃度測定儀，實時定量PCR儀ABI7500，美國Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品；實時熒光定量PCR儀LightCycler?480 II，德國Roche公司；德國Eppendorf公司；Rapid ResolutionZORBAX SB-Aq (3.0*50 mm，1.8 um)，安捷倫公司。

1.2.3基因檢測 ①引物：GSTM1(219 bp)的引物為：Forward：5’-GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC-3’；Reverse：5’-GTTGGGCTCAAATATACGGTGG-3’[11]，GSTT1(257 bp)的引物為：Forward：5’-TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC-3’；Reverse：5’-GGAAAAGGGTACAGACTGGGGA-3’。BCL為陽性內(nèi)參，用來排除假陰性結(jié)果，BCL (154 bp)的引物為：Forward：5’-GCAATTCCGCATTTAATTCATGG-3’；Reverse：5’-GAAACAGGCCACGTAAAGCAAC-3’。② PCR反應(yīng)擴增條件為：95 ℃ 10 min，95 ℃ 5 s，62 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s共38個循環(huán)，設(shè)置溫度改變速率為20 ℃/s。結(jié)凝曲線溫度為：95 ℃ 5 s，65 ℃ 20 s，最后以0.2 ℃/s 速率升溫至98 ℃，實驗方法詳見參考文獻[12]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析處理，符合正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗進行比較；不符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)以M(Q1，Q3)表示，組間比較采用非參數(shù)檢驗統(tǒng)計分析。P< 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料60例患者中男42例(70%)，女18例(30%)，漢族人群58例(96.7%)，藏族2例(3.3%)，年齡17～86歲，體重37～75 kg，BMI 15.37～26.22 kg/m2，異煙肼的血藥濃度為0.25～2.11 μg /ml，利福平0.25～19.75 μg /ml，吡嗪酰胺1.00～63.39 μg /ml。

2.2 患者GSTs檢測基本情況GSTM1基因突變22例，突變頻率為36.7%；GSTT1基因突變27例，基因突變頻率為45.0%；GSTP1基因中，野生型(AA型)37例，雜合型(AG型)22例，純合突變型(GG型)1例，總突變頻率(AG型+GG型)為23例。

2.3 基因分布信息Hardy-weinberg遺傳平衡檢驗Hardy-weinberg遺傳平衡檢驗顯示，GSTM1的基因分布頻率與藥物基因組庫 (PharmGKB)中215名中國人的基因分布頻率滿足Hardy-weinberg遺傳平衡 (P>0.05)；GSTT1的基因分布頻率與藥物基因組庫中445名中國人群的基因分布頻率滿足Hardy-weinberg遺傳平衡(P>0.05)；GSTP1的基因分布頻率與藥物基因組庫中286位中國人群的基因分布相符(P>0.05)。

2.4 方法學(xué)驗證

2.4.1精密度試驗 對異煙肼、吡嗪酰胺、利福平血藥濃度檢測進行了低、中、高藥物濃度(異煙肼、利福平1.0、5.0、40.0 μg/ml；吡嗪酰胺4.0、20.0、160.0 μg/ml)的精密度試驗，批內(nèi)、批間精密度CV值均≤15%滿足要求。

2.4.2穩(wěn)定性試驗 對異煙肼、吡嗪酰胺、利福平血藥濃度檢測低、中、高藥物濃度藥物(異煙肼、利福平1.0、5.0、40.0 μg/ml；吡嗪酰胺4.0、20.0、160.0 μg/ml)的室溫、凍融穩(wěn)定性進行了試驗，相對偏差均<15%，異煙肼、吡嗪酰胺、利福平樣品可在室溫下維持8 h的穩(wěn)定性，樣品凍融3次檢測結(jié)果仍穩(wěn)定。

2.5 各基因型間血藥濃度的比較

2.5.1不同基因型的血藥濃度比較 GSTM1 基因未突變組異煙肼、利福平、吡嗪酰胺血藥濃度與GSTM1突變組相比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；GSTT1 基因未突變組異煙肼、利福平、吡嗪酰胺血藥濃度與GSTT1缺失突變組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；GSTP1 AA組、AG組、GG組異煙肼、利福平、吡嗪酰胺血藥濃度相比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。吡嗪酰胺血藥濃度中位數(shù)GSTP1 AG+GG組為6.032(7.360) μmol/ml，GSTP1 AA組為11.74(21.170) μmol/ml，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05)。見表1。

表1 不同基因型的血藥濃度比較 (μmol/ml)

2.5.2GSTM1&GSTT1不同基因型與異煙肼、利福平、吡嗪酰胺血藥濃度相關(guān)性 GSTM1&GSTT1單突變型/缺失型或雙突變型/缺失型四組間異煙肼、利福平、吡嗪酰胺血藥濃度比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 GSTM1&GSTT1不同基因型的血藥濃度比較 (μmol/ml)

3 討論

GSTs通過催化谷胱甘肽(GSH)與具有親電官能團的底物相互反應(yīng)且促進反應(yīng)產(chǎn)物排出體外發(fā)揮解毒作用[13]，對有毒中間代謝物的形成和解毒有重要影響，其家族GSTM1和GSTT1的基因型是目前國內(nèi)外研究較多的目標(biāo)基因，其與AT-DILI相關(guān)性目前研究仍存在爭議。GSTs基因多態(tài)性與抗結(jié)核藥物性肝損傷的相關(guān)性卻鮮有報道。本次研究的患者異煙肼均采用0.3 g/d的劑量給藥，其平均血藥濃度為0.46 mg/L，高于文獻中的臨界濃度值0.2 mg/L[14]，GSTs會加速異煙肼有毒代謝物轉(zhuǎn)化為極性物質(zhì)從而排出體外，根據(jù)化學(xué)平衡原理，體內(nèi)有毒代謝物減少，則異煙肼轉(zhuǎn)化為有毒代謝物的轉(zhuǎn)化速率也可能會增快，從而間接影響異煙肼的血藥濃度。然而本次實驗的數(shù)據(jù)分析顯示GSTs的突變對異煙肼的血藥濃度無明顯相關(guān)性，從而推測GSTs并非影響異煙肼血藥濃度的主要因素。利福平的有效臨界血藥濃度為0.0625 mg/L[14，15]，本次研究的患者利福平平均血藥濃度為1.57 mg/L，且在GSTs突變組和未突變組之間沒有顯著差異，GSTs酶不是利福平誘導(dǎo)的AT-DILI的主要因素。

吡嗪酰胺的血藥濃度對結(jié)核桿菌的抑制效果有重要作用[16]，同樣也可能對不良反應(yīng)的發(fā)生有影響。本研究結(jié)果顯示GSTP1 rs1695不同基因型的吡嗪酰胺血藥濃度有差異，證明GSTP1的基因多態(tài)性影響吡嗪酰胺血藥濃度，這一發(fā)現(xiàn)在之前的文獻研究中并無報道，為進一步研究GSTs與抗結(jié)核藥物血藥濃度以及AT-DILI相關(guān)性的研究提供了新的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)參考。基于本研究樣本量有限，僅進行了GSTs基因多態(tài)性與異煙肼、利福平、吡嗪酰胺血藥濃度之間的單因素相關(guān)性分析，然而AT-DILI的發(fā)生是一個多因素影響結(jié)果，在今后的研究中會進一步設(shè)立多中心大樣本的研究，可對更多的因素進行探討，建立預(yù)測AT-DILI發(fā)生的模型，為結(jié)核患者的個體化用藥治療提供臨床參考工具。