孔 娜,王新華,孔膠膠,付嘉寧

(1.菏澤學(xué)院 藥學(xué)院，山東 菏澤 274015;2.菏澤醫(yī)學(xué)專(zhuān)科學(xué)校，山東 菏澤 274000)

【研究意義】傳染性法氏囊病(IBD)傳統(tǒng)疫苗存在免疫失敗等多種問(wèn)題，VP2是傳染性法氏囊病病毒(IBDV)的主要結(jié)構(gòu)蛋白和保護(hù)性抗原[1]，可采用多種表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出具有一定免疫原性的VP2蛋白[1-2]，但需要通過(guò)合適的佐劑提高免疫效果。【前人研究進(jìn)展】mIL-18是一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)因子[3]，能誘導(dǎo)生成IFN-γ，還可以激活能清理病毒的CD8+T細(xì)胞[4]和發(fā)揮協(xié)調(diào)機(jī)體體液免疫和細(xì)胞免疫功能的CD4+T細(xì)胞[5-6]?？啄萚7]將雙表達(dá)蛋白VP2-IL-18免疫雛雞，能促進(jìn)CD4+T、CD8+T細(xì)胞的增殖和抗體水平的增加，還可以產(chǎn)生90 %保護(hù)率。研究表明IL-18對(duì)機(jī)體的免疫反應(yīng)除了有增強(qiáng)作用，還有減弱作用，這主要取決于其劑量[8-9]。【本研究切入點(diǎn)】因此本試驗(yàn)采用不同劑量雙表達(dá)蛋白VP2-IL-18免疫雞，并對(duì)他們的免疫原性進(jìn)行了比較。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】摸索VP2-IL-18的最佳免疫增強(qiáng)劑量，為研制新型高效的IBD基因工程疫苗提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1日齡SPF雞購(gòu)自山東濟(jì)南賽斯有限公司；FITC標(biāo)記的鼠抗雞CD4單抗和R-PE標(biāo)記的鼠抗雞CD8а單抗購(gòu)自北京博蕾德生物科技有限公司；IBDV ELISA抗體檢測(cè)試劑盒購(gòu)自IDEX公司；vvIBDV-GX8/99株為山東農(nóng)業(yè)大學(xué)朱瑞良教授從廣西收集的IBDV強(qiáng)毒株，毒價(jià)為105.5LD50/0.2 mL。

1.2 雙表達(dá)蛋白VP2-IL-18的制備

將雞IL-18成熟蛋白基因(mChIL-18) 先插入進(jìn)雙表達(dá)載體pFastBacTMdual的PPH下游，構(gòu)建重組質(zhì)粒pFastBacTMdual-IL-18，再將IBDV VP2基因插入pFastBacTMdual-IL-18的 PP10下游，構(gòu)建重組質(zhì)粒pFastBacTMdual-VP2-IL-18。然后利用Bac-to-Bac系統(tǒng)表達(dá)雙表達(dá)蛋白VP2-IL-18[6]，并制備成油乳制劑。

1.3 動(dòng)物分組免疫

120只14日齡SPF雞隨機(jī)分成6組，每組20只，選用頸部皮下多點(diǎn)注射。Ⅰ組注射含100 μg VP2-IL-18的油乳制劑；Ⅱ組注射含150 μg VP2-IL-18的油乳制劑；Ⅲ組注射含200 μg VP2-IL-18的油乳制劑；Ⅳ組注射含250 μg VP2-IL-18的油乳制劑；Ⅴ組注射含300 μg VP2-IL-18的油乳制劑；Ⅵ組為陰性對(duì)照組。所有雞均14日齡一免，28日齡二免。

1.4 ELISA抗體檢測(cè)

分別于一免后第0、7、14、21、28和35天每組隨機(jī)抽取8只，采集翅靜脈非抗凝血分離血清，利用IBDV ELISA抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)ELISA抗體滴度。

1.5 CD4+T、CD8+T細(xì)胞增殖反應(yīng)

分別于一免后第0、7、14、21、28和35天每組隨機(jī)抽取8只，采集翅靜脈抗凝血分離外周血淋巴細(xì)胞。利用FITC標(biāo)記的鼠抗雞CD4單抗和R-PE標(biāo)記的鼠抗雞CD8а單抗，通過(guò)流氏細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+T和CD8+T淋巴細(xì)胞的增殖情況。

1.6 攻毒試驗(yàn)

一免后第35天經(jīng)點(diǎn)眼滴鼻等途徑使用vvIBDV-Gx8/99毒株攻擊，攻毒劑量為每只100 LD50/0.2 mL，攻毒后第6天記錄各組死亡數(shù)，然后全部撲殺剖檢觀察病理變化。

1.7 數(shù)據(jù)分析

所得數(shù)據(jù)用EXCEL和SPSS進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 ELISA抗體檢測(cè)

各試驗(yàn)組雖能提高抗體水平(圖1)，但需要二免才能產(chǎn)生更高水平抗體。Ⅲ組在一免后第7天與Ⅳ組和Ⅴ組差異不顯著(P>0.05)，但從一免后第14天開(kāi)始差異顯著(P<0.05)，且Ⅳ組和Ⅴ組比Ⅰ組和Ⅱ組抗體滴度小。

2.2 CD4+T細(xì)胞增殖反應(yīng)結(jié)果

各試驗(yàn)組雖都能促進(jìn)CD4+T細(xì)胞增殖(圖2)，但只有Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組在加強(qiáng)免疫后才能保持持續(xù)性上升趨勢(shì)；Ⅳ組和Ⅴ組二免后仍呈下降趨勢(shì)。Ⅲ組增殖水平最高，在一免后7 d起均與其他試驗(yàn)組和對(duì)照組差異顯著 (P<0.05)。

2.3 CD8+T細(xì)胞增殖反應(yīng)結(jié)果

各試驗(yàn)組雖都能促進(jìn)CD8+T細(xì)胞增殖(圖3)，但一免后7 d又呈下降趨勢(shì)；只有Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組在加強(qiáng)免疫后才能保持緩慢上升趨勢(shì)；Ⅳ組和Ⅴ組二免后仍呈下降趨勢(shì)。Ⅲ組增殖水平最高，在一免后7 d起與其他組差異越來(lái)越顯著 (P<0.05)。

2.4 攻毒保護(hù)率

Ⅲ組保護(hù)率最高為90 %(表1)，且無(wú)1只死亡；Ⅰ組和Ⅳ組保護(hù)率均為70 %，但Ⅰ組死亡率比Ⅳ組高；Ⅱ組和Ⅴ組死亡率相同，但Ⅱ組保護(hù)率比Ⅴ組高；Ⅶ組全部感染。

表1 vvIBDV-Gx8/99毒株攻擊后各組的死亡數(shù)、感染數(shù)和保護(hù)率

3 討 論

IL-18對(duì)機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)具有雙向作用[10]，即增強(qiáng)和減弱兩方面[11]。所謂免疫增強(qiáng)是指用人為措施，全面或選擇性提高機(jī)體的免疫功能，以達(dá)到治療疾病的目的，是一種主動(dòng)免疫過(guò)程[12]。關(guān)于免疫減弱前人研究很少。IL-18可促進(jìn)已被刺激的T細(xì)胞的增殖及增加培養(yǎng)的T細(xì)胞的IL-2的產(chǎn)生[13]，但I(xiàn)L-2對(duì)免疫應(yīng)答具有增強(qiáng)和抑制的雙向作用, 因此對(duì)維持機(jī)體免疫平衡具有非常重要的作用,在臨床上用于病毒感染、免疫缺陷病及自身免疫病的治療[14-15]。還有報(bào)道顯示IL-18長(zhǎng)期而過(guò)量的使用可使動(dòng)物產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用[16],如消瘦和消化道出血。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示Ⅲ組ELISA抗體水平最高，從一免后與Ⅳ組和Ⅴ組第14天開(kāi)始差異顯著(P<0.05)，且Ⅳ組和Ⅴ組比Ⅰ組和Ⅱ組抗體滴度小。各免疫組都能促進(jìn)CD4+T增殖，且Ⅲ組增殖水平最高，在一免后7 d起與其他組差異越來(lái)越顯著 (P<0.05)，Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組在加強(qiáng)免疫后能保持持續(xù)性上升趨勢(shì)，Ⅳ組和Ⅴ組卻呈下降趨勢(shì)。各免疫組雖均能促進(jìn)CD8+T增殖，但Ⅲ組增殖水平最高，在一免后7 d起與其他組差異越來(lái)越顯著 (P<0.05)，且Ⅳ組和Ⅴ組比Ⅰ組和Ⅱ組增殖幅度小。攻毒試驗(yàn)結(jié)果顯示，Ⅲ組保護(hù)率最高為90 %，Ⅱ組為75 %，Ⅰ組和Ⅳ組保護(hù)率均為70 %，Ⅴ組為60 %。以上結(jié)果表明VP2-IL-18具有良好的免疫原性，且200 μg為最佳免疫劑量，高劑量效果反而不如低劑量，即不呈現(xiàn)高劑量依賴。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)不同劑量雙表達(dá)蛋白VP2-IL-18的免疫原性進(jìn)行比較，摸索VP2-IL-18的最佳免疫增強(qiáng)劑量為200 μg，為研制高效的IBD基因工程疫苗提供科學(xué)依據(jù)；而高劑量VP2-IL-18卻發(fā)揮免疫減弱作用，其作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究，進(jìn)而用于自身免疫病的治療。