閻 華，王 會，湯尚文，于 博，黃升謀，李云捷，吳進菊，李玉奇

(1.湖北文理學院食品科學技術學院，湖北 襄陽 441053；2.湖北省食品配料工程技術研究中心，湖北 襄陽 441053；3.襄陽市中心醫(yī)院，湖北 襄陽 441053)

【研究意義】黃顙魚屬于輻鰭魚綱，鲇形目，鲿科，是一種常見的淡水魚，是食用魚中經(jīng)濟價值較高的魚類。其養(yǎng)殖分布廣，產(chǎn)量高，運動力強。肉嫩，味美，少刺多脂。湖北省漢川市已經(jīng)具有相當規(guī)模的黃顙魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)，并在不斷地擴大[1]。但是當?shù)攸S顙魚養(yǎng)殖戶為了追求更多經(jīng)濟效益，在其養(yǎng)殖過程中采用過度密度養(yǎng)殖，并且投食高蛋白飼料，引發(fā)黃顙魚生長水環(huán)境急劇惡化。而且許多養(yǎng)殖戶忽視了黃顙魚預防疾病措施，導致其傳染性疾病趨向嚴重，發(fā)病率有的養(yǎng)殖場可以達到75%以上，造成大量魚體死亡，經(jīng)濟效益受損[2]。在2019年6-9月，湖北省漢川市的幾個養(yǎng)殖場同時爆發(fā)黃顙魚疾病，均表現(xiàn)為體表潰瘍，魚體口鼻充血、流血，對魚體解剖，明顯發(fā)現(xiàn)肝臟、脾臟、腎臟腫大，并伴有血斑。本研究室對其病原菌分離鑒定后發(fā)現(xiàn)，是屬于銅綠假單胞菌的急性感染。銅綠假單胞菌廣泛存在于自然界，是一種革蘭氏陰性菌，是水產(chǎn)養(yǎng)殖主要的條件致病菌。銅綠假單胞菌感染黃顙魚后，會導致寄主產(chǎn)生腹水病、腐皮病以及敗血癥。銅綠假單胞菌的溶血性毒素致病力強，可以引發(fā)寄主細胞膜裂解[3]。該病原菌也可以引發(fā)人體產(chǎn)生疾病，可以引起皮膚病，腸炎病和呼吸道疾病，屬于人獸共患病原菌。魚體的抗菌肽在其免疫系統(tǒng)中防御病原體發(fā)揮著重要的作用，眾多科學家發(fā)現(xiàn)，抗菌肽特征為強堿性、對熱較為穩(wěn)定和具有廣譜抗菌性能等[4]。魚體內(nèi)發(fā)育成熟的抗菌肽可以抵抗外界細菌和真菌的感染?！厩叭搜芯窟M展】前人研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽的作用機制是結合到細菌或者真菌的細胞膜，引發(fā)細胞膜形成跨膜離子通道，使得細菌或者真菌細胞內(nèi)容物破裂，引發(fā)細菌或者真菌死亡。不同魚類生物的抗菌肽種類不盡相同，產(chǎn)生的位置也相同，但是大部分存在于肝臟，腎臟，皮膚、胃黏膜和小腸細胞等部位?？咕腜iscidin擁有25個氨基酸，是雙親性a螺旋構造，不同種類抗菌肽氨基酸序列比對表明其序列同源性不是很高。該族抗菌肽基因結構大致相同，一般存在4個外顯子和3個內(nèi)含子。但是羅非魚和石斑魚等，也存在不同的基因結構，其他形式的基因結構，如3個外顯子和2個內(nèi)含子或者 5個外顯子和4個內(nèi)含子等結構[5]。陳大瑋等研究了棕點石斑魚的抗菌肽piscidin，并在原核生物中克隆和表達?？咕腜iscidin在魚體的不同部位可以形成不同的異構體，主要表達部位為肝臟，腎臟，鰓、皮膚和腸[6]。多種外界刺激病原體，如G+、G-細菌，病毒、寄生蟲等，均可誘導魚體生物的抗菌肽piscidin抗菌肽的特異性表達。迄今發(fā)現(xiàn)，抗菌肽piscidin具有廣譜抗菌性，尤其對鏈球菌、假單胞菌、弧菌等具有良好效果[7]?！颈狙芯壳腥朦c】本研究對湖北省漢川市同旺養(yǎng)殖場患病黃顙魚的病原菌進行分離鑒定，在此基礎上，健康黃顙魚腹腔注射該病原菌，銅綠假單胞菌PA-5感染以后，采用實時熒光定量PCR的技術探討菌肽基因PC1/PC2/PC3在黃顙魚肝臟，腎臟以及表皮組織中的不同表達特征。【擬解決的關鍵問題】此研究為分析黃顙魚抗菌肽在對抗細菌性感染產(chǎn)生和變化的機理提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器和試劑

HZP-25型恒溫振蕩培養(yǎng)箱(上海躍進醫(yī)療器械有限公司)、BKQ-B50型全自動高壓蒸汽滅菌鍋(濟南來寶醫(yī)療器械有限公司)、KENTON-101型電熱鼓風干燥箱(上?？岛憧茖W儀器有限公司)、SJ-56型超凈工作臺(蘇州潔凈設備有限公司)、T3型紫外可見分光光度計(上海一鋪儀器有限公司)、VITEK-32型全自動微生物分析鑒定儀(梅里埃公司)、RE-200型低溫冰箱(青島海爾電器有限公司)、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、LB 培養(yǎng)基和生理鹽水，DNA提取試劑盒(北京華康生物技術有限公司)。PCR反應試劑盒(大連寶生物工程有限公司)。MINIAMP-1型PCR儀器(美國貝登儀器公司)。DNA分子量標準物(上海啟發(fā)試驗試劑有限公司)。Trizol試劑盒(北京賽英生物科技有限公司)。反轉錄試劑盒(北京興東生物工程公司)。SYBR Green PCR Master Mix試劑盒(大連寶生物工程有限公司)。BTK-3型熒光定量PCR儀(無錫百泰克生物技術有限公司)。

1.2 黃顙魚致病菌的分離與鑒定

1.2.1 患病黃顙魚的獲取及其致病菌的分離 患病黃顙魚從湖北省漢川市同旺養(yǎng)殖場獲得，具有典型敗血癥特征，主要表現(xiàn)為魚體反應遲鈍，攝食少或者不攝食，口鼻充血，皮膚表面有斑點出血。對這些患病黃顙魚解剖后，發(fā)現(xiàn)其肝臟和腎臟腫大，有點狀出血，腸道部位也有充血。實驗室無菌條件下解剖發(fā)病黃顙魚，挑取出肝臟后，用無菌研缽快速勻漿。然后把勻漿稀釋成不同倍數(shù)，分別移液取用勻漿10 mL，均勻涂布到麥康凱瓊脂平板上，30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，肉眼觀察菌落生長形態(tài)。挑取優(yōu)勢菌群菌落，進行劃線培養(yǎng)，培養(yǎng)數(shù)次后，挑取菌落形態(tài)較為一致單菌落進行低溫保藏，作為后續(xù)試驗用菌株。

1.2.2 致病菌菌株的生理生化鑒定 革蘭氏染色是在實驗室無菌條件下開展，將菌株用接種環(huán)均勻涂布到滴有生理鹽水的載玻片上，高溫干燥后使用酒精燈固定，固定后放置結晶紫染液中初染1 min，而后在碘液中染色1 min，隨后滴加乙醇溶液進行脫色30 s，直到載玻片表面無紫色液體，最后在番紅染液中染色1 min，干燥后使用顯微鏡進行觀察。生理生化特征使用VITEK-32全自動微生物分析鑒定儀進行操作，革蘭陰性菌鑒定板進行操作，試驗完成后進行結果分析。

1.2.3 致病菌菌株的分子生物學鑒定 致病菌菌株DNA的制備按照DNA提取試劑盒說明書進行操作。致病菌菌株多重PCR包括兩對引物(大連寶生物工程有限公司)，具體見表1。PCR反應體系(25 μL)：10.0 μLTaqmaster mixture，0.8 μL gyrB引物，0.5 μL 16srRNA引物和1.0 μL提取DNA，余量為ddH2O[8]。PCR擴增過程：預變性92 ℃，5 min。93 ℃，30 s，58 ℃，45 s，70 ℃，30 s，循環(huán)30周期。最后70 ℃，延伸10 min。擴增完成的DNA片段取用8.0 μL 放置在2%瓊脂糖凝膠上水平電泳，電泳過程中加入1×TAE緩沖液(0.04 mol/L Tris，0.02 mol/L醋酸，0.002 mol/L Na2EDTA)，電泳電壓100 V，電泳時間45 min。電泳完成后使用1 μL溴化乙錠染色30 min，紫外燈進行拍照?；虼笮”葘藴势肥?00個堿基對DNA梯度標記物。擴增完成的DNA片段經(jīng)過純化連接入pMD18-T載體，挑選陽性克隆進行堿基序列測序。

表1 致病菌菌株鑒定所用引物序列和目標基因

1.3 銅綠假單胞菌PA-5侵染健康黃顙魚后其抗菌肽基因的表達影響

1.3.1 健康黃顙魚的獲取 從華中農(nóng)業(yè)大學水產(chǎn)研究院購買外觀健康、大小較為一致的黃顙魚，魚體質量大約為(150±5)g、體長大約為(30±1)cm。魚塘養(yǎng)殖1周后，飲食均正常的魚體進行接種試驗，試驗魚隨機分配，產(chǎn)生兩個處理組：試驗組和對照組，每組均設3個平行，每個平行50尾，共計300尾。

1.3.2 黃顙魚的病原菌侵染和樣品收集 根據(jù)預試驗，銅綠假單胞菌PA-5感染黃顙魚的最適菌懸液濃度為3.0×106cfu/mL。將恒溫培養(yǎng)獲得的銅綠假單胞菌PA-5以0.65%無菌生理鹽水進行洗脫，并稀釋為3.0×106cfu/mL。采用黃顙魚腹腔注射方式，注射前魚體用100 mg/L丁香酚局部麻醉，試驗組每尾注入0.2 mL菌懸液，對照組注入0.2 mL無菌生理鹽水。注射完成后0，12，24，36，48，60，72，84，96 h，各個時間點各個平行取3尾魚，解剖后收集魚體肝臟，腎臟和表皮組織。置于-80 ℃ 液氮中保存，作為后續(xù)抗菌肽基因的表達影響研究樣品。

1.3.3 樣品的RNA提取及cDNA的反轉錄合成 解凍后的肝臟，腎臟和表皮組織使用 Trizol試劑盒，按照說明書方法提取總RNA。提取獲得的RNA使用1%瓊脂糖凝膠水平電泳檢測其總RNA的純度，紫外燈下觀察總RNA濃度。然后使用反轉錄試劑盒，按照說明書方法進行反轉錄，樣品總RNA溶液加入0.5 μL DNA-Eraser，隨后加入反轉錄復合物和引物2.0 μL，用ddH2O補足反應溶液10.0 μL，反轉錄反應條件：37 ℃，15 min，85 ℃，5 s。反轉錄后的cDNA樣品4 ℃保存，作為后續(xù)研究樣品。

1.3.4 實時熒光定量PCR分析 實時熒光定量PCR分析是使用SYBR Green PCR Master Mix試劑盒，按照產(chǎn)品說明書方法進行操作，引物(大連寶生物工程有限公司)具體見表2。qPCR反應溶液(25.0 μL)：SYBR Green PCR Mix溶液 12.5 μL，PC1/PC2/PC3引物溶液(10 μmol/L)各1.0 μL，DNA模板2.0 μL，余量為雙蒸水。擴增條件為：預變性，95 ℃，30 s。95 ℃，5 s；60 ℃，30 s，循環(huán)40周期；60 ℃下實時采集反應體系中的熒光信號。

表2 黃顙魚抗菌肽相關基因實時熒光定量PCR所使用的引物

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

所有數(shù)據(jù)均為平均值±標準差。根據(jù)二分法進行統(tǒng)計，目的基因的相對表達量差異采用SPSS18.0軟件進行分析[9]，并使用t檢驗法對其差異進行顯著性分析，P<0.05代表差異顯著。

2 結果與分析

2.1 致病菌菌落形態(tài)和菌株特征

采用劃線純化平板培養(yǎng)的方法從患病黃顙魚的肝臟樣品分離得到1株菌落形態(tài)較為一致的菌株，命名為PA-5。麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上30 ℃培養(yǎng)24 h后，菌落呈圓形，邊緣較為光滑濕潤，中央稍微隆起，半透明，灰綠色具體見圖1-A。革蘭氏染色后PA-5為革蘭氏陰性細菌，顯微鏡觀察為紅色，長棒狀直的或者彎的桿菌，長度約2.0 μm，寬度約0.6 μm，細胞分散，單個存在，可以運動，具體見圖1-B。

圖1 患病黃顙魚的肝臟中分離的致病菌PA-5菌落形態(tài)(A)和菌株特征(B)

2.2 致病菌菌株的生理生化鑒定

致病菌菌株PA-5，使用VITEK-32 全自動微生物分析鑒定儀，革蘭氏陰性鑒定板進行操作，其對葡萄糖，伯膠糖，單奶糖和甘露糖靈敏，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，表明該菌株能夠利用這些物質，合成體內(nèi)所需物質。對麥芽糖，葡聚糖，棉子糖，乳糖和蔗糖鈍化，產(chǎn)氣不產(chǎn)酸，表明該菌株不能夠利用這些物質，不能夠合成體內(nèi)所需物質。綜合生理生化特性，鑒定結果為銅綠假單胞菌，生理和生化特性具體見表3。

表3 致病菌株PA-5生理生化特性

2.3 致病菌菌株的分子生物學鑒定

如圖2所示，使用多重PCR技術進行操作后，證實患病黃顙魚分離得到的致病菌PA-5攜帶有969 bp的gyrB基因，同時攜帶有1380 bp的16srRNA基因。將測序完成的DNA片段經(jīng)過基因序列比對，該菌與NCBI數(shù)據(jù)庫中的銅綠假單胞菌的親緣關系最為接近，因此鑒定致病菌PA-5為銅綠假單胞菌。

M：DNA標準品，1：致病菌PA-5，2：肝臟感染菌

2.4 銅綠假單胞菌PA-5侵染健康黃顙魚PC1抗菌肽基因表達的影響

黃顙魚腹腔注射銅綠假單胞菌PA-5后，PC1抗菌肽基因在肝臟組織的表達量相對于0 h均出現(xiàn)不同程度上調，其中24,36與 差異顯著(P<0.05)，感染后24 h表達量最高(圖3-1)。PC1抗菌肽基因在腎臟組織的表達量相對于0 h均出現(xiàn)不同程度上調，其中24,36與0 h差異顯著(P<0.05)，感染后24 h表達量最高(圖3-2)。PC1抗菌肽基因在表皮組織的表達量相對于0 h均出現(xiàn)不同程度上調，其中36,48與0 h差異顯著(P<0.05)，感染后36 h表達量最高(圖3-3)。

* 顯著性差異(P<0.05)，下同

2.5 銅綠假單胞菌PA-5侵染健康黃顙魚后PC2抗菌肽基因的表達影響

黃顙魚腹腔注射銅綠假單胞菌PA-5后，PC2抗菌肽基因在肝臟組織的表達量相對于0 h均出現(xiàn)不同程度上調，其中24,36與0 h差異顯著(P<0.05)，感染后24 h表達量最高(圖4-1)。PC2抗菌肽基因在腎臟組織的表達量相對于0 h均出現(xiàn)不同程度上調，其中24,36與0 h差異顯著(P<0.05)，感染后24 h表達量最高(圖4-2)。PC2抗菌肽基因在表皮組織的表達量相對于0 h均出現(xiàn)不同程度上調，其中36,48與0 h差異顯著(P<0.05)，感染后36 h表達量最高(圖4-3)。

圖4 銅綠假單胞菌PA-5侵染健康黃顙魚后PC2抗菌肽基因表達的影響

2.6 銅綠假單胞菌PA-5侵染健康黃顙魚后PC3抗菌肽基因的表達影響

黃顙魚腹腔注射銅綠假單胞菌PA-5后，PC3抗菌肽基因在肝臟組織的表達量相對于0 h均出現(xiàn)不同程度上調，其中24,36 與0 h差異顯著(P<0.05)，感染后24 h表達量最高(圖5-1)。PC3抗菌肽基因在腎臟組織的表達量相對于0 h均出現(xiàn)不同程度上調，其中24,36與0 h差異顯著(P<0.05)，感染后24 h表達量最高(圖5-2)。PC3抗菌肽基因在表皮組織的表達量相對于0 h均出現(xiàn)不同程度上調，其中36,48與0 h差異顯著(P<0.05)，感染后36 h表達量最高(圖5-3)。

圖5 銅綠假單胞菌PA-5侵染健康黃顙魚后PC3抗菌肽基因的表達

3 討 論

銅綠假單胞菌屬于變形菌門，γ-變形菌綱，假單胞菌目，假單胞菌科，假單胞菌屬。其存在的水環(huán)境條件比較惡劣，從而引發(fā)魚類及其他水產(chǎn)動物產(chǎn)生感染，并產(chǎn)生疾病。該致病菌感染黃顙魚后，會引發(fā)集體感染，引發(fā)群體性事件，并產(chǎn)生較強的并發(fā)癥。銅綠假單胞菌作為一種條件致病菌，發(fā)病機制較為復雜，但是水環(huán)境條件的惡化有著至關重要的關系。眾多科學家研究表明，其可以感染鯉魚、黃顙魚、河鱸、鯽魚等多種經(jīng)濟魚類。銅綠假單胞菌的常規(guī)鑒定方法中，常規(guī)的生長特性和生理生化特性較為精準，是目前研究中常用的方法。同時采用16SrDNA和其他特性基因為目的基因的多重PCR方法對銅綠假單胞菌進行鑒定也同樣存在良好的應用價值[5]。本研究從湖北省漢川市同旺養(yǎng)殖場的染病黃顙魚肝臟中取樣，使用劃線分離純化技術獲得致病菌菌株，在營養(yǎng)瓊脂平板上培養(yǎng)后，生長速度快，形態(tài)較為均一，從而命名為PA-5。使用VITEK-32全自動微生物分析儀進行操作后，獲得其生長特性和生理生化特征，其具有銅綠假單胞菌基本特征。也對養(yǎng)殖場的染病黃顙魚進行了多重PCR技術測定，結果表明，銅綠假單胞菌PA-5同時攜帶有16SrRNA和gyrB基因。表明菌株PA-5具有銅綠假單胞菌序列特征以及溶血性病原的特征。人工注射菌株PA-5到健康黃顙魚魚體中，其能侵染寄主的腎臟、肝臟和血液等，引發(fā)其廣泛性出血、全身性腫脹、顆粒樣病變、大量組織壞死和紅細胞裂解。癥狀與銅綠假單胞菌自然病例相似，分離得到的菌株與接種菌株相同，菌落形態(tài)也相似。

水產(chǎn)動物受到病原菌感染后，機體會迅速產(chǎn)生免疫應答，有助于生成體內(nèi)免疫因子以消除病原菌。魚類生物體中產(chǎn)生了抗菌肽就是重要的免疫因子，可以分布在不同的組織器官?？咕目梢园l(fā)揮多種生物學功能，但是其主要的功能是對病原菌產(chǎn)生拮抗作用，可以抑制細菌，寄生蟲和病毒等[10]。魚類動物的生長環(huán)境較為復雜，病原菌種類較多，抗菌肽的數(shù)量也較多，現(xiàn)在已經(jīng)明確的有150余種。魚源抗菌肽除了具有抗菌肽的共有特性，包括廣譜抗菌、免疫調控，還有種屬特異性，從而保證不同魚類應對復雜水體環(huán)境和不同病原體[11]。因此，魚類生物的抗菌肽在疾病的預防和治療等方面具有優(yōu)良的應用前景，可以用于制備疫苗和抗生素。眾多前人科學研究揭示，魚類動物的肝臟組織和腎臟組織可以產(chǎn)生抗菌肽之外，皮膚腺體也能夠合成多種抗菌肽，促進魚類生物有效地防御病原體[12]。本研究將分離得到的銅綠假單胞菌PA-5腹腔注射侵染健康黃顙魚，分別在侵染后0～96 h隨機選取黃顙魚解剖并進行取樣檢測。結果揭示，黃顙魚肝臟組織中抗菌肽基因PC1/PC2/PC3的相對表達量受侵染24和36 h顯著高于對照組；黃顙魚腎臟組織中抗菌肽基因PC1/PC2/PC3的相對表達量受侵染24和36 h顯著高于對照組；而在黃顙魚皮膚組織中，抗菌肽基因PC1/PC2/PC3的相對表達量受侵染36和48 h時顯著高于對照組。從而說明黃顙魚抗菌肽基因PC1/PC2/PC3在肝臟和腎臟中響應病原菌的感染比在表皮組織中更加迅速，這或許就是腸道病原菌的通用特點。所以抗菌肽在內(nèi)臟組織的特異表達對啟動魚體天然免疫應答抵抗病原菌感染具有更加積極作用。健康黃顙魚注射銅綠假單胞菌PA-5后，能夠促進其全身性抗菌肽基因表達量上調，證實黃顙魚免疫系統(tǒng)可以快速應答于病原體，其抗菌肽在黃顙魚免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要的作用。從而為揭示抗菌肽在病原體感染魚體生物的響應機制提供了理論依據(jù)和試驗數(shù)據(jù)基礎。

4 結 論

湖北省漢川市同旺養(yǎng)殖場患病黃顙魚的病原菌種類得到分離和鑒定并分析其影響寄主抗菌肽基因表達的特點。以患病黃顙魚肝臟作為樣本，使用劃線培養(yǎng)的技術，分離得到病原菌PA-5。對病原菌進行革蘭氏染色和顯微鏡觀察，其形態(tài)為長棒狀，革蘭氏染色為陰性。再進行VITEK-32全自動微生物分析鑒定儀操作，該病原菌對D-葡糖酸、丙二酸和葡萄糖等反應靈敏，對黏菌素、七葉苷和阿拉伯糖等反應遲鈍。采用多重PCR技術對該菌16SrRNA和gyrB基因序列分析后發(fā)現(xiàn)，該菌與銅綠假單胞菌的特征序列相似，親緣關系較為接近，綜合后鑒定該病原菌為銅綠假單胞菌。同時以該病原菌為樣本，分析其感染黃顙魚后，對寄主抗菌肽基因PC1/PC2/PC3的表達影響。在黃顙魚的腹腔中注射3.0×106cfu/mL銅綠假單胞菌PA-5，侵染完成后0～96 h分別解剖獲取黃顙魚的肝臟，腎臟以及表皮組織。然后利用Trizol試劑盒操作獲取黃顙魚總RNA，反轉錄合成cDNA后應用實時熒光定量PCR技術分析黃顙魚抗菌肽基因PC1/PC2/PC3基因表達變化特點。銅綠假單胞菌PA-5侵染黃顙魚后，寄主肝臟組織中的抗菌肽基因PC1/PC2/PC3相對表達量24，36 h較高，與對照組比較顯著(P<0.05)；寄主腎臟組織中的抗菌肽基因PC1/PC2/PC3相對表達量24，36 h較高，與對照組比較顯著(P<0.05)；寄主表皮組織中的抗菌肽基因PC1/PC2/PC3相對表達量36，48 h較高，與對照組比較顯著(P<0.05)。寄主肝臟組織，腎臟組織，表皮組織抗菌肽基因的表達均快速增加，但是肝臟組織和腎臟組織反應時間早于表皮組織。因此，銅綠假單胞菌PA-5是湖北省漢川市同旺養(yǎng)殖場黃顙魚的主要病原體，其感染黃顙魚后，寄主抗菌肽基因PC1/PC2/PC3會積極響應，這些基因的大量表達有助于魚體天然免疫應答，有助于抵抗病原微生物的感染。