許景偉，樊 麗，岳麗玲，許瀚文

(1. 齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，黑龍江 齊齊哈爾 161041；2. 齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥科學(xué)研究院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；3. 天津醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，天津 300270)

甲狀腺癌是近年來頭頸部及內(nèi)分泌系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，據(jù)2017年全球數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，甲狀腺癌位居女性惡性腫瘤的第五位[1]，其中未分化甲狀腺癌雖然只占甲狀腺癌的2%左右，但其惡性度極高，生長快、易轉(zhuǎn)移、預(yù)后差[2]。目前臨床上對未分化甲狀腺癌尚無有效的治療方法，是臨床亟待解決的問題。斑蝥是芫青科昆蟲南方大斑蝥MylabrisphalerataPallas或黃黑小斑蝥MylabriscichoriiLinnaeus的干燥蟲體[3]。2000年前，斑蝥素就已經(jīng)應(yīng)用于抗腫瘤治療，但是其對泌尿系統(tǒng)有明顯毒副作用。去甲斑蝥素是在斑蝥素基礎(chǔ)上去掉1,2位甲基，保留了其抗腫瘤及提高白細(xì)胞活性的作用，且可明顯減輕對泌尿系統(tǒng)的毒性損傷作用[4]。本研究觀察了去甲斑蝥素對人未分化甲狀腺癌FRO細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響及可能作用機(jī)制，旨在為其臨床應(yīng)用提供更多實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1材料 人未分化甲狀腺癌FRO細(xì)胞(中科院上海生命研究院)；去甲斑蝥素 (貴州金橋藥業(yè)有限公司)；DMEM培養(yǎng)基(美國Sigma公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；CCK-8試劑盒、二甲亞砜(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；E-鈣黏蛋白(E-cadherin)基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)兔抗人一抗和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(美國ABclonal公司)；Transwell小室(美國Corning公司)；細(xì)胞周期試劑盒(四正柏生物公司)；Turnel細(xì)胞凋亡試劑盒(碧云天生物科技有限公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇甲狀腺癌FRO細(xì)胞，并接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，在37 ℃、 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長后每2 d換液1次，生長達(dá)到90%孔底面積時(shí)經(jīng)胰酶消化傳代用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3細(xì)胞活性檢測 收集對數(shù)生長期的FRO細(xì)胞，加到96孔培養(yǎng)板中(5 000個/100 μL/孔)；37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至細(xì)胞長滿孔底后吸出培養(yǎng)基，加入終濃度分別為2.5,5,10,20,40,80 μg/mL的去甲斑蝥素培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每個濃度設(shè)5個平行孔，分別于培養(yǎng)12 h、24 h、48 h取出培養(yǎng)板，用含10 μL CCK-8溶液的無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4 h，酶標(biāo)儀測定450 nm處每孔的吸光度(OD)值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率[(對照孔A-實(shí)驗(yàn)孔A)/(對照孔A-空白孔A)×100%]。

1.4細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力 取對數(shù)生長期FRO細(xì)胞，分為空白組(只加培養(yǎng)基)、10 μg/mL去甲斑蝥素組、20 μg/mL去甲斑蝥素組、40 μg/mL去甲斑蝥素組，分組處理后，置于37 ℃、5% CO2箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，胰酶消化各組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個/mL并接種于6孔板內(nèi)，每孔加入2 mL,至細(xì)胞達(dá)80%融合，在6孔板底板部位用滅菌的100 μL Tip頭做一字劃痕并做標(biāo)記，洗凈脫落細(xì)胞及細(xì)胞碎片，用無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。分別于0 h、12 h和24 h后在倒置顯微鏡下觀察劃痕區(qū)域細(xì)胞的遷移愈合情況并拍照，使用 Image J軟件計(jì)算細(xì)胞的遷移面積，用愈合率代表遷移能力。愈合率(%)=(0 h劃痕面積-12 h/24 h劃痕面積)/0 h劃痕面積×100%。

1.5Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) Matrigel于4 ℃過夜融化，按Matrigel膠：無血清培養(yǎng)基1∶8的比例進(jìn)行稀釋，取稀釋膠100 μL加入小室上室，置于培養(yǎng)箱中聚合凝固[5]。取對數(shù)生長期FRO細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個/mL并接種于6孔板內(nèi)，每孔加入2 mL,按1.4的方法進(jìn)行分組處理，培養(yǎng)24 h后，常規(guī)消化后用無血清培養(yǎng)基重懸并調(diào)整各組細(xì)胞密度為2×106個/mL,取100 μL細(xì)胞懸液輕輕加人Transwell小室上室，下室中加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基700 μL，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄上室培養(yǎng)基，PBS洗2次，棉簽擦去上室的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定30 min，晾干后用0.1%結(jié)晶紫染色30 min，晾干，在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。隨機(jī)選取5個高倍鏡視野/孔，計(jì)數(shù)穿過小室底膜的細(xì)胞數(shù)，取平均值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞周期檢測 取對數(shù)生長期的FRO細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個/mL并接種于6孔板內(nèi)，每孔加入2 mL,按1.4的方法進(jìn)行分組處理，培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS漂洗細(xì)胞2次，制成單細(xì)胞懸液，滴加預(yù)冷的無水乙醇，至終濃度為70%，4 ℃固定過夜；固定后的細(xì)胞經(jīng)PBS漂洗2次，加入400 μL PI混勻，避光4 ℃染色30 min，流式細(xì)胞儀檢測分析細(xì)胞周期。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7TUNEL法細(xì)胞凋亡檢測 取對數(shù)生長期的FRO細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個/mL并接種于96孔板內(nèi)，每孔加入200 μL,待細(xì)胞貼壁后按1.4的方法進(jìn)行分組處理，培養(yǎng)24 h后，4%多聚甲醛固定1 h，0.1% TritonX-100處理2 min。按照試劑盒說明書進(jìn)行細(xì)胞凋亡染色，激光共聚焦觀察、拍照、分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.8Western blot法E-cadherin和MMP-9表達(dá)檢測 取對數(shù)生長期的FRO細(xì)胞，按1.4的方法進(jìn)行分組處理，置于37 ℃、5% CO2箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，300 μL預(yù)冷的細(xì)胞裂解液處理各組細(xì)胞1 h，4 ℃下13 000 r/min離心15 min，收集上清液，采用BCA法測定蛋白濃度，按每孔50 μg上樣進(jìn)行SDS-PAGE分離蛋白，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，1%BSA，37 ℃封閉1 h，加入1∶1 000稀釋的E-cadherin和MMP-9單克隆抗體，室溫振蕩6 h，洗膜后熒光二抗避光孵育1 h，洗膜，發(fā)光。

2 結(jié) 果

2.1不同濃度去甲斑蝥素作用不同時(shí)間甲狀腺癌FRO細(xì)胞增殖抑制率 2.5,5，10，20，40，80 μg/mL的去甲斑蝥素處理FRO細(xì)胞12 h、24 h、48 h后， FRO細(xì)胞增殖抑制率均逐漸增高，具有劑量時(shí)間依賴性，見圖1。40 μg/mL的去甲斑蝥素作用24 h后，F(xiàn)RO細(xì)胞增殖抑制率為(50.21±4.98)%，達(dá)到半數(shù)致死率，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇10,20,40 μg/mL的去甲斑蝥素干預(yù)。

2.2各組甲狀腺癌FRO細(xì)胞遷移能力比較 去甲斑蝥素各組培養(yǎng)12 h和24 h后劃痕愈合率均明顯低于空白組，且隨去甲斑蝥素濃度增加劃痕愈合率逐漸降低，各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見圖2。

圖2 空白組和去甲斑蝥素各組甲狀腺癌FRO細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)愈合率

2.3各組甲狀腺癌FRO細(xì)胞侵襲能力比較 去甲斑蝥素各組培養(yǎng)24 h后，隨去甲斑蝥素濃度增加，穿過Transwell小室的細(xì)胞數(shù)逐漸減少，各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見圖3。

圖3 空白組和去甲斑蝥素各組培養(yǎng)24 h后甲狀腺癌FRO細(xì)胞穿過Transwell小室的數(shù)量

2.4各組甲狀腺癌FRO細(xì)胞周期比較 去甲斑蝥素各組培養(yǎng)24 h后，隨去甲斑蝥素濃度增加，處于G2/M期的細(xì)胞比例顯著升高，G0/G1期的細(xì)胞比例顯著降低，各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見圖4及表1。

圖4 流式細(xì)胞儀檢測空白組和去甲斑蝥素各組培養(yǎng)24 h后甲狀腺癌FRO細(xì)胞周期分布

表1 空白組和去甲斑蝥素各組培養(yǎng)24 h后甲狀腺癌FRO細(xì)胞周期分布情況

2.5各組甲狀腺癌FRO細(xì)胞凋亡率比較 去甲斑蝥素各組培養(yǎng)24 h后，隨去甲斑蝥素濃度增加，細(xì)胞凋亡率逐漸增高，各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見圖5。

圖5 空白組和去甲斑蝥素各組培養(yǎng)24 h后甲狀腺癌FRO細(xì)胞凋亡率

2.6各組甲狀腺癌FRO細(xì)胞中E-cadherin和MMP-9表達(dá)情況比較 去甲斑蝥素各組培養(yǎng)24 h后，隨去甲斑蝥素濃度增加，E-cadherin表達(dá)量明顯上調(diào)，MMP-9表達(dá)量明顯下調(diào)，各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見圖6及圖7。

圖6 空白組和去甲斑蝥素各組培養(yǎng)24 h后甲狀腺癌FRO細(xì)胞中E-cadherin和MMP-9表達(dá)情況

圖7 空白組和去甲斑蝥素各組培養(yǎng)24 h后甲狀腺癌FRO細(xì)胞中E-cadherin和MMP-9相對表達(dá)量比較

3 討 論

去甲斑蝥素是我國首先研制的人工合成的抗腫瘤藥物，不僅可以升高白細(xì)胞,還可以提高免疫系統(tǒng)的功能，臨床上主要用于消化系統(tǒng)腫瘤的治療，但其抗腫瘤作用的機(jī)制仍不明確[6]。

惡性腫瘤細(xì)胞周期和凋亡紊亂而具有永生性，遷移和侵襲能力強(qiáng)，易轉(zhuǎn)移[7]。轉(zhuǎn)移多是惡性腫瘤晚期的共有表現(xiàn)，也是導(dǎo)致患者死亡的主要原因[8]。未分化甲狀腺癌是惡性度最高的內(nèi)分泌系統(tǒng)腫瘤，病死率占甲狀腺癌的14.0%～39.0%，中位生存期不足半年，多數(shù)患者死于遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[9]。因此，在未分化甲狀腺癌治療中抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移是待解決的關(guān)鍵問題。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，去甲斑蝥素對FRO細(xì)胞生長有明顯的抑制作用，并呈時(shí)間劑量依賴性；劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，去甲斑蝥素能夠抑制FRO細(xì)胞的遷移和侵襲能力，并呈劑量依賴性；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，去甲斑蝥素使FRO細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，使進(jìn)入G1期的細(xì)胞減少；TUNEL實(shí)驗(yàn)顯示去甲斑蝥素可以促進(jìn)FRO細(xì)胞凋亡，并具有劑量依賴性。

腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力與轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)密切相關(guān)?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是依賴鋅和鈣來表達(dá)催化活性的內(nèi)源性蛋白酶家族,可以通過水解細(xì)胞外基質(zhì)中的蛋白成分，破壞細(xì)胞屏障，在腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用[10-11]。其中MMP-9屬于被糖化的分子量較大的Ⅳ型膠原酶，與腫瘤細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[12-13]。 E-cadherin是一種重要腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移抑制基因，主要表達(dá)于上皮細(xì)胞表面，在維持細(xì)胞間黏附、細(xì)胞極性及正常組織結(jié)構(gòu)中起到重要作用[14]。目前研究表明，細(xì)胞間黏附性降低是惡性腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，E-cadherin降低且表達(dá)于胞漿內(nèi)，可致細(xì)胞間黏附性降低，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移[15-16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著去甲斑蝥素濃度增高，MMP-9表達(dá)量逐漸降低，E-cadherin表達(dá)量逐漸增高。

綜上所述，去甲斑蝥素可抑制未分化甲狀腺癌細(xì)胞FRO的增殖、遷移及侵襲能力，可誘導(dǎo)FRO細(xì)胞周期發(fā)生G2/M期阻滯，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與上調(diào)轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白E-cadherin表達(dá)、下調(diào)MMP-9表達(dá)有關(guān)，但具體調(diào)節(jié)機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。