高 靜 劉曉景 陳永興 楊海花 衛(wèi)海燕

鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院 河南省兒童醫(yī)院 鄭州兒童醫(yī)院內(nèi)分泌遺傳代謝科，河南省鄭州市 450007

VLCADD屬于臨床較為罕見的脂肪酸代謝障礙性疾病，主要患病群體為嬰幼兒，屬于常染色體隱性遺傳，經(jīng)流行性病學(xué)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，該疾病發(fā)病率在歐美國家中占1/85 000。ACADVL基因(OMIM609575)是該疾病的主要編碼基因，屬于VLCAD家族，其參與脂肪酸B氧化的部位為線粒體上。疾病主要類型為遲發(fā)型、嬰兒型以及新生兒早發(fā)型。其中由感染、運動、運動不耐受以及肌無力導(dǎo)致的橫紋肌溶解為遲發(fā)型的主要表現(xiàn)；肌無力、肝大以及低酮性低血糖為嬰兒型的主要表現(xiàn)；Reye綜合征、腦病、心肌病為新生兒早發(fā)型的主要表現(xiàn)[1]。經(jīng)國外臨床研究發(fā)現(xiàn)，該疾病的臨床特異性診斷指標(biāo)為十四?；鈮A(C14：1)增加，故對該疾病的主要診斷方式為應(yīng)用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對血?；鈮A譜檢測，但國內(nèi)對該項研究仍較少。故本研究特選取近六年在河南省兒童醫(yī)院收治的7例該疾病患者的尿有機酸、血酰基肉堿譜、實驗室檢查以及臨床特點進行分析，探究該疾病的基因型與表型的相關(guān)性、實驗室檢查特點以及臨床表現(xiàn)。報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 7例患兒均來自7個不同家庭，年齡2d～14歲，男4例、女3例，父母均非近親婚配。診斷主要依靠ACADVL基因突變分析、尿氣相質(zhì)譜有機酸分析(GC-MS)及血串聯(lián)質(zhì)譜分析(LC-MS/MS)綜合分析。所有檢測的知情同意書均已被患兒及其家屬簽署。

1.2 方法 (1)所有患兒接受氣相色譜質(zhì)譜、串聯(lián)質(zhì)譜和尿常規(guī)、血碳酸氫根/陰離子間隙、血乳酸、血氨、肌酸激酶、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、血糖等常規(guī)實驗室檢查。給予所有患兒進行飲食干預(yù)，飲食應(yīng)為低脂高碳水化合物[2]。并接受避免空腹、左旋肉堿以及補充中鏈甘油三酯等治療。對患兒的尿氣相質(zhì)譜、血串聯(lián)質(zhì)譜以及各項生化指標(biāo)定期隨訪復(fù)查。(2)接受氣相色譜法尿有機酸以及酰基肉堿的串聯(lián)質(zhì)譜檢測。于專用濾紙中加入患兒剛?cè)朐簳r采取的全血，對濾紙紙片中酰基肉堿的水平應(yīng)用串聯(lián)質(zhì)譜(ABSciex，API 4000)檢測[3]。并應(yīng)用日本島津有限公司生產(chǎn)的QP2010氣相色譜對患兒的尿液中的有機酸的水平進行監(jiān)測。(3)基因突變分析：抽取患兒父母以及患兒的外周血白細胞，應(yīng)用天根生物有限公司生產(chǎn)的TIANamp血液DNA提取試劑盒將其DNA進行提取。該疾病的基因中有22個外顯子，通過Primer Premier 5.0軟件對引物進行設(shè)計。于滅菌雙蒸水中加入1.25U DreamTaqDNA聚合酶、5μl 10×DreamTaqDNA聚合酶緩沖液、1μl 10μmol/L的引物、10nmol/L的dNTPs 1μl以及200ng的基因組DNA至50μl進行擴增反應(yīng)，且所有試劑的生產(chǎn)公司均為Fermentas公司[4]。PCR反應(yīng)條件：先進行1min的95℃預(yù)變性，進行30s 95℃變性。再給予30s 54～68℃退火。在給予40s的72℃延伸，總循環(huán)為32次。再給予10min的72℃延伸。純化后，應(yīng)用上海華大基因公司生產(chǎn)的AB1377測序儀對患者的DNA進行測定，并對比GenBank人類ACADVL基因，通過DNA雙向測序進行突變外顯子片段的證實[5]。并應(yīng)用直接測序法對新錯義突變進行鑒定，并對比50例健康人，將基因多態(tài)性排除。

2 結(jié)果

2.1 血酰基肉堿譜結(jié)果分析 7例患兒均有血十四烯?；鈮A(C14：1)明顯升高,可伴有C10降低，C14、C14:2、C16等升高。見表1。

表1 血酰基肉堿譜結(jié)果分析(μmol/L)

2.2 基因型與表型的相關(guān)性、實驗室檢查特點以及臨床表現(xiàn)分析 尿氣相質(zhì)譜有機酸分析可發(fā)現(xiàn)二羧酸尿。4例為心肌病型，2例為肝型，1例為肌病型。其中3例心肌病型早期死亡，目前存活的1例心肌病型患兒是通過新生兒疾病篩查得以早期診斷和治療。7例患兒ACADVL基因突變分析示不同位點均可出現(xiàn)突變，以錯義突變?yōu)橹鳎珹CADVL基因突變譜高度異質(zhì)。見表2。

表2 基因型與表型的相關(guān)性、實驗室檢查特點以及臨床表現(xiàn)分析

3 討論

隨著氣相質(zhì)譜以及串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，遺傳代謝性疾病的診斷率得以提高。但VLCADD疾病的檢出在我國報道仍較少，這與該疾病在亞洲地區(qū)患病率較低有關(guān)，但該疾病的死亡率極高，只有通過早期診斷并給予及時有效的治療保障患兒的生命安全?，F(xiàn)本研究特通過對該疾病患兒的治療、診斷、臨床表現(xiàn)以及基因特點進行分析，對患兒的疾病特點進行探究，以找出確診疾病的有效途徑。

本研究表明，7例患兒均有血十四烯?；鈮A(C14：1)明顯升高,可伴有C10降低，C14、C14:2、C16等升高。這與只有當(dāng)游離肉堿與C14-C18?；o酶A相結(jié)合后，才可將C14-C18從線粒體內(nèi)脫離，而該疾病患者的組織中游離肉堿含量減少有關(guān)。本研究通過尿氣相質(zhì)譜有機酸分析診斷出伴有二羧酸尿癥，但如患兒伴有橫紋肌溶解或癥狀較輕，則不伴有二羧酸尿癥，故以C14：1明顯升高可作為該疾病的特

異性診斷指標(biāo)。但同時經(jīng)多項檢查發(fā)現(xiàn)，本研究中的7例患兒的實驗室檢查結(jié)果、臨床表現(xiàn)以及發(fā)病年齡均不相同，故不能通過C14：1升高程度判斷患病嚴(yán)重程度。

本研究表明，7例患兒中4例為心肌病型，2例為肝型，1例為肌病型。其中3例心肌病型早期死亡，目前存活的1例心肌病型患兒是通過新生兒疾病篩查得以早期診斷和治療。7例患兒ACADVL基因突變分析示不同位點均可出現(xiàn)突變，以錯義突變?yōu)橹?，ACADVL基因突變譜高度異質(zhì)。在不同種屬中，該疾病蛋白的氨基酸位點多為高度保守點，故當(dāng)其發(fā)生突變后，致病率較高。且通過軟件將此類突變與其對應(yīng)的野生型氨基酸的電荷特性、疏水性、功能、大小進行模型構(gòu)建發(fā)現(xiàn)，突變直接改變了蛋白的二級結(jié)構(gòu)，進而導(dǎo)致VLCAD蛋白與其他分子間的作用以及氫鍵的形成受到影響，進而導(dǎo)致疾病發(fā)生[6]。

綜上所述，需通過基因診斷、實驗室檢查以及臨床癥狀等多項檢查對ACADVL疾病進行診斷，以期通過早期診斷改善患兒預(yù)后。