肖熙鷗 林文秋 陳卓 鄒春香 金輝 鄒華芬

摘? 要：利用標(biāo)記基因追蹤病原菌在植物體內(nèi)的入侵和定殖，是研究病原菌-寄主互作的重要手段。本研究利用電轉(zhuǎn)化法將廣宿主載體pBBR1MCS2-Tac-EGFP導(dǎo)入青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）GMI1000菌株中，獲得了青枯雷爾氏菌帶綠色熒光標(biāo)記的轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)接試驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化子的抗生素抗性和綠色熒光強(qiáng)度有良好的遺傳穩(wěn)定性。pBBR1MCS2-Tac-EGFP不影響GMI1000菌株的致病力，且EGFP蛋白能夠在植物中穩(wěn)定表達(dá)。灌根法接種試驗(yàn)結(jié)果表明，病原菌在第1天即完成對(duì)根系的侵染，并在第6天擴(kuò)散至其他組織，隨后造成植株萎蔫。研究結(jié)果表明所獲轉(zhuǎn)化子可用于后續(xù)的病原菌侵染機(jī)理等方面的研究。

關(guān)鍵詞：青枯雷爾氏菌;綠色熒光標(biāo)記;侵染動(dòng)態(tài);pBBR1MCS2-Tac-EGFP載體

中圖分類號(hào)：S432.4????? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Wide-host Vector pBBR1MCS2-Tac-EGFP Suitable for the Labeling of Ralstonia solanacearum

XIAO Xiou1，2，3， LIN Wenqiu1，2， CHEN Zhuo1， ZOU Chunxiang4， JIN Hui1，2*， ZOU huafen1

1. South Subtropical Crop Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Zhanjiang， Guangdong 524091， China; 2. Key Laboratory of Tropical Fruit Biology of Ministry of Agriculture & Rural Affairs， Zhanjiang， Guangdong 524091， China; 3. College of Agronomy， Gansu Agricultural University， Lanzhou， Gansu 730070， China; 4. Guagnzhou Landscape Architecture Company， Guangzhou， Guangdong 510180， China

Abstract： It is an important method to trace the invasion and colonization of pathogens in plants by marker genes. In the present study， the wide-host vector pBBR1MCS2-Tac-EGFP was transformed into the Ralstonia solanacearum GMI1000 strains by electroporation. Then the GFP expression and the GMI1000 pathogenicity were analyzed. The GMI1000-Tac-EGFP strains emitted GFP fluorescence under the 440 nm excitation light. After the susceptible eggplant was inoculated by wild type GMI1000 and GMI1000-Tac-EGFP， there was no difference between the GMI1000 and the GMI1000-Tac-EGFP in the disease index. The result suggested that GMI1000-Tac-EGFP didnt influence the pathogenicity of GMI1000. After inoculating eggplants and potatoes by GMI1000-Tac-EGFP， the eggplant root， potato root and potato stem emitted GFP fluorescence under the 440 nm excitation light. The result suggested that GMI1000-Tac-EGFP could express EGFP in the eggplant and potato. To monitor the moment of R. solanacearum cells in potato， potato was inoculated with GMI1000-Tac-EGFP. The result showed that GMI1000-Tac-EGFP invaded the root 1 d after inoculation， spreaded to the stem 6 d after inoculation. In conclusion， the wide-host vector pBBR1MCS2-Tac-EGFP is suitable for the labeling of R. solanacearum and an important tool to trace the invasion and colonization of R. solanacearum strains in plants.

Keywords： Ralstonia solanacearum; GFP marker; infection dynamic; pBBR1MCS2-Tac-EGFP vector

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.06.027

青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）寄主范圍廣泛，能夠引起200多種植物感染青枯病[1]。青枯病是茄子和馬鈴薯等茄科作物生產(chǎn)中主要的病害之一，該病害能造成嚴(yán)重的損失，甚至可以導(dǎo)致絕收。在我國，除西藏、黑龍江和內(nèi)蒙古外，其余省份均有青枯菌的報(bào)道，尤其是在熱帶和亞熱帶地區(qū)，青枯病危害更為嚴(yán)重[2]。到目前為止，尚無有效的方法對(duì)其進(jìn)行防控。而研究青枯菌的致病機(jī)理對(duì)防控青枯病具有重要意義。利用標(biāo)記基因追蹤病原菌在植物體內(nèi)的入侵、定殖等侵染途徑，是研究病原菌致病機(jī)理的有效手段和方法[3-7]。目前在R. solanacearum中使用的標(biāo)記基因有GFP[8-10]、LUX[9， 12]和GUS[13]等。標(biāo)記基因在R. solanacearum中的表達(dá)主要有2種方式，一種是利用Tn5轉(zhuǎn)座子將外源基因定點(diǎn)插入到R. solanacearum的染色體中[14]，該方法插入的外源基因能穩(wěn)定存在于R. solanacearum染色體中，不會(huì)由于環(huán)境條件的影響而丟失，但是該方法操作較為繁瑣，且可能由于片段的插入導(dǎo)致R. solanacearum的基因功能喪失。Monteiro等[10]根據(jù)R. solanacearum演化型I和演化型II染色體序列特點(diǎn)，設(shè)計(jì)了特異引物開發(fā)了pRC系列載體，將標(biāo)記基因定點(diǎn)插入到染色體中的假基因區(qū)域，直觀地研究了R. solanacearum在馬鈴薯、番茄中的浸染途徑。第二種方法是將含有標(biāo)記基因的廣宿主質(zhì)粒轉(zhuǎn)化R. solanacearum，以游離質(zhì)粒表達(dá)標(biāo)記基因，該方法操作簡單且不會(huì)由于定點(diǎn)插入導(dǎo)致R. solanacearum的基因功能喪失[11]。但是目前報(bào)道適宜R. solanacearum的載體較少。

本研究將廣宿主載體pBBR1MCS2-Tac- EGFP通過電轉(zhuǎn)化法將其導(dǎo)入R. solanacearum中，分析pBBR1MCS2-Tac-EGFP在R. solanacearum中的穩(wěn)定性以及R. solanacearum的致病力，研究結(jié)果將為進(jìn)一步研究R. solanacearum在植物體內(nèi)的入侵、定殖提供適宜的標(biāo)記載體工具。

1? 材料與方法

1.1? 菌株

R. solanacearum菌株GMI10000（間接來源于已故法國農(nóng)科院的Philippe Prior研究員的實(shí)驗(yàn)室）。廣寄主載體pBBR1MCS2-Tac-EGFP由本實(shí)驗(yàn)保存，該質(zhì)粒在工程菌中具有卡拉霉素（kan）抗性，由Tac啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)EGFP的表達(dá)（圖1）。

1.2? pBBR1MCS2-Tac-EGFP電擊轉(zhuǎn)化及檢測

利用電轉(zhuǎn)化方法將pBBR1MCS2-Tac-EGFP轉(zhuǎn)化R. solanacearum GMI1000菌株。GMI1000感受態(tài)的制備和電轉(zhuǎn)化方法參考張治飛[13]的方法。電擊轉(zhuǎn)化后取100 μL的菌液涂布于含有50 mg/L卡拉霉素的NA固體培養(yǎng)基上（葡萄糖5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，牛肉浸膏3 g/L，瓊脂粉7 g/L），30 ℃培養(yǎng)48 h。

利用LUYOR-3415RG雙波長熒光蛋白激發(fā)光源在440 nm激發(fā)光下檢測轉(zhuǎn)化子EGFP的表達(dá)。根據(jù)EGFP最大開放閱讀框抗性基因設(shè)計(jì)引物（EGFPF：ATGAGTAAAGGAGAAGAACTTT TC，EGFPR：TTATTTGTAGAGCTCA TCCATGC C）并且委托廣州天一輝遠(yuǎn)基因科技有限公司進(jìn)行合成。PCR體系為：2×PCR Mix（康為世紀(jì)）12.5 μL，EGFPF（10 μmol/L）1 μL，EGFPR（10 μmol/L）1 μL，無菌水9.5 μL，菌液1 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán);72 ℃ 5 min，PCR產(chǎn)物電泳檢測。將陽性克隆命名為GMI1000-Tac-EGFP。

1.3? 遺傳穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

將GMI1000-Tac-EGFP轉(zhuǎn)接至不含卡拉霉素的NA培養(yǎng)基上，連續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)20次，分析pBBR1MCS2-Tac-EGFP在GMI1000的遺傳穩(wěn)定性。在第2次、第10次和第20次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)時(shí)，將GMI1000-Tac-EGFP從平板上用無菌水沖洗，懸浮至OD600=0.8左右，然后利用Tecan Spark測定熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長為535 nm，其中Gain值設(shè)定為80。

1.4? 熒光強(qiáng)度測定

將GMI1000-Tac-EGFP轉(zhuǎn)接至NA液體培養(yǎng)基中，28 ℃過夜培養(yǎng)至OD600=0.8左右，6 000 r/min離心10 min，收集菌液，用無菌水進(jìn)行重懸浮至OD600=1.0。然后用無菌水進(jìn)行4倍梯度稀釋。利用Tecan Spark測定熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長為535 nm，其中Gain值設(shè)定為80。使用Excel軟件進(jìn)行線性回歸分析。

將苗齡為20 d左右的‘隴薯7號(hào)組培苗移栽于7 cm × 7 cm的營養(yǎng)缽中，25～28 ℃培養(yǎng)20 d左右后用于人工接種GMI1000-Tac-EGFP。在接種后7 d，取馬鈴薯莖基上1 cm莖段用于R. solanacearum數(shù)量分析。將莖段在75%酒精消毒后置于0.2 mL的無菌水中浸泡1 h。取200 μL測定熒光強(qiáng)度，分析R. solanacearum的克隆數(shù)。同時(shí)取500 μL利用平板稀釋法統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，具體方法參考郜剛[15]的方法。3次生物學(xué)重復(fù)。

1.5? 致病力分析

將苗齡為20 d左右的‘隴薯7號(hào)組培苗移栽于7 cm × 7 cm的營養(yǎng)缽中，25～28 ℃培養(yǎng)20 d左右后用于人工接種。將GMI1000-Tac-EGFP和野生型GMI1000用無菌水稀釋至1×108 CFU/mL，進(jìn)行傷根接種，每株接種20 mL菌液。同時(shí)以無菌水為對(duì)照。每次處理10株，3次生物學(xué)重復(fù)。接種后置于培養(yǎng)箱，28～30 ℃光照培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)萎蔫癥狀出現(xiàn)的時(shí)間。

1.6? 利用GMI1000-Tac-EGFP分析R. solanacearum動(dòng)態(tài)侵染過程

馬鈴薯‘隴薯7號(hào)組培苗培養(yǎng)20 d后進(jìn)行接種。接種后置于培養(yǎng)箱，28～30 ℃光照培養(yǎng)。在接種后每24 h利用LUYOR-3415RG雙波長熒光蛋白激發(fā)光源在440 nm激發(fā)下檢測EGFP表達(dá)，并且拍照記錄。

2? 結(jié)果與分析

2.1? pBBR1MCS2-Tac-EGFP成功轉(zhuǎn)入GMI1000

本研究通過電轉(zhuǎn)化法成功地將pBBR1MCS2- Tac-EGFP轉(zhuǎn)入到GMI1000中。通過PCR在GMI1000-Tac-EGFP中擴(kuò)增出750 bp左右的片段，與預(yù)期大小一致，而GMI1000中未擴(kuò)增出相應(yīng)片段（圖2）。同時(shí)在LUYOR-3415RG雙波長熒光蛋白激發(fā)光源的藍(lán)光下，GMI1000-Tac-EGFP能夠發(fā)出綠色熒光，而野生型GMI1000未發(fā)出熒光（圖3）。研究結(jié)果證明pBBR1MCS2-Tac-EGFP成功轉(zhuǎn)入到GMI1000中，并且能夠在GMI1000中表達(dá)EGFP蛋白。

2.2? GMI1000-Tac-EGFP穩(wěn)定表達(dá)EGFP熒光

為進(jìn)一步分析pBBR1MCS2-Tac-EGFP在GMI1000中的遺傳穩(wěn)定性，將不同移植時(shí)間的菌液涂布于平板上，培養(yǎng)觀察綠色熒光的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在移殖培養(yǎng)2次、10次和20次后，其熒光強(qiáng)度之間差異不顯著（圖4）。結(jié)果表明，pBBR1MCS2- Tac-EGFP載體能夠在GMI1000中穩(wěn)定遺傳。

2.3? EGFP熒光值與GMI1000-Tac-EGFP數(shù)量線性相關(guān)

與平板稀釋法相比，利用EGFP熒光定量分析細(xì)菌的克隆數(shù)具有高效快捷的優(yōu)點(diǎn)。圖5結(jié)果表明，在4.0×106～1.0×109 CFU/mL的范圍內(nèi)，EGFP的熒光強(qiáng)度值與GMI1000-Tac-EGFP的數(shù) 量呈線性相關(guān)關(guān)系，R2為0.9954。當(dāng)GMI1000- Tac-EGFP稀釋至約9.0×105 CFU/mL時(shí)，EGFP熒光值接近于無菌水的熒光值，此時(shí)EGFP的熒光強(qiáng)度較弱，未能進(jìn)行有效檢測。因此在4.0×106～1.0×109 CFU/mL范圍內(nèi)，可以利用EGFP熒光值計(jì)算R. solanancearum的數(shù)量。

根據(jù)EGFP熒光值與GMI1000-Tac-EGFP數(shù)量的線性關(guān)系，統(tǒng)計(jì)得到GMI1000-Tac-EGFP數(shù)量為9.75×108 CFU/g，而平板計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)得到的數(shù)量為8.95×108 CFU/g（圖6）。雖然利用EGFP熒光值估算的GMI1000-Tac-EGFP數(shù)量大于平板計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)得到的數(shù)量，但是二者差異不顯著。因此可以利用EGFP熒光值計(jì)算R. solanancearum的數(shù)量。

2.4? pBBR1MCS2-Tac-EGFP不影響GMI1000致病力

通過致病力試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)GMI1000-Tac-EGFP和GMI1000接種馬鈴薯6 d后，葉片開始出現(xiàn)萎蔫狀（圖7），而無菌水對(duì)照葉片正常。結(jié)果表明，pBBR1MCS2-Tac-EGFP不影響GMI1000的致病力。

2.5? R. solanacearum侵染馬鈴薯動(dòng)態(tài)變化過程

通過GFP熒光能夠動(dòng)態(tài)直觀地觀察R. so

lanacearum在馬鈴薯中的動(dòng)態(tài)變化過程（圖8A）?！]薯7號(hào)接種1 d后，在其根部能觀察到微弱的熒光，證明在接種1 d后，R. solanacearum已經(jīng)進(jìn)入到馬鈴薯根部（圖8B）。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，GFP熒光強(qiáng)度越來越強(qiáng)，并且分布的部位也越來越廣，R. solanacearum在馬鈴薯植株內(nèi)不斷繁殖和擴(kuò)散。接種后第4天，在馬鈴薯的莖部檢測到GFP熒光，表明R. solanacearum已經(jīng)進(jìn)入到馬鈴薯莖部;接種后6 d整個(gè)莖均有GFP的分布，接種后7 d，葉片的葉脈也有GFP熒光，此時(shí)R. solanacearum在整個(gè)植株內(nèi)均有分布。在接種后5 d馬鈴薯的部分葉片出現(xiàn)萎蔫癥狀，接種后7 d整個(gè)植株萎蔫。這是由于R. solanacearum在馬鈴薯的維管束中大量積累，堵塞導(dǎo)管水分的運(yùn)輸，最終導(dǎo)致馬鈴薯萎蔫。

3? 討論

利用標(biāo)記基因標(biāo)記病原菌是動(dòng)態(tài)分析病原菌侵染植物過程的重要手段。由于GFP的發(fā)光不需要底物，能夠無損地觀察病原菌侵染植株的動(dòng)態(tài)變化過程，因此在多種病原菌上得到了廣泛應(yīng)用[16-19]。目前成功標(biāo)記R. solanacearum的載體有pUT gfp/luxAB載體[8]、pRC系列載體[10]、pBBR1MCS-5[11]、pH7C-PpsbA載體[13]和?RSS1載體[20]等。

本研究利用電轉(zhuǎn)化法成功將pBBR1MCS2- Tac-EGFP廣寄主載體導(dǎo)入R. solanacearum GMI1000菌株中，并且GMI1000-Tac-EGFP能夠在馬鈴薯中穩(wěn)定表達(dá)。趙志文等[11]以pBBR1MCS-5載體為骨架構(gòu)建了pBBR1MCS5- pRipAK-GFP載體，將其轉(zhuǎn)化R. solanacearum、番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌和柑橘潰瘍病菌，結(jié)果表明該載體能夠在這3種病原菌中穩(wěn)定表達(dá)。同時(shí)在熒光顯微鏡下，GMI1000-Tac-EGFP整個(gè)細(xì)胞呈現(xiàn)綠色，棒狀，近橢圓形[9， 11]。標(biāo)記基因是否影響病原菌對(duì)植物的致病力是標(biāo)記基因能否應(yīng)用于病原菌的首要條件之一。而由于馬鈴薯組培苗較為幼嫩，在植株的根和莖稈均能檢測到強(qiáng)烈GFP熒光。因此以pBBR1MCS為骨架載體適宜標(biāo)記R. solanacearum。

啟動(dòng)子對(duì)下游基因的表達(dá)起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。目前利用在R. solanacearum上使用的標(biāo)記基因主要為R. solanacearum內(nèi)源啟動(dòng)子，如RipAK、hrpG、hrpB、Exopolysaccharid等基因的啟動(dòng)

子[10-11， 21]，植物葉綠體PsbA啟動(dòng)子[9]以及細(xì)菌的lac啟動(dòng)子[11]。這些啟動(dòng)子均能驅(qū)動(dòng)標(biāo)記基因的高效表達(dá)，而其他外源啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)標(biāo)記基因在R. solanacearum中的表達(dá)尚未見報(bào)道。Tac啟動(dòng)

子是一個(gè)由lac和trp啟動(dòng)子人工構(gòu)建的雜合啟動(dòng)子，在大腸桿菌中有高效的表達(dá)效率。在本研究中，GMI1000-Tac-EGFP在培養(yǎng)基上和植物體內(nèi)均能發(fā)出顯著的GFP熒光，證明Tac在R. solanacearum中也有較強(qiáng)的啟動(dòng)活性，可以用于驅(qū)動(dòng)外源基因在R. solanacearum的表達(dá)。而這些啟動(dòng)子的表達(dá)效率的比較尚未見報(bào)道。在魚腥藻中，PsbA啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)效率與Tac啟動(dòng)子無明顯差異[22]，但是在R. solanacearum中的表達(dá)效率是否有差異有待進(jìn)一步的研究。

利用GFP標(biāo)記R. solanacearum在植物病原菌互作中得到了應(yīng)用。首先是分析R. solanacearum在浸染植物的過程。在自然條件下R. solanacearum通過傷口等侵染植株，然后通過木質(zhì)部向地上部分運(yùn)輸，并且在導(dǎo)管中大量繁殖，最終導(dǎo)致植物萎蔫[4， 12， 21]。R. solanacearum大量粘附在其根系表面，并在皮層形成浸染點(diǎn)，或者通過根尖、側(cè)根和根部傷口侵入植株根部（接種后1 d）;然后迅速進(jìn)入根部維管束組織（接種后2～3 d），并向上浸染，進(jìn)入莖部維管束組織和葉片（接種后4～5 d），導(dǎo)致馬鈴薯導(dǎo)管堵塞，最終導(dǎo)致表現(xiàn)出萎蔫（接種后6～7 d）[5， 13， 22-23]。本研究中，‘隴薯7號(hào)接種1 d后，在其根部能觀察到微弱的熒光，在接種后第4天馬鈴薯的莖部檢測到GFP熒光，第7天時(shí)葉片的葉脈也有GFP熒光，這與前人的研究結(jié)果基本一致[5， 13， 22-23]。其次是利用GFP熒光值分析病原菌的細(xì)胞數(shù)量。與傳統(tǒng)的平板稀釋法[23]、QPCR定量法[24]相比，該方法具有簡單、快捷、時(shí)間短和成本低等優(yōu)勢。本研究中，在4.0×106～1.0×109 CFU/mL范圍內(nèi)，EGFP的熒光強(qiáng)度值與GMI1000-Tac-EGFP的數(shù)量呈線性相關(guān)關(guān)系，并且熒光強(qiáng)度計(jì)數(shù)法與平板稀釋法二者計(jì)算的R. solanacearum克隆數(shù)之間差異不顯著，因此可以利用EGFP熒光值分析R. solanacearum的細(xì)胞數(shù)量。

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責(zé)任編輯：謝龍蓮